대량 검체에서 유전형 분석시 Real-time PCR법의 적용

접수일：2011년 7월 22일, 수정일：2011년 8월 12일, 승인일：2011년 8월 12일

책임저자：권 순 석 519-809 전남 화순군 화순읍 일심리 160 화순전남대학교병원 전남지역암센터

TEL: 061) 379-7720, FAX: 062) 225-8293, E-mail: [email protected]

공동책임저자：조 　덕 519-809 전남 화순군 화순읍 일심리 160 화순전남대학교병원 진단검사의학과

대량 검체에서 ABO 유전형 분석시 Real-time PCR법의 적용

조　덕¹ㆍ송혜림²ㆍ원은정¹ㆍ신동준¹ㆍ신민호² 권소영³ㆍ조남선³ㆍ신명근¹ㆍ양동욱¹ㆍ권순석²

전남대학교 의과대학 진단검사의학교실¹, 예방의학교실², 대한적십자사 혈액수혈연구원³

= Abstract =

Application of Real-Time PCR for ABO Genotyping for Large-scale Population Screening

Duck Cho¹, Hye-Rim Song², Eun-Jeong Won¹, Dong-Jun Shin¹, Min-Ho Shin², So-Yong Kwon³, Nam-Sun Cho³, Myung-Geun Shin¹, Dong-Wook Ryang¹, Sun-Seog Kweon²

Departments of Laboratory Medicine¹, Preventive Medicince², Chonnam National University Medical School, Gwangju, Blood Transfusion Research Institute, Korean Red Cross³, Seoul, Korea

Background: For large-scale population screening, the method of ABO genotyping needs to be simple, accurate and cost-effective. The real-time PCR method has been introduced and it is suitable for dealing with large numbers of specimens. In this study, we examined the ABO genotyping of 1,700 residents of Jeollanam-do for an epidemiologic study by applying the real-time PCR method.

Methods: Genomic DNA was extracted from the peripheral blood samples of 1,700 residents of Jeollanam-do between July 2004 and January 2006 and these samples were stored at −70

C. The ABO genotype in all the samples was determined by four-color real-time PCR using displacing probes and three cases that had an atypical real time PCR pattern were confirmed by direct sequencing and PCR-based cloning of exons 6&7 of the ABO gene.

Results: The genotyping results of 1,700 samples included O/O (25.6%), A/A (9.1%), A/O (29.1%), B/B (4.5%), B/O (19.8%) and A/B (11.9%), and the allele frequencies of O, A and B were 50.1%, 29.5% and 20.4%, respectively. The frequency of the O allele was lower in the residents of Jeollanam-do than that previously reported for the residents of Kangwon-do (P=0.014), while the frequency of the A allele was higher in the residents of Jeollanam-do than that previously reported for the residents of Kangwon-do (P=0.003). The three cases with atypical results were revealed to be B101/O24, B

(296C＞T)/O01 and B101/O

(801G＞T). It takes 6 days to perform ABO genotyping on 1,700 samples by a calculation per test.

Conclusion: ABO genotyping by real-time PCR using displacing probes can be useful for mass screening for ABO genotyping. In Korea, the frequency of the ABO allele was significantly different among different regions.

(Korean J Blood Transfus 2011;22:110-119)

Key words: ABO genotype, Real-time PCR, Direct DNA sequencing, Displacing probe, Fluorescence

서 론

ABO 혈액형은 수혈의학에서 가장 임상적 의 의가 큰 혈액형이다.

이들 혈액형을 결정하는 ABO 유전자는 9번 염색체 9q34에 위치하며, 1990 년대 초에 Yamamoto 등에 의해 유전자 구조가 처음으로 규명되었다. 이후 ABO 유전형 분석이 가능하게 되었고, 현재 국ㆍ내외 여러 분야에서 사용되고 있는 ABO 유전형 검사로는 대립유전자 특이중합효소연쇄반응(AS-PCR), 중합효소연쇄 반응-제한절편길이 다형성(PCR-RFLP), pyrose- quencing, real-time PCR 그리고 직접염기서열분 석법 등이 있다.

ABO 유전형검사는 혈청학적 기법으로 해결할 수 없는 ABO 불일치의 해결이나 각종 ABO 아형 을 확진 하고자 하는 경우에 가장 널리 사용되고 있다. 그 외에는 법의학 분야나 ABO 혈액형과 질 병의 연관성 연구와 같은 역학분야에 또한 사용 되고 있다. 역학분야에서 ABO 유전형 분석은 대 량의 검체를 처리해야 하므로 정확한 검사 결과 를 산출해야 할 뿐 아니라 검사가 간편해야 하며, 소요되는 시간이 길지 않고 저비용 등의 요건을 갖추어야 이상적이다.

그간 국내에서는 1,000건 이상의 대량 검체를 대상으로 ABO 유전형 검사를 시행한 연구는 없 었다. 이에 본 연구에서는 신속할 뿐 아니라 대량 검체 처리에 적합하다고 소개된 real-time PCR 법 을 전남지역 거주자의 ABO 유전형 분석에 적용 하여 보았다.

재료 및 방법

1. 대상

본 연구는 2004년 7월부터 2006년 1월 사이에

전라남도 영광과 무안 지역 주민들로부터 얻은 말초혈액에서 QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA)로 DNA 추출 후 −70

C 에서 보관하고 있던 검체를 대상으로 하였다. 또 한, real-time PCR을 검증하기 위해 엑손 6과 7의 분석으로 A102/A102, A102/O01, B101/B101, B101/

O01, O01/O02, A102/B101로 ABO 유전형을 확인 하고 혈청학적 검사를 시행한 후 냉동 보관 중이 던 각 1예씩을 포함하였다. 모든 대상자에게 유 전자 검사에 대한 서면 동의를 받았으며, 본 연구 는 전남대학교병원 생명의학연구윤리심의위원 회(IRB)의 승인을 받았다.

2. Real-time PCR 검사

Real-time PCR은 Ruan 등이 보고한 방법과 동

일하게 시행하였다.

먼저 QIAamp DNA isolation

kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 말초 혈

액 검체에서 genomic DNA를 추출하여 spectro-

photometer로 확인하였으며, 이를 Tris-HCl buffer

(10 mM, pH 8.0)로 희석하여 20 μg/mL의 농도로

맞추었다. 두 쌍의 시발체(Table 1)를 사용하여 각

각 엑손 6의 261번 부위와 엑손 7의 796번, 802번,

803번이 포함된 부위를 각각 증폭 후 4가지의 다

른 형광색을 사용하는 4개의 displacing probes들

로 A/A, A/O, B/B, B/O, A/B, O/O 6가지 ABO 유전

형을 검출하였다(Fig. 1). 각 PCR 튜브에는 25 μL

PCR 반응액과 2.5 mM MgCl

2.5 μL, 2.5 mM

dNTPs 혼합물 0.3 μL, f-Taq polymerase (Solgent,

Daejeon, Korea) 1.0 U을 포함하여 엑손 6, 7 부위

의 증폭을 위한 400 nM의 PCR 시발체 쌍을 0.2

μL씩, 각 100 nM의 probe들을 0.2 μL씩 넣었으며,

마지막으로 genomic DNA 20 ng (1 μL, 20 ng/μL)

을 넣고, 총 반응액은 증류수로 25 μL을 맞추었

다. PCR 반응은 96

C에서 2분간 그리고 나서 10

회의 touch down PCR을 96°C에서 15초간 시행하

Table 1.

　 Name Sequence

Primer

Exon 6s 5’-ACGCCTCTCTCCATGTGCAGT-3’

79 bp

Exon 6r 5’-AATGTGCCCTCCCAGACAATG-3’

Exon 7s 5’-CCAGTCCCAGGCCTACATCC-3’

106 bp

Exon 7r 5’-GTGGCAGGCCCTGGTGAG-3’

Probe

Non-O*

5’- Cy5 - T C C T C G T G G T G A C C C C T T G G - PO4 - 3'

│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ 3’- DABCYL - G G A G C A C C A C T G G G G A A C - 5’

O^†

5’- ROX - T C C T C G T G G T A C C C C T T G G C - PO4 - 3'

│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ 3’- DABCYL - G G A G C A C C A T G G G G A A C C - 5’

A

5’- FAM - C C G A A G A A C C C C C C C A G G T A - PO4 - 3'

│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ 3’- DABCYL - G C T T C T T G G G G G G G T C C A - 5’

B

5’- JOE - A C T A C A T G G G G G C G T T C T T C G - PO4 - 3'

│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ 3’- DABCYL - G A T G T A C C C C C G C A A G A A G - 5’

*Adel is renamed non-O and ^†Odel is renamed O in this study.

고 사이클 당 1

C씩을 68

C에서부터 시작하여 20 초간 감소시켜 반응시킨 후 마지막 15초간 72

C 에서 반응하였다. 그리고 95

C에서 15초, 58

C에 서 15초, 72

C에서 15초씩 40회 증폭하였다. 증폭 하는 동안 4개의 채널(FAM, JOE, ROX, and Cy5) 에서 나온 형광은 58

C의 annealing 단계에서 검 출하였다. Real-time PCR은 Rotor-Gene 3000 (Corbett Research, Mortlake, Australia)으로 실시하 였다. 사용된 primer와 probe의 염기서열은 Ruan 등이 소개한 바와 같으며 Table 1에 기재하였다.

엑손6과 7의 분석

ABO 유전자의 엑손 6과 7에 대한 분석은 Cho 등이 보고한 방법으로 시행하였는데, 간략하게 기술하면 다음과 같다.

EDTA 전혈에서 DNA를

추출하여 ABOe6F와 ABOe7R 시발체 쌍으로 엑 손 6 및 7을 포함하는 2,080 bp를 증폭하였고 시 퀀싱은 ABOe6R, ABOe7F, ABOe7SF1 및 ABOe7SF2으로 실시하였다. 염기서열분석 과정 은 형광 dNTP가 들어있는 Big dye Terminator cycle sequencing kit (Perkin Elmer/Applied Bio- systems, Foster City, CA)를 사용하여 설명서대로 PCR 증폭한 후 ABI PRISM 310 Genetic Analyser (Perkin Elmer/Applied Biosystems)로 염기서열을 자동 분석하였다. ABO 유전자의 염기서열과의 비교는 SEQUENCHER (Gene Codes Corp, Ann Arbor, USA) software를 사용하여 시행하였다.

4. 대립유전자 분리를 위한 Cloning 후 직 접염기서열분석

Real-time PCR에 전형적인 패턴을 보이지 않았

Fig. 1. Schematic illustration of the real-time PCR genotyping using displacing probes. (A) Principle for making fluorescent signals in the real-time PCR genotyping using displacing probes. In the presence of matched template, probes hybridize to the amplicons and generate fluorescence. (B) Different fluorescent curve pattern in common ABO alleles and the representative example of O/O allele and interpretative. Four different fluorophore-labeled displacing probes are added in a tube, it makes different fluorescent curve pattern according to their respective SNPs. ROX labeled probe was used to detect the G deletion at nucleotide position 261, Cy5-labeled probe was designed to detect non-O allele in exon 6. JOE-labeled probe was designed to be complementary to the B allele and FAM-labeled probe was used for detecting A allele in exon 7. (C) Genotyping results for common ABO alleles were obtained through the corresponding fluorescence combination after real-time PCR.

던 예들의 돌연변이 기원을 규명하기 위해 cloning으로 대립유전자 분리를 실시하였다.

ABOe6F와 ABOe7R 시발체 쌍으로 증폭한 2,080 bp의 증폭산물을 정제한 후 pGEM T easy vector (Promega, USA)에 ligation하고 Escherichia coli DH5α에 transformation하여 생성된 형질전환체 colony들 중 6개를 선별하여 각각 ampicillin이 함 유된 액상 LB 배지에서 진탕 배양하였다. 각각의

colony에서 증폭한 E coli를 DNA-spin plasmid DNA Purification Kit (iNtRON Biotechnology, Korea)로 plasmid DNA를 추출하여 ABOe6R 혹은 ABOe7SF1로 직접 염기서열을 분석하였다.

5. ABO 대립유전자의 분류 및 명칭

ABO 대립유전자의 종류와 명명은 혈액형 유전

자 돌연변이에 대한 web상의 자료인 blood group

Fig. 1. Continued.

antigen gene mutation database에서 인용했다.

ABO 대립유전자의 빈도가 다른 지역 간 인구 별로 차이가 있는지 알아보기 위하여 chi-square test를 이용하여 보고된 자료와 본 연구에서 얻은 결과를 통계학적으로 검증하였다.

결 과

1. ABO 유전형 및 A, B, O 대립유전자 빈도 분석

총 1,700 검체를 대상으로 ABO 유전형을 6가

지로 분류한 결과, O/O는 25.6%, A/A는 9.1%, A/O

는 29.1%, B/B는 4.5%, B/O는 19.8%, 그리고 A/B

형은 11.9%였다. 이들 유전형을 근거로 표현형을

Table 2.

Geographic region

Cho et al.

(n=169,378)

In this study (n=1,700)

Kang et al.

(n=253) Gwangju city & Jeollanam-do Jeollanam-do Kangwon-do

(No.) (%) (No.) (%) (No.) (%)

Phenotype*

O A B AB

44,003 61,854 43,465 20,056

26.0 36.5 25.7 11.8

436 648 414 202

25.6 38.1 24.4 11.9

81 77 68 27

32.0 30.4 26.9 10.7 Genotype

O/O A/A A/O B/B B/O A/B

436 154 494 77 337 202

25.6 9.1 29.1 4.5 19.8 11.9

81 13 64 11 57 27

32.0 5.1 25.3 4.3 22.5 10.7 Allele frequency^†

O A B

852 501 347

50.1 29.5 20.4

141 59 53

55.9 23.1 20.9 Significant by chi-square test (P＜0.05).

*ABO phenotypes in this study and Kang's study were deduced from genotype

Cho et al. versus this study.: O phenotype, P=0.781. A phenotype, P=0.173. B phenotype, P=0.230, AB phenotype, P=0.089 This study versus Kang et al.: O phenotype, P=0.039. A phenotype, P=0.018. B phenotype, P=0.390, AB phenotype, P=0.675

†This study versus Kang et al.: O allele frequency, P=0.014. A allele frequency, P=0.003. B allele frequency, P=0.768.

산출하면 O형은 25.6%, A형은 38.1%, B형은 24.4% 그리고 AB형은 11.9%였다. 또한, A, B, O 대립유전자의 빈도는 O 대립유전자는 50.1%, A 대립유전자는 29.5% 그리고 B 대립유전자는 20.4%였다. 위의 결과는 Kang 등이 기존에 보고 한 바와 비교하여 Table 2에 정리하였다.

부가적 으로 Cho 등이 보고한 광주 전남지역 헌혈자에서 의 ABO 표현형을 비교하였다.

2. Real-time PCR로 분석되지 않은 3예 분석

총 1,700 검체 중에서 단 3예만을 제외하고는

ABO 유전형을 판정할 수 있었고, ABO 유전형이

전형적으로 분석되지 않은 3예에 대하여 ABO 유

전자 엑손 6과 7의 직접염기서열 분석을 시행하

였다. 증례 1의 경우 엑손 6의 261delG, 엑손 7의

526G/G, 657T/T, 703A/A, 796A/A, 803C/C, 930G/A,

1096G/A로 B101/O24이었다. 증례 2는 B101/O01

과 동일한데, 다만 엑손 6의 296번 염기에 C/T

Fig. 2. Atypical results in the real-time PCR using displacing probes were solved by direct sequencing and PCR-based cloning of exons 6&7 of ABO gene. Two cases had single nucleotide polymorphism (SNP) in the area that primers or probes are attaching. Another case was B101/O24 that were shown identical sequences in where its probe is attaching, not shown in this figure.

heterozygote peak이 있었다. 증례 3은 B101/O01과 동일한데, 엑손 7의 801번 염기에 T/G hetero- zygote peak이 있었다(Fig. 2). Heterozygote peak의 기원을 규명하기 위해 시행한 cloning 결과, 증례 2는 296C＞T를 갖는 Bvar 대립유전자였고, 증례 3은 801G＞T를 갖는 Ovar 대립유전자였다.

3. 분석에 소요된 시간

1회의 real-time PCR에 의한 ABO 유전형 분석 은 real-time PCR 시행시간(92분) 및 분석 전 준비, 분석 시간을 포함하여 약 2시간이 소요되었다.

그런데, 1회에 72개 샘플을 분석할 수 있으므로 하루 8시간의 작업 기준으로 계산하여 보면, 1,700 검체를 검사하는데 소요되는 시간은 약 6 일이었다.

고 찰

본 연구에서는 Ruan 등에 의해 보고된 방법과

동일하게 real-time PCR법에 의한 ABO 유전형 검

사를 구축하고 1,700개의 대량 검체에 본 기법을

적용하였다.

본 연구에서 적용한 real-time PCR

법은 displacing probe를 이용하였는데, 이는 정확 하고 신속하여 최근 ABO 혈액형 유전자 뿐만 아니라 여러 분야에서 SNP을 검출하는데 활발 하게 이용되는 추세이다.

순방향 가닥의 5’

말단에는 각기 다른 형광물질(fluorophore)로 표 지되어 있으며, 역방향 가닥의 3’ 말단에는 형광 물질과 반응하는 quancher가 붙어 있다. 이 probe 는 짝지어지는 가닥에 따라 각기 다른 열역학적 에너지 수준을 취하게 되며, matched target과 짝 을 형성할 때 가장 안정된 상태에 이르도록, mis- matched target과는 불안정한 상태를 갖도록 고안 되어 있고 자가결합(self-annealing)한 원래의 상태 는 그 중간 에너지 수준을 갖게 된다. 따라서 matched target과 짝을 형성하지 않는다면, 형광물 질이 표지된 가닥과 quancher가 붙은 가닥이 서로 결합하여(self-annealing) 형광을 띄지 않게 된다.

본 연구에서 사용한 방법은 A, B, O 대립유전자 간의 구별점이 되는 엑손 6의 261번, 엑손 7의 796번, 803번 염기의 변형을 통해 해당 대립유전 자에 특이한 probe를 만들었다.

본 연구에서는 1,700개의 대량 검체에 적용하 기에 앞서 Ruan 등이 보고한 방법을 검증하기 위 해 표현형과 함께 엑손 6과 7의 분석으로 A102/

A102, A102/O01, B101/B101, B101/O01, O01/O02, A102/B101로 ABO 유전형을 확진했던 각 유형의 검체 1예씩을 real-time PCR법으로 검사하여 모두 일치함을 확인하였다(자료 미제시).

본 실험실에서 검증한 displacing probe를 활용 한 real-time PCR법을 활용하여 1,700개의 검체를 대상으로 ABO 유전형 검사를 실시하였다. ABO 대립유전자의 빈도는 O 대립유전자는 50.1%, A 대립유전자는 29.5% 그리고 B 대립유전자는 20.4%로, Kang 등이 보고한 결과와는 O 대립유전 자와 A 대립유전자의 빈도의 유의한 차이가 있 음을 확인할 수 있었다

(O allele; P value=0.014,

A allele; P value=0.003) (Table 2). 이러한 유의한 차이는 표현형을 기준으로 분석하여도 O형과 A 형은 두 지역간에 차이가 있음을 보여주었다(O phenotype, P=0.039. A phenotype, P=0.018. B phenotype, P=0.390, AB phenotype, P=0.675). 하지 만, Cho 등이 광주ㆍ전남지역 헌혈자를 대상으로 보고한 결과와 본 연구에서 대상으로 삼은 영광 과 무안 지역민에서 얻은 A형, B형, O형, AB형 모두에서 의미있는 차이가 없었다.

이러한 결 과는 우리나라 사람들은 비록 동일한 인종에서 기원하였지만 혈액형의 분포는 지역마다 다름을 시사하였다.

한편, 1,700명의 검체를 real-time PCR로 ABO 유전형을 분석하였는데, 3개의 예는 전형적인 6 가지 유전형 즉, A/A, A/O, B/B, B/O, O/O, A/B 형 중의 하나로 분석되지 않았다. 정확한 원인분석 을 위해 ABO 유전자의 엑손 6과 7에 대한 직접염 기서열분석을 추가로 실시하여, 증례 1은 B101/

O24로 확인되었다. Real-time PCR법으로 증례 1

이 검출되지 않은 이유는 O24 대립유전자는 엑손

6은 O01과 동일하며 엑손 7은 930A＞G, 1096A＞G

을 제외하고는 B101과 동일한 염기서열을 갖기

때문이다. 즉, 엑손 7 부위는 A 또는 O 대립유전

자를 검출할 수 있게 고안되었기 때문에 엑손 7

에서 B 대립유전자를 갖는 O24는 A FAM 채널에

서 형광 신호를 보이지 않은 것으로 설명할 수 있

었다. 증례 2는 유전자검사 결과 B101/O01과 동

일하나, 엑손 6의 296번 염기에 C/T heterozygote

peak이 있었다. 이러한 변이(296C＞T)가 어떤 대

립유전자에서 기원했는가를 증명하기 위해 clon-

ing을 실시한 후 직접염기서열 분석을 실시하여

296C＞T이 B 대립유전자에서 기원함을 확인하

였다. 따라서, 증례 2는 B

(296C＞T)/O01로 확인

되었다. 이 위치의 변이는 primer Exon 6r이 붙는

부위에 포함해 있어 296번 염기치환으로 인해

PCR 과정이 잘 이뤄지지 않았기 때문으로 해석 되었다. 마지막으로 증례 3은 유전자검사 결과 B101/O01과 동일한데, 엑손 7의 801번 염기에 T/G heterozygote peak이 있었다. Cloning 후 직접 염기서열로 확인한 결과 801 G＞T는 O 대립유전 자에서 기원함을 확인할 수 있어 B101/O

(801 G＞T)로 최종 규명되었다. 801번 염기 위치 역시, A FAM, B JOE probe가 붙는 위치에 속해 있어 801번 염기치환으로 인해 probe 결합이 잘 이뤄 지지 않았을 것으로 추정되었다(Fig. 2).

1,700 검체에 대한 real-time PCR에 의한 ABO 유전형 분석 시간을 산출한 결과 약 6일이 소요 됨을 예측할 수 있었다. 이는 PCR-SSP를 이용한 ABO 유전자 검사의 경우 real-time PCR과 유사하 게 237 검체를 검사하는데 1주일이 소요되었다는 보고와 비교할 때 보다 신속한 검사 방법이라고 할 수 있겠다.

이는 real-time PCR법은 전기 영동을 하는 단계가 없는 것이 신속한 검사를 하 는데 기여했을 것으로 판단된다. 이처럼 신속한 real-time PCR 법에 의해 대량의 검체에 ABO 유전 형 검사를 실시하여, ABO 혈액형에 따라 위암, 헬리코박터 감염 등의 유병률에 차이가 있다고 보고하였다.

이와 같이 ABO 혈액형의 대립유 전자와 질병의 연관성을 연구할 경우, 본 연구의 결과를 근거하면 한국인의 경우에 거주 지역에 따라 ABO 대립유전자 빈도가 다르므로 동일 지 역이 아닌 곳에 대조군을 설정할 경우 오류를 초 래할 가능성이 있음에 주의해야 할 것이다.

요 약

배경: 대량의 검체를 처리해야 하는 역학분야 에서 ABO 유전형 검사는 정확할 뿐 아니라 간편 하고 신속하며 비용이 적게 들어야 이상적이다.

대량 검체 처리에 적합하다고 소개된 real-time

PCR을 활용하여 역학조사를 하고자 전남지역 거 주자 1,700 검체를 대상으로 ABO 유전형을 분석 하고자 하였다.

방법: 본 연구는 2004년 7월부터 2006년 1월 사 이에 전라남도 지역 주민들로부터 얻은 DNA 추 출 후 −70

C에서 보관하고 있던 검체 1,700개를 대상으로 하였다. ABO 유전형 검사는 4개의 형광 물질을 사용한 displacing probe를 이용한 real-time PCR법을 이용하였고, 비 전형적인 유형을 보인 3 검체는 엑손(exon) 6과 7의 직접염기서열 분석 법과 클로닝법으로 확인하였다.

결과: 1,700개의 검체를 대상으로 실시한 ABO 유전자 검사 결과, O/O는 25.6%, A/A는 9.1%, A/O 는 29.1%, B/B는 4.5%, B/O는 19.8%, 그리고 A/B 형은 11.9%였으며, ABO 대립유전자의 빈도는 O 대립유전자는 50.1%, A 대립유전자는 29.5% 그 리고 B 대립유전자는 20.4%를 보여 기존에 강원 도민을 대상으로 하여 보고된 것과 O 대립유전 자는 더 낮고(P=0.014), A 대립유전자는 더 높은 빈도를 보였다(P=0.003). 총 1,700 검체 중에서 3 예는 real-time PCR법으로 ABO 유전형을 판정할 수 없었으며, 엑손 6과 7의 직접염기서열분석법 과 클로닝법에 의해 B101/O24 1예, 엑손 6의 296C/T를 가진 B

/O01 1예, 엑손 7의 801T/G를 가진 B101/O

1예를 확인하였다. 단일 검체의 측 정시간을 근거로 산출한 Real- time PCR에 의한 1,700 검체의 분석시간은 약 6일로 추정되었다.

결론: Displacing probe를 이용한 real-time PCR 법에 의한 ABO 유전형검사는 대량검체 처리에 유용할 것으로 사료되었고, ABO 대립유전자의 빈도는 국내에서도 지역마다 다름을 확인하였다.

감사의 글

본 연구를 위하여 수고하여 주신 화순전남대

학교병원 황유미, 정성두 선생님께 감사드립니다.

참고문헌

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