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통신저자：윤 택 림
전남 화순군 화순읍 일심리 160 화순전남대병원 관절센터
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*본 연구는 산업자원부 지방기술혁신사업(RTI04-03-03) 지원으로 수행되었음.
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Center for Joint Disease, Chonnam National University Hwasun Hospital, 160, Ilsim-ri, Hwasun-eup, Hwasun-gun, Jeonnam 519-809, Korea Tel: +82.61-379-7676, Fax: +82.61-379-7681
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다양한 기질에서 골수 중간엽 줄기세포의 3차원 배양 및 생체이식에 의한 골형성능
이청송․윤택림․김형근․노윤정․정은정
전남대학교 의과대학 정형외과학교실, 화순전남대학교병원 관절센터
Three-dimensional Culture of Bone Marrow Derived Mesenchymal Stem Cells on Several Scaffolds and Osteogenic Potential
of Cell-Scaffold Composite in Vivo
Qing Song Li, M.D., Taek Rim Yoon, M.D., Hyung Keun Kim, Ph.D., Yoon Jung Roh, M.S., and Eun Jung Jung, M.S.
Department of Orthopaedics, Chonnam National University School of Medicine, Gwangju, Center for Joint Disease, Chonnam National University Hwasun Hospital, Jeonnam, Korea
P u rp o s e : To determine the in vivo bone formation on an osteoblastic cells-scaffold composite and the best scaffold for bone form ation. This study focused on the three-dim ensional culture of osteoblastic cells using various tissue-engineered scaffolds and com pared the suitability of those scaffolds.
M a te ria ls a n d M e th o d s : Mesenchymal stem cells were harvested from New Zealand white rabbits and were differentiated into osteoblastic cells. The expression of osteogenic proteins in osteoblastic cells w as observed by RT-PCR and a phase of m ineralization w as checked using von Kossa staining. In addition, three-dim ensional cultured osteoblastic cells-scaffolds com posites using a variable scaffold w ere observed by scanning electron m icroscopy. The cell-scaffold com posites were transplanted into athym ic nude m ice. X-ray, a histochem ical study, and im m unohistochem istry were used to evaluate the in vivo bone form ation.
R e s u lts : The mesenchymal stem cells proliferated quite well in the early phase and differentiated into osteoblastic cells by an inducing substance. The osteoblastic cells were observed as spindle and polygonal shapes and were m ineralized. Expression of the osteoblastic proteins was observed continuously after 2-3 weeks. The am ount of osteocalcin secretion increased for 6-7 w eeks. The osteoblastic cells adhered m ore to the hum an and porcine bone than to the hydroxyapatite-scaffold.
In the case of the PLGA scaffold, the cells proliferated and form ed a net-like structure but did not adhere w ell. No Living cells w ere observed in the calcium alginate scaffold. How ever, after the in vivo transplant, abundant cells and new tissue were observed within the hum an bone, porcine bone, hydroxyapatite, and PLG A but not w ithin the calcium alginate scaffold.
C o n c lu s io n : In the three-dimensional cultures, natural bone was found to be a more effective and suitable scaffold for cell culture than the various synthetic polym ers.
K e y W o rd s : Mesenchymal stem cell, Scaffolds, Osteogenesis, Osteocalcin
서 론
선천적인 골형성부전증, 교통사고 및 여러 가지 재해 에 의한 골 손상, 감염이나 암 등에 의한 골 결손, 노화 혹은 기타 원인에 의한 뼈의 위축 등은 모두 심한 장애나 기형을 일으킨다. 이에 대한 효과적인 치료를 위한 골 조 직 재건을 위해 조직공학적으로 골 대치물을 생성하는 새 로운 시도가 활발히 진행되고 있다8). 골 조직공학의 기본 원리와 방법은 체외배양을 통해 증식 및 분화, 유도시킨 골형성세포를 생체적합성이 좋고 생체에서 흡수될 수 있 는 지지체에 부착하여 만들어진 세포-지지체 복합물을 다시 생체이식하여 지지체가 흡수되는 과정에서 세포가 새로운 골 조직을 형성시킴으로써 골 결손을 치유하는 것 이다1). 이러한 방법의 골 조직 재건을 위해서는 골전구세 포, 지지체와 골유도 성장인자 등 다양한 조건들에 대한 연구가 필요하며10), 그중에서 세포, 지지체 및 세포와 지 지체간의 생체적합성에 대한 연구가 골 조직공학에서의 기본적인 문제이다5).
현재 골조직공학에 이용되고 있는 세포에는 골아세포, 배아줄기세포, 성체 줄기세포 등이 있으나4), 가장 많은 연구가 진행되고 있고 효과적인 것은 골수유래 줄기세포 이다16). 그러나 골수 중의 미분화 중간엽 줄기세포는 그 양이 극히 적어 골수세포의 0.001-0.01%밖에 되지 않으 므로6) 골 조직공학에 적용하려면 골수 중에서 중간엽 줄 기세포만을 분리 배양하여 증식 분화시켜 세포의 양을 늘 려야 한다. 따라서 골아세포로의 분화 유도 물질에 대해 서도 많은 연구가 진행되었는데 dexamethasone, vi- tamin C, gylcerophosphate, vitamin D3, basic fibro- blast growth factor (bFGF), bone morphogenic pro- tein (BMP), transforming growth factor-β (TGF- β) 등이 골형성 분화 유도에 관여함이 보고되었다7). 현재 골조직공학에서 많이 연구되고 있는 지지체에는 천연골, 교원질, 산호, tricalciumphosphate (TCP), hy- droxyapatite (HA), polylactic acid (PLA), polyglyc- olic acid (PGA), PLA와 PGA의 복합물인 poly L-lac- tic-co-glycolic acids (PLGA) 그리고 여러 지지체들의 복합물 등이 있다11,13). 골 조직공학에 이용되는 이러한 지지체들은 생체적합성이 좋아 체외 배양 시 세포독성이 없어야 하며 생체이식 후 면역거부반응이 없어야 하고, 삼차원적 구조를 가지고 있어 세포가 부착 증식할 수 있 는 공간이 있어야 하며, 표면활성이 좋아야 하고, 생분해
성이 있어야 하며, 가소성이 있고, 일정한 기계적 강도가 있어야 하는 등 여러 요구조건이 부합되어야 한다1). 본 연구에서는 세포적합성이라는 의미에서 현재 다양 하게 사용되고 있는 천연 및 합성 고분자 지지체의 종류 에 따른 세포-지지체 간의 상호작용을 분석하고자 하였다.
대상 및 방법
1. 가토 골수에서의 미분화 중간엽 줄기세포의 분리 배양
생후 2-3개월의 2.5-3 kg 크기의 건강한 가토 10마 리로부터 골수를 채취하였다. 헤파린이 들어있는 주사기 로 골수를 4 ml 채취하여 동일한 양의 하트만용액에 희석 한 후 1.077±0.001 g/ml 농도의 polysucrose 용액 3 ml에 조심스럽게 올려놓는다. 그리고 1,500 rpm에서 20 분간 원심 분리하여 단핵세포층을 분리하고 적혈구 용혈 완충액을 처리하여 세포의 수율을 증가시켰다. 세척 후 10% fetal bovine serum (FBS) (Gibco)과 항생제가 포 함된 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) (Gibco)에 부유시켜 37oC, 5% CO2 배양기에서 배양하였 다. 3-5일간 배양 후 부유해서 자라는 조혈모세포군은 제거하고 바닥에 부착되어 있는 미분화 중간엽 줄기세포 만을 선택하여 지속적으로 배양하였다. 그 후 배양액은 2-3일에 한번씩 갈아주었다. 2주 후 세포가 80-90%로 증식하면 trypsin/EDTA를 처리하여 세포를 새로운 플라 스크에 옮겨 지속 배양하였다. 미분화 중간엽 줄기세포의 골아세포로 분화를 유도하기 위하여 계대배양 제2대 세포 에 10 nM dexamethasone, 10 mM β-glycerophos- phate, 50μg/ml L-ascorbic acid를 첨가하였다5).
2. 형태학적 연구
배양 중인 세포는 배양초기 단계부터 일정한 간격으로 위상차현미경(Olympus, Japan)을 이용하여 세포의 성 장, 증식과 세포구조의 형태학적인 변화를 관찰하였다.
또한 슬라이드 표본을 만들어 hematoxylin & Eosin Y (H&E) 염색을 실행하였다. 그리고 세포의 석회화를 관찰 하기 위하여 von Kossa 염색을 실시하였다. 광학현미경 을 이용하여 세포의 석회화 정도를 관찰하였다.
3. 역전사 중합효소 반응을 이용한 mRNA의 발현 골아세포에 의해 생기는 osteocalcin, osteopontin,
osteonectin, type I collagen, alkaline phosphatase (ALP)의 mRNA발현을 통하여 골아세포로의 분화여부를 확인하였다9). 배양한 세포를 TRIzol용액을 이용하여 total RNA를 분리하였다. 분리된 1μg의 total RNA에 M-MLV 역전사효소를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 중 합효소연쇄반응은 1μl의 cDNA, 0.2μM의 각 primer, 1×PCR buffer, 10 mM dNTP mix와 1 unit Taq pol- ymerase를 혼합하여 총 50μl의 반응액을 PCR system (GenAmp PCR System 9600, Perkin Elmer)에서 시행 하였다. 증폭 프로그램은 95oC에서 5분간 전 처리한 후 94oC에서 15초, 60oC에서 15초 동안 결합반응을 유도하 여 72oC에서 30초 동안 연장반응이 일어나도록 하고 마 지막으로 72oC에서 10분 동안 post-extension을 시행 하였다. 각각의 반응조건으로 β-actin은 25회, osteo- calcin, osteopontin, osteonectin, type I collagen, ALP에 대해서는 30회 반응시켰다. 중합효소반응 생성물 은 1.8% 아가로우스 겔에 전기영동한 후 ethidium bro- mide로 염색하여 확인하였다.
4. ELISA를 이용한 osteocalcin의 정량
세포의 증식에 따른 골아세포의 특징 단백질 마커인 osteocalcin의 생성을 osteocalcin EIA Kit (Takara, Japan)를 이용하여 정량하였다35). 2주 간격으로 2×105 개의 세포를 48시간 동안 배양한 후 세포배양 상청액을 수집하였다. 수집한 상청액을 mouse monoclonal anti- Gla-osteocalcin 항체가 코팅된 plate에 첨가한 후 2시 간 동안 상온에서 배양하였다. 완충용액으로 세척 후 peroxidase가 표지된 2차 항체를 부착하고 1시간 동안 상온에서 배양한 후 세척을 하고 기질을 첨가하여 발색을 유도하였다. 최종적으로 1 N H2SO4를 첨가하여 반응을 정지시키고, 신속하게 ELISA plate reader를 통하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 본 실험은 3회 반복 시행하였다.
5. 세포-지지체의 3차원 배양
본 연구에서는 세포 지지체용 담체로 초저온 냉동 멸균 처리한 사람뼈, 인제대학교에서 제조 가공된 돼지뼈, KIST에서 합성한 PLGA 지지체, 상품화된 HA 지지체, 그 리고 아주대학교에서 합성한 칼슘알긴산염 지지체를 사용 하였다. 실험 전 모든 지지체는 ethylene oxide 가스로
60oC에서 18시간 동안 멸균하였다. 세포배양 지지체는 0.5×0.5×0.2 cm로 가공하여, 실험 전 미리 세포 배양액 에 넣어두어 지지체 내부에까지 배지가 침투하도록 하였 다. 6-well plate에 지지체를 넣고 미분화 중간엽 줄기세 포를 5×105개씩 분주하였으며 0.4% trypane blue 염색 법을 이용하여 세포 수를 측정하였다. 37oC, 5% CO2의 배양기에서 3시간 동안 배양하여 세포의 부착을 유도한 후 분화 유도물질을 첨가한 배지를 넣어주고 7일간 지속 배양하였다. 세포배양액은 3-4일마다 교체하였다.
6. 주사전자현미경을 이용한 세포의 부착 및 증식 관찰 세포-지지체 복합체는 배양 7일째에 무혈청 배지로 3 차례 세척하여 2% glutaraldehyde와 2% paraformal- dehyde가 포함된 0.05 M cacodylate buffer (pH 7.2) 에 4oC에서 2시간 고정하고 0.2 M sodium cacodylate buffer (pH 7.2)로 반복 세척한 후 1% osmium tetrox- ide에 1시간 처리하였다. 에탄올로 단계적으로 탈수한 후 임계점건조법(critical point drying technique)으로 완전히 건조한 후 30 nm 금입자를 이용하여 코팅하고 주사전자현미경(Jeol JSM-35, Japan)을 이용하여 지지 체 내에서 세포의 부착 및 증식을 관찰하였다.
7. 세포-지지체 복합체의 생체 내 이식
본 연구에는 생후 4개월 된 누드마우스를 이용하였다.
누드마우스를 게로란((주)일동제약)을 이용하여 흡입 마 취시킨 후 수술부위를 포타딘으로 소독하고 등부위에 0.5 cm의 절개부를 만들어 7일간 배양한 세포-지지체 복합체를 이식하였다. 실험기간 동안 누드마우스는 항온 항습 장치에서 사육하였다.
8. 형광염색을 통한 생체 내 세포 생존 가능성의 분석 분리 배양한 골아세포가 생체 내에서 생존이 가능한지, 또한 신생 조직이 이식된 세포에서 기인하여 형성된 것인 지를 관찰하기 위하여 세포에 형광물질인 PKH26을 염색 하여 PLGA 지지체에 3차원 배양을 실시하였다. 이렇게 형성된 세포-지지체 복합체를 누드마우스에 이식한 후 4주가 지난 후에 이식 조직을 고정하여 형광현미경(Ni- kon, Japan)으로 관찰하였다.
9. 방사선학적 검사
세포-지지체 복합체가 이식된 누드마우스는 2주 간격 으로 방사선 검사를 하여 생체 내에서의 골 형성 여부를 관찰하였다.
10. 면역조직화학염색
세포-지지체 복합체 생체 이식 후 골 형성을 검증하기 위하여 골아세포의 특이적 단백질인 osteocalcin을 면역 조직화학염색을 실행하였다. 채취한 조직은 10% 중성 포 르말린에 고정한 후 파라핀을 이용하여 파라핀 블록을 제 작한 후 4μm 두께로 잘라서 Probe-on Plus slide (Fi- sher Scientific, USA)에 부착시키고 충분히 건조시켰 다. 파라핀 절편은 탈파라핀과 탈수과정을 거친 후 Au- toblocker (Research Genetics, USA)로 내재성 per- oxidase를 억제시켰다. 면역조직화학적 염색상 관찰될 수 있는 비특이적인 항원 항체 반응을 억제하기 위하여 일차 항체를 부착시키기 전에 protein blocker (Re- search Genetics, USA)로 45oC에서 3분간 반응시켰다.
일차 항체인 osteocalcin에 대한 항체는 1：200으로 희석 하여 실온에서 2시간 동안 반응시키고, 완충액으로 씻은 후 이차 항체인 biotin이 부착된 anti-mouse IgG (Sig- ma, USA)에 45oC에서 7분간 반응시켰다. 검출계는 strep- tavidin이 부착된 horseradish peroxidase (SRT-HRP) 를 이용하였는데, 45oC에서 7분간 반응시켰고 완충액으 로 씻은 후 발색시켰다. 양성반응을 관찰하기 위한 발색 제는 diaminobenzidine을 이용하였다. 발색반응이 끝난 다음 양성 반응은 hematoxylin으로 대조 염색을 시행한 후 Universal Mount (Research Genetics, USA)로 봉 입하여 관찰하였다.
결 과
1. 생체 외 환경에서 골수 중간엽 줄기세포의 골형성능 골아세포의 특이 단백질인 osetocalcin, osteonectin, osteopontin, type I collagen 및 ALP의 발현을 관찰하 기 위하여 역전사 중합 효소반응을 시행하였다. 배양초기 인 2주에 type I collagen, osteonectin, osteopontin, ALP의 발현이 관찰되었으나, osteocalcin은 3주 이상의 장기배양에서 발현이 관찰되었다. 세포의 장기적인 배양 (7-8주)에서는 모든 단백질의 발현이 관찰되었다(Fig.
1). 배양시간에 따라 세포에 의해 생성되는 osteocalcin
의 양은 5주까지 증가하는 양상을 나타내었으나 그 변화 정도는 크지 않았다. 5주부터 7주 사이에는 급격한 증가 세를 보였으며, 8주째에 다시 급격히 감소하여 장기배양 에서는 더 이상 증가하는 양상을 보이지 않았다.
2. 지지체에서의 세포의 부착 및 증식 - 세포의 3차원 배양
생체 외 환경에서 세포-돼지뼈 지지체 복합체를 H&E 염색한 결과, 세포는 지지체에 잘 부착하였으며, 지지체 중앙내부에까지 침투되어 고루 분포되었으며 증식이 이루 어지고 있었다. 하지만 골형성의 양상은 관찰되지 않았다.
세포-사람뼈 복합체에서의 세포의 형태를 주사전자현 미경을 이용하여 관찰한 결과 방추형의 모양을 나타내었 고, 사람 뼈는 배양한 세포로 고루 덮여 있어 우수한 세포 지지체의 역할을 하고 있음을 확인하였다(Fig. 2A). 세포 -돼지뼈 복합체에서는 세포가 돼지뼈에 존재하는 내공 사이에 풍부하게 부착하여 자라나고 있었으며 세포의 형 태도 다각형의 모양을 나타내고 있어 세포가 전체적으로 건강하고 균일한 양상을 보였다(Fig. 2B). 세포-HA 복 합체에서 세포의 양은 사람뼈나 돼지뼈에 비하여 다소 적 었으며, 세포는 대부분 방추형의 모양이었으며, 일부는 원형으로 비교적 균일하지 않은 양상을 나타내었다(Fig.
2C). 세포-PLGA 복합체에서 세포는 지지체 주변에 거 Fig. 1. Expression of the osteogenic protein by RT-PCR.
미줄처럼 풍부하게 자라나고 있었지만, 이들 세포는 지지 체의 표면에 밀착하기보다는 내공 사이에 그물망을 형성 하며 증식하고 있는 것으로 관찰되었다(Fig. 2D). 세포- 칼슘알긴산염 복합체에서는 지지체가 세포배양액에서 신속하게 분해되어 지지체 자체의 pore를 관찰할 수 없 었으며, 세포는 증식하지 못하였고 괴사 및 고사된 세포 잔여물만 확인되었다(Fig. 2E).
3. 생체 내에서 세포-지지체 복합체의 골형성 생체이식 후 세포가 잘 부착하여 증식하는지를 알아보 기 위하여 형광 염색을 한 결과 잘 부착하여 증식하고 있 음을 형광물질의 발광을 통해 관찰할 수 있었으며, 이식 한 주변부에서 중심부보다 더 많은 형광물질의 발현이 관 찰되었다. 이로써 이식된 골아세포가 생체 내에서 사멸하
지 않고 4주까지 잘 증식하고 있음을 알 수 있었다(Fig. 3).
방사선 검사상 세포-사람뼈, 세포-돼지뼈, 세포-HA 복합체는 비슷한 모양이었는데, 시간의 진행에 따른 석회 화의 변화를 관찰할 수는 없었으나, 이식된 조직이 주변 조직에 점차 융합되고 있음을 관찰하였다(Fig. 4A). 세포- PLGA 복합체에서는 뼈 조직과 유사한 골 조직의 음영이 나타나지 않았으며 점차 생분해되어 4주에 이르러서는 주변 조직과의 뚜렷한 차이를 관찰할 수 없었다(Fig.
4B). 세포-칼슘알긴산염 복합체는 이식 직후 칼슘에 의 한 hard tissue 음영이 미약하게 관찰되었으나, 시간이 지나면서 주변 조직에 흡수되어 뚜렷한 이식 부위의 석회 화 및 골 형성여부를 관찰할 수 없었다(Fig. 4C). 4주 동 안의 이식기간에 세포-지지체 복합체를 통한 신생 골 조 직의 형성을 유도할 수 없었다.
Fig. 2. Scanning electron mi- croscopy image shows the cell- scaffolds complex. (A) Cell- hu- man bone complex structure.
(B) Cell-porcine bone complex structure. (C) Cell-hydroxyapa- tite complex structure. (D) Cell- PLGA complex structure. (E) Cell-calcium alginate complex structure.
A
B C
D E
생체 내 이식된 세포-지지체 복합체의 H&E 염색 결과 지지체에 따라 다소 차이를 보였다. 세포-사람뼈와 세포- 돼지뼈 복합체를 이식한 결과 이식 부위 전체적으로 풍부
한 세포가 존재하고 있었으며, 신생조직이 활발하게 형성 되었다. 4주간의 실험기간에 이식 부위의 석회화를 관찰 할 수는 없었으나, 지지체와 세포의 부착면에 풍부하게
Fig. 3. The immunofluores- cence shows the in vivo dis- tribution of transplanted cells (×10).
Peripheral side Central area
10 10
10 10
Fig. 4. The X-ray shows trans- planted cell-scaffolds complex.
(A) The transplanted cells in human bone show hard bone tissue. (B) The transplanted cells in PLGA does not show bone tissue. (C) The trans- planted cells in the calcium alginate does not show bone tissue.
A
B
C
PO 2 w 4 w
PO 2 w 4 w
PO 2 w 4 w
존재하는 세포로 인한 신생 미숙골이 관찰되었다(Fig.
5A). 세포-HA 복합체를 이식한 경우 HA와 세포의 경계 면에 뚜렷한 분리가 나타났으며, 세포 분포 부위와 섬유 아조직 등이 복잡하고 불규칙적으로 존재하고 있었다 (Fig. 5B). 세포-PLGA 복합체를 이식한 경우에는 풍부 한 세포가 이식부위에 분포하여 새로운 조직이 생성되고 있었으며, 또한 PLGA 지지체는 생체 내에서 서서히 분 해되어 신생 조직으로 대체되고 있었다(Fig. 5C). 세포- 칼슘알긴산염 복합체를 이식한 경우에는 적은 양의 세포 와 칼슘결정체를 관찰할 수 있었다. 그러나 다른 지지체 에 비하여 상대적으로 적은 양의 세포가 관찰되었으며, 신생 조직의 분포도 낮았다. 또한 알긴산염 성분이 점차 적으로 분해되고 있었으나 이 부위가 PLGA에서처럼 신 생 조직으로 대체되는 양상은 관찰되지 않았다(Fig. 5D).
골모세포의 특이적 단백질인 osteocalcin에 대하여 면역
Fig. 5. The H&E staining of tissues four weeks after the transplant. (A) Many of the transplanted cells adhered to the cell- human bone complex (×40, ×100). (B) The transplanted cells adhered to the cell-hydroxyapatite complex (×40, ×100).
(C) The transplanted cells produced the new bone tissue in the cell-PLGA complex (×40, ×100). (D) Few of the transplanted cells adhered to the cell-calcium alginate (×40, ×100).
100
40 100
40
40 A
B
C
D
Fig. 6. The immunohistochemistry of osteocalcin show cell-hu- man bone chip complex (A), but does not show cell-calcium alginate (B).
40
40
A
B
조직화학염색 결과 세포와 사람뼈, 돼지뼈, HA, PLGA 등 지지체의 복합체에서는 면역조직화학염색이 양성을 나타내었으나 세포-칼슘알긴산염 복합체에서는 세포가 관찰되지 않고 있으며 면역조직화학염색은 음성을 나타 내었다(Fig. 6).
고 찰
역전사 중합효소반응을 통한 세포의 골형성능을 측정 한 결과 배양초기부터 type I collagen과 osteopontin, osteonectin, ALP의 발현은 분화하지 않은 상태의 미분 화 줄기세포에도 어느 정도 존재하고 있음을 말해준다.
그러나 osteocalcin은 분화유도 물질을 첨가하여 3주 이 상의 장기배양을 통해 어느 정도 세포의 분화가 이루어 졌을 때 비로소 발현되었으며 단백질의 생성량은 7주까 지 꾸준히 증가하였는데 5-7주에서 급격한 증가를 보였 다. 이는 골아세포에 의해 생성되는 type I collagen이 osteonectin, osteopontin, ALP에 의한 석회화가 진행 되고, 그 이후 분화 유도물질에 의하여 osteocalcin의 생 성이 촉진되었을 것이라고 추정할 수 있으며 골아세포의 골 형성 기능에 있어서 osteocalcin이 골재건에 중요한 관련이 있음을 시사한다.
골형성 세포들이 살아가면서 골을 형성하기 위해서는 기질 또는 세포들이 적당한 위치에서 증식 분화할 수 있 는 지지체와 같은 골전도 물질이 필요하며 이는 생체이식 후 생체와의 결합, 그리고 장기적인 결과에도 영향을 주 는 것으로 알려져 있다14).
사람뼈는 해면골을 초저온 냉동 처리한 것으로 세포가 활발하게 증식하고 있었으며, 이식부위의 석회화 현상은 관찰할 수는 없었으나 지지체와 세포의 근접면에 풍부하 게 존재하는 세포로 인한 신생 미숙골의 양상을 관찰할 수 있어 우수한 세포 지지체의 역할을 하고 있음을 확인 하였다. 돼지뼈는 돼지의 해면골을 1,300oC에서 2시간 동안 고온 열처리하여 제작하였으며 세포는 돼지뼈의 내 공 사이에서 풍부하게 자라나고 있었으며, 세포의 형태도 골아세포의 형태를 나타내고 있었고, 생체이식 후 세포- human bone chip의 경우와 비슷한 양상을 나타내었다.
상품화된 HA는 평균내공이 200-500μm인 망상구조 로 인간의 해면골과 유사한 장점이 있으며, 천연골의 무 기질과 동일한 성분으로 압축강도는 높지만 인장력이 낮 아서 부서지기 쉬우며 강도와 흡수율이 다양하다는 단점
이 있다. De Kok 등3)은 골수줄기세포- HA/TCP 지지체 복합체를 개의 체내에 이식하여 4주 후 조직학적 검사를 통하여 골형성을 관찰하였다고 보고하였다.
칼슘-알긴산염은 해조류에서 추출된 알긴산과 CaCl2
의 복합체로서 내공의 크기는 80-310μm였다. Yang 등15)은 골수줄기세포-칼슘알긴산염 복합체를 주사기로 가토 피하에 이식하여 4주에는 완전한 골형성을 관찰할 수 없었으나, 8주와 12주에는 골형성을 관찰할 수 있었 으며 endochondral ossification의 형식으로 골 형성이 일어나는 것을 관찰하였다고 하였다. 본 연구에서는 세포 가 지지체에 부착 증식하지 못하였고, 생체 이식 후 신생 조직 또한 관찰되지 않았는데 이는 칼슘-알긴산지지체 의 제작과 실험방법이 달랐기 때문이라 생각한다.
생분해성 고분자인 PLGA는 PLA와 PGA를 70：30의 비율로 혼합하였으며, 지지체 표면의 친수성을 높이기 위 하여 NaOH로 처리하여 제조하였고, 내공 크기가 300- 500μm으로 실제 해면골과 유사한 형태를 가지고 있었 다. 생분해성 고분자들은 골전도 효과는 좋지 않지만 생 체적합성이 좋고, 봉합사 등과 같이 이미 생체재료로 많 이 사용되어 그 안전성이 이미 입증되었으며, 쉽게 원하 는 형태로의 제조가 용이하며 용해 시간과 성장인자들의 방출을 조절할 수 있는 장점 등으로 향후 골형성 유도 물 질로서 사용 가능성이 높다. Ochi 등12)은 골수유래 골형 성세포를 PLGA-collagen sponge에 부착하여 골대치물 로 이용하여 좋은 임상 결과를 보고하였다.
Osteocalcin에 대한 면역조직화학염색 결과 세포-칼 슘알긴산염 복합체에서는 음성을 나타내었고 기타 다른 지지체에서는 양성을 나타내었는데 이는 H&E염색 결과 와 부합되며 칼슘알긴산염 지지체를 제외한 기타 지지체 에서 골모세포가 부착 생장하면서 골형성이 이루어지고 있음을 시사한다.
이와 같이 세라믹 pore 등과 같은 물질에 자가 골전구 세포를 체외에서 성장시키는 것은 몇 가지 장점이 있다.
첫 번째로 이식편표면에 세포 생착이 최대화되어 전구세 포들이 균등하게 덮인 해면구조를 형성하게 되며, 두 번 째로 한번 세포가 이식편에 부착하게 되면 여러 가지 성 장인자의 추가에 따라 생체에 이식되기 이전에도 세포들 은 HA의 표면에서 유골성기질을 형성하기 시작하여 골 조직분화가 촉진될 수 있으며, 세 번째로 생분해성 고분 자는 혈관침식, 지속적인 골형성분화 그리고 신속한 골유
합을 유도하는 다양한 생체 활동성 인자들을 첨가하여 효 과적이고 골 결손부위에 따른 성형이 용이한 조골세포- 고분자 복합체를 만들 수 있다는 점이다.
결 론
본 연구에서는 가토 골수 줄기세포를 채취하여 분리배 양하고 분화 유도 물질을 첨가하여 골아세포로 분화시켜 여러 가지 지지체에 부착 배양하였으며 세포-지지체 복 합체를 다시 생체이식하여 골형성능을 관찰하였다. 골수 중간엽 줄기세포는 골조직공학의 주요한 세포자원이며 밀도구배 원심분리법은 골수에서 중간엽 줄기세포를 분 리하는 간단하고 효과적인 방법이다. 골수 중간엽 줄기세 포는 dexamethasone, β-glycerophosphate, L-as- corbic acid의 작용하에 분화 유도되어 다양한 골형성 관 련 단백질을 발현하였으며 여러 가지 지지체에 부착시켜 생체이식하여 in vitro와 in vivo에서 세포의 부착 증식 과 골형성능에 대한 관찰을 통하여 4주간의 단기 추시상 자연골이 다른 지지체에 비하여 세포배양에 보다 효과적 이며 생체내 석회화 유도에 적합함을 확인하였다.
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= 국문초록 =
목 적: 다양한 지지체를 이용한 생체내 골형성과 최적의 세포배양 지지체를 알아보기 위해서 골아세포의 3차원 배양과 지지체들의 적합성을 비교하였다.
대상 및 방법: 가토골수에서 분리한 중간엽 줄기세포를 골아세포로 분화, 유도한 후 골형성 단백질의 발현과 석회화 양상을 관찰하였다. 또한 여러 지지체를 이용하여 3차원 배양하고 복합체를 주사현미경으로 관찰하였다.
복합체를 누드마우스에 이식하여 방사선, 조직관찰, 면역조직화학 등의 방법으로 골형성 여부를 확인하였다.
결 과: 중간엽 줄기세포는 골아세포로 분화하였으며 석회화가 관찰되었다. 골형성 단백질의 발현이 2-3주 이후 지속적으로 관찰되었다. Osteocalcin 생성은 6-7주에서 급격히 생성되었다. 골아세포는 hydroxyapatite보다 사람뼈나 돼지뼈에서 많이 부착 증식하였고, PLGA에서는 세포가 밀착하지 않고 그물망 구조를 형성하였다.
칼슘알긴산염 지지체에서는 살아있는 세포를 관찰할 수 없었다. 그렇지만 생체이식한 사람뼈, 돼지뼈, hy- droxyapatite, PLGA에서 풍부한 양의 세포와 신생조직을 관찰할 수 있었다.
결 론: 다양한 합성 고분자보다는 천연골이 삼차원적 세포 배양 및 단기간의 동물실험에서 더 효과적이고 적합한 지지체임을 확인할 수 있었다.
색인 단어: 중간엽 줄기세포, 지지체, 골화, 오스테오칼신
