세포 내에서 일어나는 다양하고 복잡한 신호전 달과정은 외부 자극에 대응하기 위한 필수적인 현 상이다. 이런 과정 중에 단백질은 세포막에서 외 부 신호를 받아들이는 수용체 역할을 하기도 하며 세포내에서는 각종 분자들 간의 신호를 전달하는 전달체로서의 역할을 수행한다. 따라서 세포에 유 전자 조작 또는 단백질 처리를 통해 목적하는 새 로운 능력을 인위적으로 세포에 부여할 수 있으며, 신호전달과정의 조절을 통해 동물세포의 본 기능 을 향상시켜 의학적, 산업적인 응용을 가능하게 할 수 있다. 본 고에서는 동물세포를 이용한 단백 질 분자공학과 관련하여, 인공후각 연구와 세포사 멸억제 단백질 및 유전자 탐색과 응용에 대하여 기술하고자 한다.
인공 후각 연구는 인간의 후각의 기능을 갖는 인공 후각 센서 개발을 목적으로 한다. 이를 위해 인간의 후각 수용체 유전자들을 확보하고 이를 이 용하여 세포 표면에 인공 후각 수용체를 발현시킨 다. 이렇게 발현된 후각 수용체와 특정 냄새분자 들과의 반응을 다양한 분석 장비를 이용하여 측정 함으로써 감도와 구별능력이 뛰어난 인공후각 감 지 시스템을 개발한다. 본 연구에서 개발된 인공 후각 시스템은 인공감각, 독성물질 감지, 질병의 진단, 식품과 음료의 품질관리 등에 널리 응용될 수 있을 것으로 기대된다.
세포 사멸 억제 단백질 및 유전자 탐색과 응용 에 있어서는 에이파토시스 억제가 핵심기술이다.
에이파토시스(Apoptosis)는 고등세포가 외부의 자극에 대해서 능동적으로 대처하는 프로그램된 세포 사멸 기작이다. 세포의 生과 死가 잘 조절되
어야 개체가 올바로 살아갈 수 있다. 치매 같은 퇴 행성 질환들은 살아있어야 할 세포들이 죽어가는 것이고, 암과 같은 증식성 질환들은 죽어야 할 세 포가 죽지 않고 살아남아 비정상적으로 많은 증식 을 하기 때문에 발생한다. 본 연구는 세포 사멸 억 제력을 갖는 단백질 등의 신물질을 개발하고 작용 기작과 특성을 규명하여 이를 산업적, 의학적으로 다양한 분야에 적용하는 것을 목적으로 한다.
인공 후각 연구
1) 인간 세포에서 후각 수용체 단백질의 기능적인 발현 및 응용
동물에게 있어서 후각은 서로 간에 의사소통이 나 주위환경을 해석하는데 가장 효과적인 감각이 다. 후각은 매우 낮은 농도의 냄새물질들을 감지 하고 수천, 수만 가지의 다른 화합물들을 구별하 는 능력을 가지고 있다. 다른 포유동물에 비해서 인간은 비교적 후각이 덜 발달되어 있지만, 10-3 ppb의 낮은 농도의 냄새를 감지하고 만 가지의 냄 새를 구분할 수 있다[그림 1]. 최근 들어 후각 연 구에 대한 관심이 증가되고 이것의 산업적 응용에 대한 가능성이 제기되고 있다. 또한 많은 연구 그 룹에서 후각의 분자적 기작을 이해하려고 노력해 왔다. 이러한 후각 작용에서 냄새분자의 종류 및 농도의 구별은 냄새분자와 후각 수용체 단백질과 의 결합에 의해 이루어진다. 후각 수용체 단백질 은 몇 가지 특징들을 가진다. 첫째로 후각 수용체 단백질은 G-protein과 연결되어 있고 세포막을 일곱번 통과 하는 7-transmembrane 구조를 가진 다. 이러한 특징은 후각 수용체의 기능에 중요한 박 태 현
서울대학교 화학생물공학부, thpark@plaza.snu.ac.kr
역할을 한다. 두번째로 후각 수용체는 N-말단 신 호서열이 없어서 이종 세포계(heterologous cell system)에서 발현 시 세포막 표면에 발현이 쉽지 않다. 셋째로 후각 수용체 단백질에 의해 유발되 는 후각 신호 전달과정은 두 가지 경로(pathway) 를 통해 일어난다. 하나가 cAMP pathway이고 다른 하나가 IP3pathway이다. 그러나 거의 대부 분의 포유동물은 후각 신호전달 과정에서 cAMP pathway를 이용하고 IP3의 역할은 아직까지 잘 알려져 있지 않다.
cAMP pathway에서는 후각 수용체와 냄새분 자의 결합에 의해 세포내에 cAMP의 증가가 일 어나고 이것에 의해 cyclic nucleotide gated- channel(CNG-channel)이 열리고 세포외부에서 Ca2+와 Na+ 이온들이 유입되면서 세포막의 전위 가 변하여 신경신호가 발생하게 된다. 이러한 작용 을 통해 발생하는 이온들의 변화를 간단하게 측정 하는 방법의 연구는 후각 수용체 단백질을 이용한 센서의 개발을 가능하게 한다. 본 연구에서는 후각 수용체 단백질을 인간세포에 발현시키고 기능을 연 구함으로써 실제 후각 작용의 이해와 더불어 냄새 분자의 자극에 의해 기능을 하는 감도와 구별능력 이 뛰어난 인공 후각 센서 개발을 목표로 하고 있다.
2) 인간 후각 수용체 유전자들의 확보 및 발현 후각 수용체 유전자는 우선 모델유전자로 Rat 의I7과 C. elegans의 odr-10 유전자를 확보하여 연구 중에 있으며, 인간의 후각 수용체 유전자를 human embryonic kidney(HEK)-293 세포에서 PCR(polymerase chain reaction)방법으로 얻고 있다. 확보된 후각 수용체 유전자는 인간세포의 막에 발현시킴으로써 인공 후각 세포가 제조된다.
3) 인공 후각 센서의 개발
① QCM(quartz crystal microbalance)을 이용한 후각 센서
후각 수용체와 냄새분자 간의 결합을 감지하기 위하여 quartz crystal microbalance(QCM)가 사 용될 수 있다[그림 2]. 수정 크리스탈(quartz crystal)은 고유의 공명주파수를 가지고 진동을 하는데, 특정 냄새 분자가 수정 크리스탈의 gold 표면에 입혀진 후각 수용체와 결합하면, 변화된 질량이 크리스탈의 공명주파수를 변화시키고 이 것은 질량변화에 비례하여 감소한다. 이러한 관계 는 다음의 Sauerbrey equation으로 표시된다.
∆f = –f ---∆Art∆m
f는 공명 주파수의 변화(Hz), f는 초기 주파수 (MHz), A는 전체표면적(cm2), r은 크리스탈의 밀도(g/cm3), t는 크리스탈의 두께(cm), m은 흡 수된 질량(g)을 나타낸다. 먼저 후각 수용체가 표 면에 발현된 인공 후각 세포를 수정 크리스탈의 gold 표면에 배양하고 말린다. [그림 3]은 후각 수 용체 I7이 여러 냄새 분자들 중에 옥타날(octanal)
Olfactory bulb
Bone
Olfactory receptor cells
Mitral cell Glomerulus
4. The singnals are transmitted to higher
regions of the brain
3. The signals are relayed in glomeruli
2. Olfactory receptor cells are actirated and send electric
signals
1. Odorants bind to receptors
Air with odorant molecules olfactory receptor
그림 1. 후각계의 구조와 후각 작용.
그림 2. QCM 장치.
ador vepor
Detection chamber Frequency generator Computer
과 특이적으로 결합함을 보여주며, [그림 4]는 10-8mM의 옥타날 농도까지 감지가 가능함을 보 여준다.
② 세포외 전위차 측정(extracellular potential record- ing)을 이용한 후각 센서
인공 후각 세포의 반응을 전기적으로 측정하는 방법으로 세포외 전위차 측정법이 있다. 이것은 후각 세포에 있어서 냄새 분자가 후각 세포의 후 각 수용체와 결합하고 CNG-channel을 통하여 세 포외부에서 Na+의 대량 유입이 일어나 세포막 전 위의 변화가 발생하며 이것을 측정하는 것이다 [그림 5]. 본 연구에서는 이러한 CNG-channel
유전자를 후각 수용체 I7가 발현된 인공 후각 세 포에 도입하고 옥타날에 대한 세포 전위차를 측정 하였다. [그림 6]은 10-5M의 옥타날이 후각 수용 체 I7과 반응하여 인공 후각 세포의 세포외 전위 를 변화시킨 결과이다. 후각 수용체 I7을 가지지 않는 세포와 대조적으로 후각 수용체 I7을 가지는 인공 후각 세포는 옥타날에 반응하여 약 7mV의 전위변화를 보여준다.
③ SPR(surface plasmon resonance)을 이용한 후각 센서
SPR은 막 표면에서 일어나는 현상들을 측정하 는 기술이고 표면의 미세한 변화를 감지하는데 사 용된다. [그림 7]은 SPR을 이용하여 세포내부에 서 일어나는 변화 감지의 원리를 보여준다. 본 연 구에서C. elegans의 후각 수용체 ODR-10을 발 현하는 HEK-293세포와 특정 냄새 분자인 다이
-1400 -1200 -1000 -800 -600 -400 -200
0
hexanal heptanal octanal nonanal decanal Aldehydes (C6-C10)
∆F (Hz)
그림 3. 여러 냄새분자들에 대해 I7을 발현하는 세포 로 코팅된 QCM에서의 반응.
그림 5. 세포외 전위차 측정 장치.
-1400 -1200 -1000 -800 -600 -400 -200 0
10-8 10-7 10-6 10-5 10-4 10-3 10-2 10-1 100 101
Concentration of octanal (mM)
∆F (Hz)
그림 4. 옥타날의 농도와 주파수 변화와의 농도 의존 적 관계.
A B
Time Time
2.5s
5 mV
10-5 M Octanal
1) Ch 1: 500 mVolt 2.5s 1) Ch 1: 500 mVolt 2.5s 10-5 M Octanal
그림 6. I7을 발현하는 인공 후각세포에서 옥타날에 의한 세포외 전위의 변화：A는 I7을 발현하지 않는 대조군 세포, B는 I7을 발현하는 인공 후각 세포.
아세틸(diacetyl)과의 상호작용을 SPR을 이용하 여 분석하였다. [그림 8]은 다이아세틸 처리 시에 ODR-10을 발현하는 세포의 경우 발현하지 않는 세포에 비해 resonance angle이 변화되었음을 보 여준다.
4) 기대효과
이러한 후각 센서에 대한 연구를 통해 인간의 후각 수용체 유전자원 확보가 가능하게 되고, in vitro에서 냄새분자의 반응에 대한 전기적 신호 측 정이 가능하게 된다. 나아가 후각 신경 신호 분석 에 대한 학문적인 가치 및 인간의 후각 신호에 관 련된 데이터베이스의 확보, 감도가 좋은 인공 후 각 센서로서 유용 냄새(향수, 냄새치료 물질 등) 및 유해냄새(유독가스, 악취, 마약 등)의 감지 시 스템 개발이 가능하다.
세포 사멸 억제 단백질 및 유전자 탐색과 응용 1) Anti-apoptosis engineering
에이파토시스는 세포의 선택적인 제거를 위한 필수적인 생리학적 기작이다. 다시 말해, 생체에 해로운 세포를 정상적인 상태로 전환하거나 완전 히 제거하는 과정이다. 외부의 자극에 대해서 세 포는 일련의 변화를 겪게 되는데, 이러한 변화에 는 생과 사를 결정짓는 요소들이 상호작용을 통해 세포의 운명을 스스로 선택하는 과정이 포함되어 있다. 따라서 에이파토시스는 생체 내의 발생과 퇴화, 그리고 항상성(homeostasis)에 필수적인 요 소로서 에이파토시스의 과다한 발생이나 부족 현 상은 곧바로 질병으로 이어질 수 있다. 인체 내의 과다한 에이파토시스 발생에 의한 질병으로는 신 경퇴행성 질환의 일종인 알츠하이머병 (Alzheimer’s disease)과 파킨슨씨병(Parkinson’s disease)이 있으며, 에이즈와 같은 바이러스 감염 에 의한 질병도 이 범주에 포함이 된다. 반면, 인 체 내에서 에이파토시스가 제대로 일어나지 않을 경우 암과 같은 질병의 발병 가능성이 높아진다.
그러므로 인체 내에서 일어나는 에이파토시스의 조절에 대한 연구가 세계 각국의 수많은 연구진들 에 의해서 수행되고 있다.
세포배양 배지의 필수 첨가물인 고가의 소태아 혈청(fetal bovine serum, FBS)을 저가의 누에체 액으로 대체하려는 연구를 수행하던 중, 누에체액 을 배지에 첨가함으로써 배양중인 세포의 생존성 을 보다 오래 유지할 수 있다는 사실과 이와 관련 하여 재조합 단백질의 발현량이 증가된다는 사실 이 발견되었다.
일련의 과정을 통해 바이러스 및 다양한 종류의 화학물질에 의해 유도되는 곤충세포, 포유동물세 포, 인간세포 등의 다양한 시스템에서의 에이파토 시스가 누에체액에 의해 저해된다는 것을 확인하 였다. 에이파토시스를 저해하는 누에체액 중의 유
0 50 100 150 200 250 300 60
58 56 54 52 50
HEK-293 cells HEK-293 cells expressing OD-R10 Time (second)
Resonanceangle
그림 8. SPR을 이용한 인공 후각 세포의 기능측정.
그림 7. SPR에 의한 세포내부의 변화측정 모식도.
효성분을 분리/정제하여 그 성분이 28KD 크기의 단백질(30K)이라는 사실도 밝혔고, 아미노산 서 열 분석을 통하여 해당 유전자를 동정하여 PCR 을 통해 그 유전자를 확보하였다. 누에체액과 30K 단백질이 갖고 있는 에이파토시스 저해 기작을 규 명하기 위해 에이파토시스 기작의 하위 단계인 DNA fragmentation과 caspase의 활성화에 이들 이 미치는 영향 규명을 시작으로 상위 단계인 미 토콘드리아와 관련된 세포내의 변화를 관찰하였 다. [그림 9]에서 보듯이, 세포가 에이파토시스 신 호를 받게 되면 세포질내의 Bax 단백질이 구조적 인 변화를 일으켜 미토콘드리아로 전이된다. 미토 콘드리아의 외막으로 전이된 Bax는 막상에서 채널 을 형성하고 미토콘드리아는 membrane potential 의 손실 등 다양한 변화를 거치게 된다. 여기서 가 장 큰 특징적인 변화는 미토콘드리아에만 존재하 고 있던 cytochrome c가 세포질로 유출되는 것이 며, 세포질에서의 cytochrome c는 Apaf-1과 dATP와 결합하여 caspase-9을 활성화 시킨다. 이 어서 caspase-3가 활성화 되며, caspase-3는 핵 안으 로 들어가서 DNA fragmentation과 관련된 일련의 반응을 촉진시킨다.
누에체액과 30K 단백질은 상기 과정 중에 Bax 의 미토콘드리아로의 전이를 저해하며, 따라서 에 이파토시스 신호로부터 미토콘드리아를 보호할
수 있는 것이다. 미토콘드리아는 세포의 생명 유 지를 위한 가장 필수적인 기관이기 때문에, 미토 콘드리아의 상위에서 에이파토시스 신호를 저해 할 수 있다는 것은 누에체액과 30K 단백질의 무 한한 응용 가능성을 의미한다. 현재 본 연구실에 서는 30K 단백질의 구조분석과 병행하여 30K 유 전자의 mutagenesis를 통해 이 단백질의 active site를 찾는 연구를 수행 중이다.
2) 동물세포 배양을 통한 고품질 고부가가치 단백 질 의약품 생산
동물세포를 이용한 의약품 개발은 1990년대 생 명공학의 산업화를 주도한 핵심 분야로써 EPO (인간조혈호르몬), G-CSF(인체 백혈구성장 촉 진 호르몬)와 최근 단일항체, 유전자 치료용 바이 러스 등을 발매시켰으며 매년 성장을 거듭하여 21 세기 생명공학 산업화의 주역이 될 것으로 예상되 고 있다.
누에체액은 과거 연구에서 세포의 에이파토시 스를 억제하여 단백질 생산 기간을 연장시켰으며, 동시에 단위세포 당 단백질 생산성을 증가시키는 효과를 보였다. 누에체액 내 단백질 중 하나인 30K 단백질을 동물세포 내에서 발현시켰을 경우 에는 특히 세포의 성장 속도를 증진시켜 고농도 배양을 통한 생산성 향상을 가져왔다. 대부분의 의약용 단백질은 당 단백질이며, 제품의 안정성과 활성을 인증받기 위해서는 단백질의 당쇄 (glycosylation)가 중요하다. 특히 당쇄의 말단에 위치한 sialic acid는 의약품이 인체로 투여되었을 때 활성을 유지하는 핵심 요인이다. 누에체액은 재조합 당 단백질중 이 sialic acid가 많이 결합된 생산물의 비율을 높여 주었으며, 30K 유전자의 발 현은 sialic acid가 온전히 붙은 단백질만 균일하게 생산시키는 결과를 안겨 주는 등 의약품의 고품질 화를 이룩하였다.
그림 9. 외부 자극에 의한 에이파토시스의 기작과 누 에체액의 항 에이파토시스 작용.
3) 퇴행성 신경질환 치료제 개발
고령화가 진행되고 삶의 질에 대한 관심이 고조 되면서 알츠하이머와 파킨슨씨병과 같은 퇴행성 신경질환의 치료가 세계적으로 핫이슈가 되고 있 다. 본 연구실에는 이들 질환의in vitro 모델인β- amyloid-PC-12 세포 시스템과α-synuclein의 과 발현 시스템을 이용해서 치료제로서의 누에체액 과 30K 유전자의 가능성을 확인하고 있다.
4) 신 기능성 항산화물질의 탐색 및 개발
과거 연구에서 누에체액이 세포의 활성산소를 유발하는 기작에 의한 에이파토시스를 저해하는 효과를 토대로 누에체액 내 항산화 물질에 관심을 가지게 되었다. 활성산소는 인체 내에서 생성되어 세포의 지질, 단백질, DNA 등을 공격하여 변성과 파괴를 일으킨다. 반면, 항산화물질은 이러한 활성 산소의 생성을 억제하거나 활성을 감소시켜 주는 물질을 가리키며 비타민, 카로틴, 토코페롤 등이 대표적인 항산화물질에 속한다.
기존에 알려진 항산화물질에 비해 활성이 우수 하고 화학적 안정성 및 경제성이 뛰어난 신물질의 누에체액 내 존재 가능성을 DPPH 라디칼 소거 실험과 수퍼옥사이드 활성 측정 실험 등을 통해 확인하였으며, 이 물질의 동정과 구조 분석을 위 해 젤 투과 크로마토그래피를 이용하여 분리한 후 LC/MS, NMR 방법으로 분자 구조를 규명하고 항산화능과 더불어 항당뇨, 항암 효과와 같은 복 합 기능 여부에 대한 연구가 진행되고 있다.
단백질(특히 산업용 효소 및 치료용 단백질)은 부가가치가 높아 산업적, 의학적 중요성이 계속 커지고 있다. 단백질을 산업적으로 사용하는 경우, 단백질이 고가이며 안정성이 낮다는 점이 문제점 으로 지적되고 있어 실용화에 큰 장애가 되고 있 다. 산업적으로 단백질은, 세포내의 온화한 환경이 아닌, 높은 온도, 높거나 낮은 pH, 또는 유기 용매
등과 같은 극한 환경에서 사용되기 때문에 낮은 안정성을 보인다. 단백질 불안정성은 단백질의 의 학적, 산업적 유용성 저하의 주원인이므로 효과적 인 단백질 안정화 전략을 수립하여 이러한 문제점 을 극복해야 한다. 그래야만 단백질 및 효소를 이 용한 산업이 활성화되고 발전할 것이다. 본 고에 서는 다양한 단백질 안정화 전략 중 단백질 공학
：
주정찬·유영제
서울대학교 화학생물공학부 {kokume02, yjyoo}@snu.ac.kr 당쇄향상,
고농도 세포배양, 세포사멸 억제, 단백질의약품, (KPO, FSH 등) 누에체액, 30K
무혈청배지,
30k 발현, 생산성 증가,
그림 10. 누에체액과 30K 단백질을 이용한 단백질 생 산 전략.
