IEG 환경지질연구정보센터

한국지하수토양환경학회 추계학술발표회 2006년 10월 12-13일 KAIST

유류오염 지하수의 미생물 군집 특성

김재수, 김지영, 구소연, 이은희, 고경석^*, 고동찬^*, 조경숙 이화여자대학교 환경학과․^*한국지질자원연구원 지하수지열연구부

E-mail: [email protected]

<요 약 문>

This research has been performed to figure out the properties of bacterial community structures in oil-contaminated groundwaters using Ecoplate and DGGE techniques. Each groundwater samples includes BTEX as the following concentration order: GW13 (13,475 mg/L) > W2 (1680 mg/L) > GW3 (1337 mg/L) > W3 (707 mg/L) > W1 (39.7 mg/L) > GW8 (18.1 mg/L) > BH10 (2.5 mg/L) > GW7 (not-detectable). In the comparison of DGGE fingerprint patterns, the similarity was highest between W1 and W3 (76.0%), probably due to common properties like relatively low BTEX concentrations. Otherwise GW7 showed lowest similarities with W2 (35.5%) and GW13 (37.5%), maybe because of the degree of contamination. The most dominant bacterial species in each site were involved in high G+C Gram

(31%) in BH10, β-Proteobacteria (56%) in GW3, ⍺-Proteobacteria (50%) in GW7, ⍺-Proteobacteria (44%) in GW8, ⍺, γ, δ-Proteobacteria (18% each) in GW13, β-Proteobacteria (38%) in W1, Unidentified bacteria (29%) in W2, and Cytophaga-Flexibacter-Bacteroides group (50%) in W3. Using the Ecoplate data, average well color development (AWCD) analysis demonstrated that the potential activity on 31 substrates was W1 > W3

> W2 > BH10 > GW3 > GW7 > GW8 > GW13. Principal component analysis (PCA) as similarity analysis roughly divided into three groups (group 1: GW3 and GW7; group 2: GW8, W1, W2, W3, BH10; group 3: GW13), implying as high concentrations of oxygen and nitrate for group1 and very high BTEX concentraiton for group 3. Shannon index showed that the microbial diversities were similar among the samples.

Key words: BTEX (benzene, toluene, ethylbenzene, xylem), groundwater,

bacterial community structure, DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis),

Ecoplate

1. 서론

지하수의 유류 오염물질의 분해는 대수층의 특성에 의해 다양하게 나타난다 (Warren et al., 2004). 유류의 대부분을 차지하는 탄화수소화합물은 혐기적으로 자 연저감에 의해 잘 분해되는데 철 환원조건이나 methane 생성조건 등에서 발생한다 (Bekins et al., 2001). BTEX(benzene, toluene, ethyl benzene, xylene), 디젤, 석유 도 혐기적 자연저감에 의한 제거가 보고되었고(Essaid et al., 2003) n-alkanes의 경 우 황환원과 메탄생성조건에서 혐기적으로 분해가 된다(Townsend et al., 2003).

이와 같이 유류로 오염된 지하수에서 혐기성 그람음성 철환원균이나 황환원균 (Kleikemper et al., 2002), β -Proteobacteria와 γ -Proteobacteria(Feris et al., 2004) 그리고 Cytophaga-Flexibacter-Bacteridetes 군(Feris et al., 2004)에 속하는 종들이 일반적으로 우점 하였고 특별히 BTEX를 잘 분해하는 지하수의 서식 균들은

속하는 균들이다(Cavalca et al., 2004).

오염된 지하수의 미생물 군집구조(microbial community structure)의 분석을 통해 현존하는 미생물 개체군(populations)의 정화능력과 어떻게 이들 개체군들이 환경에 영향을 주며 또는 영향을 받는지에 대한 파악은 자연저감을 예측하고 관측하는데 유용한 도구가 될 것이다(Röling et al., 2000). 본 연구는 농촌지역의 한 생활폐기물 매립장으로부터 오염된 지하수의 수지화학(hydrogeochemistry)과 미생물 군집구조간의 상호 연관관계를 밝히기 위해 수행되었다. 즉, 오염 지하수의 물리화학적 분석은 오염의 정도와 주요 산화환원반응을 파악하기위해 수행되었고 분자생물학적 기법인 DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis)는 미생물 군집구조를 분석하고 대략적인 미생물군을 파악하기위해 수행되었다.

미생물의 군집 수준에서 그들이 갖는 기능적인 다양성을 평가하는 방법 중 하나 로 96-well Biolog(Biolog Inc., Hayward) microtiter plate를 이용하여 탄소원 이용 능력을 분석하는 기법이 있다(Garland and Mills, 2001). Biolog microtiter plate는 미지의 미생물 군집에 의한 다양한 탄소원 이용도를 빠르고 쉽게 조사할 수 있도록 개발되었으며, 이러한 community-level physiological profiling(CLPP) 접근 방법으 로 환경 시료 내 미생물 군집의 특징을 비교하는데 매우 유용하다(Garland, 1997;

Konopka et al., 1998). 이 방법은 총 발색율, well 간 반응의 풍부도(richness)와 균 등성(evenness) 또는 다른 기질의 상대적 이용률을 포함한다.

2. 재료 및 방법

2.1 시료의 물리･화학적 분석

각 시료의 물리화학적 분석은 Table 1에 나와 있다.

Well BTEX T pH DO EC HCO3 Fe(T) Fe²⁺ Mn H2S

(ppb) F Cl NO3 SO4 Na K Ca Mg Si Al

(ug/L) Sr (ug/L)

BH10 2.5 12.3 6.59 1.93 662 151.9 1.36 0.28 1.0 221 72.5 16.7 124.5 39.7 24.3 50.4 17.8 4.1 13 178

GW3 1337 12.0 7.47 4.53 520 130.4 2.61 2.31 0.4 15 71.8 50.4 33.4 28.8 3.3 48.0 17.0 10.9 2 435

GW7 ND¹ 13.0 7.63 8.76 369 75.7 0.01 0.00 0.0 8 0.00 28.1 71.9 11.3 11.4 1.8 47.4 11.1 11.7 2 133

GW8 18.1 9.2 7.57 2.36 657 163.7 0.03 0.00 0.0 2 85.3 104.2 31.2 18.4 3.0 86.4 20.2 13.4 3 216

GW13 13475 13.4 6.95 1.17 829 215.6 13.50 12.85 0.8 22 1.21 150.0 19.7 29.1 18.2 2.8 74.4 16.1 6.7 650

W1 39.7 10.7 7.29 3.33 765 300.4 1.10 0.02 7.3 32 64.7 15.0 45.5 40.9 23.0 74.4 20.5 10.6 17 278

W2 1680 7.8 6.87 1.96 1098 592.3 4.70 3.14 26.0 22 43.0 13.9 52.0 22.2 104.0 38.9 3.8 46 368

W3 707 11.0 7.50 2.24 759 360.8 2.67 0.28 8.0 167 0.61 50.0 0.5 47.4 31.8 20.8 93.7 23.5 7.2 14 291

Table 1. The physico-chemical properties of the oil-contaminated groundwater

1 non-detectable

2.2 미생물 회수, DGGE 분석 및 유사성 비교

생물량이 많은 것으로 판단되는 시료(KSG1-12)는 원심분리법으로, 생물량이 적은 것으로 판단되는 시료(KSG1-16, KSG1-07, KSG1-08, KSG1-13)는 여과법을 이용하여 각 시료로부터 균체를 회수하였다. 원심분리법에 의해 균체를 회수하기 위해, 멸균된 250㎖ 원심관에 지하수 시료를 200 ㎖에 넣고 9,000 rpm에서 10분 동안 원심분리한 후 상등액을 버리고 모아진 균체를 다시 멸균된 1.5 ㎖ tube에 넣어 12,000 rpm에서 10 분 동안 원심 분리하여 균체를 회수하였다. 여과법에 의해 균체를 회수하기 위해, membrane 여과지(pore size: 0.2㎛)로 각 시료를 여과시킨 후 여과지위의 균체를 멸균수를 이용해 씻어내면서 회수하였다. 회수된 현탁액을 1.5㎖ tube에 넣어 이를 12,000rpm에서 10분 동안 원심분리하여 균체를 회수하였다.

모아진 균체 0.5 g(습중량)으로부터 BIO101 FastDNA SPIN Kit (Q-Biogene, USA)을 이용하여 genomic DNA를 추출하였다. 추출한 DNA를 template로 하고 16S rDNA gene primer인 341fGC[16]와 518r primer[18]를 이용해 PCR을 수행하였다(PCR system 2700, Applied Biosystem, USA)[3]. PCR 산물은 DGGE로 분석하였다. DGGE는 Dcode

System (Bio-Rad, USA)을 사용하여, 8%

polyacrylamide gel을 이용하여 urea 농도를 40~60% (100% denaturant; 7 M urea, 40% (v/v) formamide) 범위로 하여 50V 에서 12시간 동안 전기영동 하였다[3].

DGGE fingerprint의 유사성은 Gel ComparII version 3.5 software를 이용해

분석되었고 Jaccard coefficient로 표현하였다.

2.3 Ecoplate를 이용한 미생물 군집 분석

시료 내 미생물 군집의 기능적 다양성 분석을 위하여 Biolog사의 Ecoplates(Biolog Ecoplate

, USA)를 사용하였다. Ecoplate는 96개의 microwell로 구성되어 있으며, 각각의 well에는 31가지의 서로 다른 탄소원과 control이 3 sets 씩 반복 된다. 여기서 control well은 어떠한 기질도 포함되어 있지 않은 well이다.

Well 속 기질을 미생물이 유일 탄소원으로 이용하면서 세균성 호흡이 일어나면 well에 함유되어 있던 tetrazolium dye가 보라색으로 발현되도록 고안되어, 시료 속 미생물 군집의 기질 이용성 여부를 비교·평가할 수 있다.

Ecoplate에 각각의 시료를 150 μl/well 접종한 후, 20℃에서 배양하였다. 배양 기 간 동안 각 well 내 시료의 색변화 정도를 microtiter-plate reader(Multiskan Ascent, Thermo Labsystem, Filand)를 이용하여 24 시간 간격으로 595 nm에서 흡 광도(optical density, OD)로 측정하였으며, 시료별 기질 이용 양상을 시간에 따라 비교분석하였다. 배양은 시료 내 미생물 군집의 기질별 성장 곡선이 정체기에 도달 할 때까지 11 일간 하였다.

2.4 통계 분석

Microtiter-plate reader로 측정한 Ecoplate의 각 well의 흡광도 값과 기질이 포함 되어 있지 않은 control의 흡광도 값과의 차이를 시료별로 비교하기 위하여 시간 및 시료별 average well color development(AWCD)를 계산하였다. 여기서 AWCD는 Ecoplate의 전반적인 색 변화의 정도를 나타내며, 계산식은 다음과 같다

.

AWCD = [∑(C-R)] / n --- (식 1)

위 식에서 C는 기질이 포함되어 있는 각 well의 OD

값을 의미하고, R은 control well의 OD

값, n은 기질의 수로 31이다. 이를 이용하여 시료 속 미생물 군집의 다양한 탄소원을 이용할 수 있는 잠재적인 능력을 파악할 수 있다.

각 시료 속 미생물 군집의 탄소원을 이용하는 데 있어서의 유사성을 통계적으로 분석하기 위하여 식 2을 이용하여 계산한 값을 이용하여 principal component analysis(PCA)를 수행하였다(SPSS 12.0K for Windows).

PCA data = (C

-R

)/AWCD

--- (식 2)

PCA data는 기질 및 시료별로 나타내었으며, C

는 배양 i일 째 각 well의 OD

값이고, R

은 배양 i일 째 control well의 OD

값이다. AWCD

는 i일 째 AWCD

값이다. 이렇게 계산된 PCA data는 0에서 약 4 사이의 값을 가지며, 1보다 작은 경

우는 C-R이 AWCD보다 작음을 의미하고, 1보다 큰 것은 C-R이 AWCD보다 큼을

의미한다. PCA는 이렇게 구해진 수치들의 시료별 편차를 2개의 축(principal component 1, PC1; principal component 2, PC2)으로 나누어 탄소원 이용도에 있어 서의 유사성을 알 수 있다. 여기서 같은 면에 속하는 시료들은 그렇지 않은 시료에 비하여 상대적으로 탄소원 이용도가 유사함을 의미한다

.

또한 생태학에서 종 다양성을 나타내는 지수인 Shannon index 값을 시간 및 시 료별로 식 3을 이용하여 계산하였다.

H = - ∑ P

ln P

--- (식 3)

여기서 H는 Shannon index를 나타내며, P

는 전체 OD

값에 대한 각각의 기 질 OD

값으로, P

= C/∑(C-R)로 나타낼 수 있다.

3. 결과 및 토의

3.1 DGGE에 의한 미생물 군집 특성 비교 및 계통발생학적 유사도분석

DGGE의 band pattern들을 비교하여 유사도 tree를 Fig. 1에 도식하였다. 각 lane에 나타난 band는 지하수 시료의 우점종을 나타내고 아래의 그림은 밴드 위치를 비교하여 유사도를 구한 것이다. 참고로 band의 굵기는 우점정도를 나타낸다고 볼 수 있다. 결과적으로 W1과 W3가 가장 가깝게 묶여있고 유사도는 서로 76.0%의 유사성을 보여준다. 반면 같은 상층에서 채취한 시료인 W2는 멀게 묶여 있는데 이는 BTEX 오염도가 둘 보다 훨씬 높아 NO

와 SO

의 고갈로 미생물 군집 구조가 바뀐 것으로 사료된다. 이러한 결과는 아래의 계통분석학적 결과와도 어느 정도 일치한다(Table 2). 한편 GW13과 BH10이 가깝게 묶인 것은 예상치 못한 결과이다.

계통발생학적 분석에서 가장 특이한 것은 GW13 시료에서 9가지에 속하는

미생물 군에 골고루 분포하는 것이다. 이는 오염이 가장 심하게 된 지역이라서

다른 영양물질 보다는 유류성분의 분해할 수 있는 미생물종들이 폭 넓게 분포해

있기 때문인 것으로 사료된다. GW7과 GW8은 둘 다 ⍺-Proteobacteria가 가장 높은

비율을 차지하고 있는데 이는 둘 다 히류지역 하층의 지하수에 속하면서 오염도가

낮은 특징 때문인 것으로 사료된다. 하지만 DGGE유사도에서는 유사도가 멀게 나와

좀 일치되지 않는 결과를 보여준다.

Phylogenetic group %(clone number) in the following groundwater samples BH10 GW3 GW7 GW8 GW13 W1 W2 W3 Total

Acidobacteria

9(1)

1(1)

CFB

group

22(2)

31(4) 21(3) 50(5) 15(14)

Fermicutes 8(1)

8(1)

9(1)

14(2)

5(5)

⍺-Proteobacteria 8(1) 22(2) 50(6) 44(4) 18(2) 15(2)

20(2) 21(19) β-Proteobacteria 23(3) 56(5)

9(1) 38(5) 21(3) 30(3) 22(20) γ-Proteobacteria 23(3) 11(1) 17(2)

18(2)

9(8)

δ-Proteobacteria

9(1)

1(1)

ε-Proteobacteria

18(2)

14(2)

4(4)

Spirochetes

9(1)

1(1)

Verrucomicrobia

11(1)

1(1)

High G+C Gram

31(4)

8(1) 22(2)

8(7) U n i d e n t i f i e d

bacteria 8(1) 11(1) 17(2)

15(2) 29(4)

11(10) Total 100(13) 100(9) 100(12) 100(9) 100(11) 100(13) 100(14) 100(10) 100(91)

100

90

80

70

60

50

1 00 7 0 8 7

1 00 8 4

8 5

8 6

W 1 W 3 G W 3 G W 8 B H 1 0 G W 1 3 W 2 G W 7

Figure 1. Jaccard coefficient clustering of normalized DGGE gels (all samples)

Table 2. Relative levels of bacterial clones related to various phylogenetic groups in clone libraries from leachate-contaminated groundwater samples

1Cytophaga-Flexibacter-Bacteroides

3.2 Ecoplate Data를 이용한 통계분석

Time (h)

0 2 4 6 8 10 12

AWCD

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

GW3 GW7 GW8 GW13 W1 W2 W3 BH10

PC1 (43 %)

-1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0

PC2 (20 %)

-1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 GW3

GW7 GW8 GW13 W1 W2 W3 BH10

AWCD값은 개개의 기질이용도를 고려한 것이 아니기 때문에 군집의 기능적 다양성보다는 총체적은 활성도를 더 잘 반영한다. W1과 W3가 가장 높으면서 유사하게 나왔는데 이는 DGGE 결과와 일치하며 나머지 W2와 BH10이 그

다음으로 높은 값을 보여주므로 상층의 지하수에는 각종 영영염류가

농업환경으로부터 유입되었기 때문에 기질 이용도가 높은 것으로 보인다(Table 1).

반면 하층지하수인 GW시료들은 비교적 낮았는데 이는 영양염류의 유입이 차단되었기 때문인 것 같고 특히 가장 심하게 오염된 GW13은 오염도에 의해 다양한 탄소이용이 가능한 미생물의 감소를 초래한 것으로 사료된다.

PCA분석에서는 각각의 기질별 특성을 모두 반영한 것으로 대략적으로 3개의 군으로 나뉘는데 1군에는 GW3와 GW7가 속하고, 2군에는 GW8, W1, W2, W3, BH10이 속하였고 3군에는 BW13이 속하였다. GW8만 제외하고 모두 예상한 바와 같았는데 GW8이 위치적으로 W시료들과 근접해있어 이와 같은 결과가 나왔을 것으로 사료된다.

Shannon index 값은 미생물의 다양성을 나타내는 값인데 크게 두 군으로 나뉘었다. 높은 값은 가진 군에는 W1, W2, W3와 BH10이고 낮은 값을 가진 군에는 GW3, GW7, GW8 그리고 GW13이 속하였다. 이는 앞에서 언급한 바와 같이 오염도에 의해 다양성이 같은 양상을 보이기보다는 시료 채취의 깊이와 더 관련되어 보인다. 즉 영양염류의 유입정도에 의해 다양성이 결정된 것으로 판단된다. Table 1에서 W시료들의 높은 HCO

의 농도는 높은 대사정도를 나타낸다고 볼 수 있다.

Fig. 2. Variationwell color development Fig. 3. Principal component analysis of over time in Ecoplates (GW samples). average well color development (GW samples).

Time (h)

0 2 4 6 8 10 12

Shannon index

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0

GW3 GW7 GW8 GW13 W1 W2 W3 BH10

Fig. 4. Variation in Shannon index over time (GW sample).

4. 결론

DGGE 결과 분석을 통해 비슷한 위치 및 깊이의 지하수에서 유류오염도에 의해 유사도가 멀어지고 계통발생학적으로도 특이한 변화를 발견할 수 있었으나 Ecoplate 결과 분석에서는 오염도 보다는 지하수의 깊이 즉 주변 환경으로부터의 영양염류의 유입 정도에 크게 좌우되는 미생물 군집특성을 보여주었다.

5. 사사

본 연구는 공공기술연구회 정책 과제인 "지하수 환경 특성화를 위한 미생물, 미소생물의 생태학적 적용과 오염물질 거동 특성 연구"의 연구비 지원으로 수행되었습니다.

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