Effects of the Mixture of Eucommia ulmoides Oliver and Achyranthes japonica Nakai Extracts (KGC08EA) on Testosterone Synthesis in Late-Onset

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남성 갱년기 in vitro 모델에서 두충과 우슬 복합추출물(KGC08EA)이 테스토스테론 합성에 미치는 영향

김석호¹․이정윤¹․김소혁¹․김종한²․권한올²․이정선²․전우진³․이유현¹

1수원대학교 식품영양학과

2한국인삼공사

3전남대학교 식품영양학과

Effects of the Mixture of Eucommia ulmoides Oliver and Achyranthes japonica Nakai Extracts (KGC08EA) on Testosterone Synthesis in Late-Onset

Hypogonadism (LOH) in vitro Models

Seokho Kim¹, Jeong Yoon Lee¹, Sohyuk Kim¹, Jong Han Kim², Han Ol Kwon², Jeong Seon Lee², Woojin Jun³, and Yoo-Hyun Lee¹

1Department of Food and Nutrition, The University of Suwon

2Korea Ginseng Corporation, Korea Ginseng Corporation Research Institute

3Department of Food and Nutrition, Chonnam National University

ABSTRACT Late-onset hypogonadism (LOH) is associated with a significant decrease in the testosterone levels result- ing from the reduced ability to synthesize testosterone in the Leydig cells as aging progresses. This study measured the testosterone levels after treating H2O2-stressed TM3 cells in the presence of human chorionic gonadotropin (hCG) with Eucommia ulmoides Oliver extracts (eu), Achyranthes japonica Nakai extracts (aj), or amixture of eu and aj extracts in the proportion of KGC08EA (1:3, 1:1, 3:1). KGC08EA (3:1) at concentrations of 1 to 500 μg/mL produced a significant concentration-dependent increase (up to 34 times (P<0.001)) in testosterone levels compared to the control group. In addition, among the testosterone synthesis enzymes, 17β-HSD1 and 3β-HSD4 showed significant increases in mRNA expression while both 5α-reductase2 and aromatase, such as testosterone degradation enzyme, was not in- creased significantly (P<0.05). In conclusion, KGC08EA (3:1) might bea health functional food material that can im- prove LOH by up-regulating the testosterone synthesis enzymes and increasing the testosterone levels significantly.

Key words: late-onset hypogonadism, Achyranthes japonica Nakai, Eucommia ulmoides Oliver, testosterone, TM3 cell

Received 17 June 2020; Accepted 18 September 2020

Corresponding author: Yoo-Hyun Lee, Department of Food and Nutrition, The University of Suwon, Hwaseong, Gyeonggi 18323, Korea

E-mail: [email protected], Phone: +82-31-229-8194

Author information: Seokho Kim (Graduate student), Jeong Yoon Lee (Graduate student), Sohyuk Kim (Graduate student), Woojin Jun (Professor), Yoo-Hyun Lee (Professor)

서 론

남성은 30세 이후 노화가 진행되면서 테스토스테론의 분 비량이 매년 약 1~2% 비율로 감소하는데(Decaroli와 Ro- chira, 2017), 테스토스테론 수준이 현저하게 떨어진 40세 이상 중년 남성의 약 2~6%가 남성 갱년기라고 알려진 후기 발현 남성 성선기능저하증(Late-onset hypogonadism, LOH)으로 이어진다(Dudek 등, 2017). 남성 갱년기 환자들 은 정자생성, 성 기능 저하, 인슐린 저항성 증가, 내장지방 증가, 근육량 및 골밀도 감소에 따른 신체적 기능 저하, 지적

활동, 인지능력, 공간 지각력의 감소 및 피로, 신경과민, 우 울증 등을 수반하는 기분 변화와 같은 임상적 증상들이 동반 된다(Schubert와 Jockenhövel, 2005). 이러한 남성 갱년기 증상들은 남성의 신체적, 정신적, 사회적 면에서 건강과 관 련된 삶의 질을 현저하게 저하시킨다(Wang 등, 2008).

테스토스테론의 합성은 고환의 Leydig cell에서 황체호 르몬(luteinizing hormone, LH) 자극, steroidogenic acute regulatory protein(StAR protein), 콜레스테롤 측쇄분해 효소(cholesterol side-chain cleavage enzyme, P450scc) 및 여러 테스토스테론 합성 관련 효소에 의해 이루어지며 (Zirkin과 Papadopoulos, 2018; Papadopoulos와 Miller, 2012; Payne와 Hales, 2004), LH 자극을 통해 조절되는 StAR protein은 콜레스테롤을 세포의 미토콘드리아 내부로 이동시키며 미토콘드리아 내부로 이동한 콜레스테롤은 콜 레스테롤 측쇄 분해효소에 의해 테스토스테론 합성을 시작 하게 된다(Papadopoulos와 Miller, 2012). 이후 17,20-

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desmolase(CYP17A1), 3β-hydroxysteroid dehydrogenase(3β-HSD), 17β-hydroxysteroid dehydrogenase(17β -HSD) 등의 테스토스테론 합성 효소들에 의해 최종적으로 테스토스테론을 생성한다(Payne와 Hales, 2004).

노화가 진행되면 Leydig cell의 수와 기능이 감소하고 steroidogenesis 관련 효소의 발현이 저하되면서 테스토스 테론의 분비가 현저하게 떨어지게 되는데, 이는 남성갱년기 로 이어지는 주요 원인이 된다(Midzak 등, 2009). 한편, 남 성갱년기 증상을 개선하기 위한 일반적인 치료 방법으로 인 공적인 테스토스테론을 주사하게 되는데, 장기적인 테스토 스테론 주사는 전립선암, 전립선비대증 및 심혈관질환 등의 부작용을 유발할 수 있다는 연구 결과가 보고되어 있다(De- caroli와 Rochira, 2017). 이러한 이유로 남성 갱년기 증상 을 개선하기 위해 보다 안전하고 지속적으로 테스토스테론 을 생성할 수 있는 천연물 소재를 찾는 것이 중요하다.

우슬로 알려진 Achyranthes japonica Nakai는 쇠무릎 (Achyranthes bibentate)의 뿌리이며 전통적으로 한국, 일 본, 중국에서 사용하고 있는 식용 소재이다(Marcone 등, 2003). 우슬의 주요 성분은 saponins, inokosterone, ec- dysterone, oleanolic acid, bisdesmoside 등이 있으며(He 등, 2017) 여러 연구에서 이 성분들은 항균(Jung 등, 2007), 항산화(Park 등, 2013), 항염증 및 골관절염 개선(Lee 등, 2012) 효과가 보고되어 있고 건강기능식품 소재로 사용되고 있다. 두충으로 알려진 Eucommia ulmoides Oliver는 중국에 분포하고 있으며 중국 전통 의학에서 사용되어 왔다(Wang 등, 2019). 두충의 생리 활성 주요 성분으로는 chlorogenic acid(CGA), rutin, quercetin, iridoid, α-linolenic acid 등 이 있으며(Li 등, 2019) 여러 연구에서 인슐린 저항성 개선 (Jin 등, 2010), 신경 보호를 통한 알츠하이머 질환의 개선 (Kwon 등, 2013), 뼈 손실 예방(Zhang 등, 2014), 항염증 및 골관절염 개선(Xie 등, 2015) 등의 효과가 보고되고 있 다. 본 연구에서는 두충 추출물, 우슬 추출물 또는 두충과 우슬의 복합추출물이 마우스의 Leydig cell인 TM3 cell에 서 테스토스테론 합성을 증가시킬 수 있는지 확인하였으며 남성 갱년기를 개선하기 위한 기능성 소재 개발의 가능성 유무를 검토하였다.

재료 및 방법

추출물과 복합물의 제조

두충(3 kg)과 우슬(2 kg)은 경일약재(Geumsan, Korea) 에서 구입하여 30% 에탄올로 추출하였다. 두충 추출물은 10~12배의 30% 에탄올을 이용하여 10시간씩 2회 추출 후 Whatman No.1(Whatman International Ltd., Maidstone, UK)으로 여과하였으며, 우슬 추출물은 10~12배의 30% 에 탄올을 이용하여 4시간씩 2회 추출 후 Whatman No.1 (Whatman International Ltd.)으로 여과하였다. 여과된 추 출물은 감압농축(Rotavapor^Ⓡ R-220 Pro, Buchi, Flawil,

Switzerland) 후 분무건조(SD PILOT2010, Ein system, Seoul, Korea)하였다. 두충, 우슬의 건조 수율은 각각 11%, 45%였다. 또한 두충 추출물(eu)과 우슬 추출물(aj)의 복합 물은 1:3, 1:1, 3:1 비율(w/w)로 제조하여 실험에 사용했으 며 eu와 aj의 복합추출물은 KGC08EA로 명명하였다.

세포배양

마우스 고환의 Leydig cell인 TM3 cell은 ATCC(Manas- sas, VA, USA)로부터 분양 받았으며, 배지는 10% fetal bovine serum(Gibco, Grand Island, NY, USA) 및 1% an- tibiotic antimycotic solution(Corning Cellgro, Manassas, VA, USA)를 첨가한 high glucose DMEM media(Hyclone, Logan, UT, USA)를 사용하여 37°C, 5% CO2 조건에서 배 양하였다.

Cell viability assay

TM3 cell을 96-well plate에 10⁴ cells/well로 분주하고 24시간동안 배양하였다. 24시간 후 배지를 제거하고 PBS (pH 7.4)로 1회 세척한 다음 농도별 추출물을 첨가하여 다 시 24시간동안 배양하였다. Cell viability assay를 위해서 PrestoBlue^TM cell viability reagent(Invitrogen, Carls- bad, CA, USA)를 사용하여 흡광도 570 nm에서 측정(Epoch, BioTek Instruments, Winooski, VT, USA)하였다. Cell viability 계산식은 다음과 같다.

Cell viability (%)＝

실험군 흡광도－Blank의 흡광도 Control군 흡광도－Blank의 흡광도 ×100

테스토스테론 측정

TM3 cell을 96-well plate에 80~90%의 밀도에 이르도 록 배양한 후, 배지를 제거하고 PBS(pH 7.4)로 1회 세척한 다음 serum free 배지에 0.05 IU/mL의 human chorionic gonadotropin(hCG)(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 과 농도별 각 추출물을 처리하고 20시간 동안 배양한 후 200 μM의 H₂O₂(Sigma-Aldrich)를 가하여 4시간 동안 추 가 배양하였다. 이후 테스토스테론을 측정하기 위해 배양액 을 수거하고 testosterone ELISA kit(Abcam, Cambridge, MA, USA)을 사용하여 메뉴얼에 따라 assay를 실행하였다.

값은 curve expert 1.3(Hyams Development, Starkville, MS, USA)을 사용하여 계산하였다.

Real-time PCR을 이용한 테스토스테론 관련 효소의 mRNA 측정

TM3 cell을 6-well plate에 80~90%의 밀도에 이르도록 배양한 후, 위의 과정과 동일하게 처리하였다. 이후 RNAiso Plus(Takara Bio Inc, Kusatsu, Japan)를 사용하여 세포를 수거하였으며 mRNA를 추출하고 cDNA를 합성하였다. In- ternal standard는 β-actin을 사용하였고, Light Cycler 96

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*** * *

0 20 40 60 80 100 120 140

aj eu 1:3 1:1 3:1

Percent of control (%) .

0 50 125

250 500

KGC08EA (eu:aj)

Fig. 1. Effect of various extracts on TM3 cell viability. TM3 cells were treated with 50~500 μg/mL of eu (Eucommia ulmoides Oliver), aj (Achyranthes japonica Nakai), KGC08EA (1:3, 1:1, 3:1) for 24 h. Data are presented as mean±standard deviation (SD). Differences were considered statistically significant at ^*P<

0.05, ^**P<0.01, ^***P<0.001 versus 0 μg/mL extract (n＝3).

Table 1. Oligonucleotide primers used for quantitative RT-PCR

Forward (5′→3′) Reverse (5′→3′) 3β-HSD4

17,20-Desmolase 17β-HSD1 Aromatase 5α-Reductase2 β-Actin

GTGATATGAAGAGGGAGAGGAC ACGCTCATCTTCAAGTCAGTAAT ACAATGGGCAGTGATTAC

ACAATAAGATGTATGGAGAGTTCA GCAAGCCTATTACCTGGTT

AATCGTGCGCGTGACATCAA

AAGACAAGTTGGACAGAGTGT GGTCTGTATGGTAGTCAGTATCG GTGGTCCTCTCAATCTCTTC GCTTGAGGACTTGCTGATAA AGAAGACACCGACGCTAA GCTCGTTGCCAATAGTGA

(Roche, Mannheim, Germany)을 사용하여 95°C에서 30 초, annealing&extension은 58°C에서 30초로 27 cycle을 반복한 후 target gene의 mRNA 변화를 검토하였다. 본 실 험에서 사용된 각 primer 서열은 Table 1에 나타내었다.

통계분석

실험 결과의 통계 처리는 SPSS(Ver.20, IBM Corpora- tion, Armonk, NY, USA) 통계 프로그램을 사용하여 각 실험 군의 평균±표준편차로 표시하였다. 또한 실험군 간의 유의 성을 확인하기 위해 일원배치 분산분석(One-way ANOVA) 과 Duncan’s multiple range test의 사후검증을 실시하였 으며, 두 그룹 간의 비교에는 t-test를 사용하였다. 모든 결 과는 P<0.05의 유의확률에서 통계적 차이가 있다고 판단하 였다.

결과 및 고찰

소재에 따른 cell viability

실험에 사용할 두충 추출물(eu)과 우슬 추출물(aj), 두 소 재의 복합추출물인 KGC08EA(eu:aj)의 유효한 농도를 정하 기 위해 TM3 cell을 96-well plate에 10⁴ cells/well로 24 시간 동안 배양한 후 0, 50, 125, 250, 500 μg/mL의 농도별 eu, aj, 1:3, 1:1, 3:1 비율의 KGC08EA(eu:aj)를 첨가하여 다시 24시간 배양한 다음 cell viability를 측정한 결과는 Fig. 1과 같다. 각 소재의 농도별 추출물을 처리한 군 중에 추출물을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 유의적으로 cell viability를 감소시킨 소재는 없었다. 이후 실험에서 각 소재 에 따른 남성 갱년기 개선 가능성을 검토하기 위해 TM3 cell에 500 μg/mL 농도 이하의 각 추출물을 처리하고 테스 토스테론 변화 및 관련 mRNA 변화를 검토하였다.

H2O2와 hCG를 처리한 TM3 cell에서 소재 처리에 따른 테스 토스테론의 변화

남성 갱년기 in vitro 모델을 확립하기 위해 Fig. 2와 같이 실험을 수행하였다. 남성 갱년기 in vitro 모델은 여러 연구 에서 Leydig cell에 산화적 스트레스를 가하여 테스토스테 론 합성을 억제하는 방법으로 구현되었다(Tsai 등, 2003;

Lee 등, 2016). 본 연구에서는 여러 연구에서 사용되었던 농도 범위의 H2O2를 처리하여 TM3 cell의 각 소재 처리에 따른 테스토스테론 수준 변화를 검토하였으나, ELISA as-

say에서는 H₂O₂와 hCG를 처리하지 않은 TM3 cell과 H₂O₂ 만을 처리한 TM3 cell의 테스토스테론의 유의적인 차이를 확인할 수 없었을 뿐만 아니라 소재별 유의적인 테스토스테 론 변화도 확인할 수 없었다(Fig. 2A). Fig. 2B는 TM3 cell 에 hCG(0.05 IU/mL)를 처리한 후 테스토스테론 수준을 측 정한 결과 이며 hCG 처리군의 테스토스테론 농도가 0.6 ng/

mL로 Fig. 2A의 테스토스테론 수준과 비교하여 10배 이상 의 수준을 보였다(P<0.01). 또한 Fig. 2B의 hCG 존재 하에 소재를 처리하지 않은 control군과 비교하여 eu군 및 KGC 08EA(1:1), KGC08EA(3:1)가 서로 유의적인 차이를 보였 으며, 이것은 각각 eu군이 1.6배(P<0.01), KGC08EA(1:1) 는 1.3배(P<0.05), KGC08EA(3:1)은 1.4배(P<0.05) 증가 한 것으로 나타났다.

여러 연구에 따르면 hCG는 Leydig cell을 자극하여 테스 토스테론의 분비를 유도하는 LH와 LH receptor를 공유하 고(Riccetti 등, 2017), cAMP/PKA pathway를 통해 테스 토스테론 합성의 조절단계 역할을 하는 StAR protein 및 P450scc의 발현을 증가시킴으로써 콜레스테롤 전구체 및 테스토스테론 수준을 증가시키는 것으로 알려져 있다(Stoc- co와 Clark, 1996). 세포에서 테스토스테론의 수준을 측정 할 때, LH 혹은 hCG를 처리함으로써 Leydig cell의 테스토 스테론 수준을 유의적으로 증가시킨다는 보고가 있으며 (Opuwari와 Monsees, 2015), 본 연구에서도 hCG를 처리

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0 0.03 0.06 0.09 0.12 0.15

- - aj eu 1:3 1:1 3:1

KGC08EA (eu:aj)

Testosterone (ng/mL) .

A

+ H₂O₂

Sample (500 μg/mL)

*

**

0 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5

- - aj eu 1:3 1:1 3:1

KGC08EA (eu:aj)

B

Sample (500 μg/mL)

+ hCG

**

***

*

***

**

***

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45

50 ㎍/mL 125 ㎍/mL 250 ㎍/mL 500 ㎍/mL

Cont (-) aj

eu 1:3

1:1 3:1

C

KGC08EA (eu:aj) + hCG

+ H2O2

50 μg/mL 25 μg/mL 250 μg/mL 500 μg/mL

Fig. 2. Effect of various extracts on testosterone production in H2O2 or hCG-stimulated TM3 cells. (A) H2O2 (200 μM). (B) Human chorionic gonadotropin (hCG) stimulated TM3 cells were treated with 500 μg/mL of eu (Eucommia ulmoides Oliver), aj (Achyranthes japonica Nakai), KGC08EA (1:3, 1:1, 3:1) for 24 h. (C) H2O2 and hCG stimulated TM3 cells were treated with 50~500 μg/mL of eu (Eucommia ulmoides Oliver), aj (Achyr- anthes japonica Nakai), KGC08EA (1:3, 1:1, 3:1). Data are pre- sented as mean±standard deviation (SD). Differences were considered statistically significant at ^*P<0.05, ^**P<0.01. ^***P<0.001 versus control (n=3).

하여 테스토스테론의 수준이 유의적으로 높아지는 결과를 얻었다.

노화로 인한 LOH는 대부분 높은 LH 수치와 낮은 테스토 스테론 수준을 특징으로 하며 여러 자극에 Leydig cell이 지속적으로 노출되고 세포가 손상되어 테스토스테론 분비 가 감소한다(Decaroli와 Rochira, 2017). 남성갱년기 in vitro 모델에서 활성산소종 중 하나인 H2O2의 처리는 Leydig cell의 P450scc 및 StAR의 발현을 억제함으로써 콜레스테 롤 전구체 및 테스토스테론 수준을 감소시키며 여러 연구에 서 사용된 바 있다(Tsai 등, 2003; Lee 등, 2016). 본 실험에 서 H2O2 200 μM의 단독처리로는 각 소재의 유의적 차이를 얻을 수 없었으므로 hCG와 같은 농도의 H2O2를 처리하여 각 소재의 효과를 검토하였다. Fig. 2C는 hCG와 50, 125, 250, 500 μg/mL의 각 농도별 추출물을 처리하여 20시간 동안 배양하고 200 μM의 H₂O₂를 가하여 4시간 동안 추가 배양하였다. 그 결과, control군의 테스토스테론 수준과 비 교하여 농도별 eu군에서 최대 38배(P<0.001)의 유의적인 테스토스테론 증가율을 보였다. eu와 aj의 복합추출물인 KGC08EA의 경우 eu의 비율이 증가할수록 테스토스테론 수준이 유의적으로 증가하는 경향을 보였는데 250 μg/mL의 1:3, 1:1, 3:1의 KGC08EA는 각각 14배, 23배, 34배의 테스 토스테론 증가율을 보였고(P<0.001), 500 μg/mL의 1:1, 3:1의 KGC08EA는 각각 10배(P<0.01), 25배(P<0.001)의 테스토스테론 증가율을 보였다. 결론적으로 eu군과 3:1의

KGC08EA에서 aj군 및 1:3, 1:1의 KGC08EA에 의한 테스 토스테론의 유의적인 증가보다 높았다. 본 결과에서 테스토 스테론의 합성과 관련된 기전을 검토하기 위해 real-time PCR을 이용하여 각 소재 처리에 따른 테스토스테론 관련 mRNA 발현을 측정하였다.

H2O2와 hCG를 처리한 TM3 cell에서 소재 처리에 따른 테스 토스테론 관련 mRNA 변화

Fig. 2의 결과, H2O2와 hCG를 처리한 TM3 cell에서 추출 물을 처리하지 않은 control군과 비교했을 때 추출물을 처리 한 군은 250 μg/mL 및 500 μg/mL의 농도에서 테스토스테 론 수준이 일정한 경향성을 보이며 유의적으로 증가하였다.

이에 테스토스테론 증가 효과를 보이며 본 실험의 고농도로 사용한 500 μg/mL 추출물의 테스토스테론 관련 mRNA 발 현을 확인하고자 테스토스테론 합성에 관여하는 17,20-desmolase, 17β-HSD1, 3β-HSD4와 분해에 관여하는 5α-re- ductase2, aromatase의 발현을 검토하였다(Fig. 3).

TM3 cell에 hCG(0.05 IU/mL)와 500 μg/mL의 각 추출 물을 처리하여 20시간 동안 배양하고 200 μM의 H₂O₂를 가하여 4시간 동안 추가 배양하였다. 테스토스테론 합성 관 련 mRNA의 발현 결과, 17,20-desmolase의 경우 control 군을 포함한 각 추출물을 처리한 군에서 eu군만이 유의적으 로 증가하였으며 17β-HSD1 및 3β-HSD4의 경우 control 군과 비교하여 eu군, 3:1의 KGC08EA군 순으로 유의적인

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17,20-desmolase

b b b

a

b b

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5

Cont (-) aj eu 1:3 1:1 3:1

KGC08EA (eu:aj)

Relative mRNA level .

Sample (500 μg/mL) +hCG, H2O2

17β-HSD1

b c c a

bc c

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5

Cont (-) aj eu 1:3 1:1 3:1

KGC08EA (eu:aj)

Relative mRNA level

3β-HSD4

d cd

a

c bc

b

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5

Cont (-) aj eu 1:3 1:1 3:1

KGC08EA (eu:aj)

5α-reductase2

b b bc

a

c b

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5

Cont (-) aj eu 1:3 1:1 3:1

KGC08EA (eu:aj)

Aromatase

ab b ab ab

b a

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5

Cont (-) aj eu 1:3 1:1 3:1

KGC08EA (eu:aj)

Fig. 3. Effect of various extracts (500 μg/mL) on testosterone related mRNA expression in H2O2 and hCG-stimulated TM3 cells. H2O2 (200 μM) and human chorionic gonadotropin (hCG)- stimulated TM3 cells were treated with 500 μg/mL of eu (Eucom- mia ulmoides Oliver), aj (Achyranthes japonica Nakai), KGC08EA (1:3, 1:1, 3:1). Data are presented as mean±standard deviation (SD). Differences were considered statistically significant at P<

0.05 (n=3).

증가를 보였다(P<0.05). 반면에 테스토스테론 분해 관련 mRNA의 발현 결과, control군과 비교하여 3:1의 KGC08EA 는 5α-reductase2와 aromatase의 발현에 영향을 미치지 않았다. 그러나 eu군과 aj군을 살펴보면 aj군은 5α-reduc- tase2 및 aromatase의 발현을 유의적으로 감소시켰으며 eu군은 5α-reductase2 발현을 유의적으로 증가시켰다(P<

0.05).

여러 스테로이드 호르몬과 마찬가지로 테스토스테론은 Leydig cell에서 StAR protein 및 P450scc에 의해 콜레스 테롤로부터 합성을 시작하게 되는데 콜레스테롤은 StAR protein 및 P450scc와 17,20-desmolase, 17β-HSD1, 3β- HSD4 등의 효소들에 의해 프로게스테론 및 안드로스테네디 온을 거쳐 최종적으로 테스토스테론을 생성한다(Payne와 Hales, 2004). 반면 5α-reductase2는 합성된 테스토스테 론을 dihydrotestosterone(DHT)로 전환하며 DHT 증가는 전립선비대증을 유발하는 원인으로 알려져 있다(Marks 등,

2008; Roehrborn, 2008). 또한 aromatase는 에스트라디 올로 전환시키는데(Dudek 등, 2017), aromatase의 높은 활성은 뇌하수체의 LH 분비를 억제하고 남성의 테스토스테 론 분비를 감소시킨다(Decaroli와 Rochira, 2017).

즉, Fig. 3의 결과에서 eu군과 3:1의 KGC08EA는 테스토 스테론 합성 관련 mRNA 발현을 유의적으로 증가시켰으며, 이러한 결과는 테스토스테론의 증가로 이어졌다고 보인다.

eu군의 경우 가장 유의적인 테스토스테론 증가와 합성 관련 mRNA 발현 증가를 보였으나 eu군은 5α-reductase2의 발 현을 증가시킨 것으로 나타나 테스토스테론 합성뿐만 아니 라 분해에도 관여하는 것으로 생각된다. 두충 추출물은 성 스테로이드 수용체인 안드로겐과 에스트로겐 수용체 사이 에 상호 활동적인 활성화에 의해 남성호르몬뿐만 아니라 여 성호르몬의 활성과도 관련이 있다는 보고가 있어(Ong와 Tan, 2007), 이러한 테스토스테론 분해에 관여한다는 결과 를 뒷받침한다. 반면 aj는 5α-reductase2의 발현을 억제하

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는데, 3:1 비율의 eu:aj 복합추출물(KGC08EA)의 경우 eu 군과 대조적으로 5α-reductase2의 유의적인 증감 없이 테 스토스테론 합성 관련 mRNA만을 증가시켰다. 결론적으로 남성 갱년기를 개선하기 위한 기능성 소재로서 eu보다는 KGC08EA(3:1)를 제안하며 이후 동물실험을 통한 추가적 인 연구와 테스토스테론 합성 효소의 상위 기전에 대한 보완 연구가 필요하다고 보인다.

요 약

본 연구에서는 두충 추출물(eu)과 우슬 추출물(aj) 및 eu:aj 의 비율이 1:3, 1:1, 3:1인 복합추출물(KGC08EA)의 남성 갱년기 개선을 위한 테스토스테론 합성 능력을 평가하기 위 해 남성 갱년기 in vitro 모델을 설정하고 테스토스테론 수준 과 그 기전을 검토하였다. 정상적인 TM3 cell에서 각 소재 는 500 μg/mL 농도 이하에서 cell viability를 감소시키지 않았다. Leydig cell에 산화적 스트레스를 가하여 테스토스 테론 합성을 억제하기 위해 활성산소종인 H₂O₂(200 μM)를 가한 TM3 cell에서 소재를 처리하지 않은 control군과 소재 를 처리한 군들 간의 테스토스테론 수준의 유의적인 차이를 확인할 수 없었던 반면 테스토스테론 수준을 높이는 hCG를 처리하였을 때 테스토스테론 수준이 hCG를 처리하지 않은 군과 비교하여 10배 이상 유의적으로 증가하였고(P<0.01), hCG 존재 하에서 control군과 eu, aj군 및 KCG08EA군들 이 서로 유의적인 차이를 나타냈다. 이후 테스토스테론 수준 의 유의적인 차이를 확인할 수 있었던 hCG 존재하에서 같은 농도의 H2O2를 처리하여 남성갱년기 in vitro 모델을 설정하 고 각 소재에 따른 테스토스테론 수준을 측정한 결과, 소재 를 처리하지 않은 control군과 비교하여 eu군과 3:1의 KGC08EA군에서 각각 최대 38배, 34배의 테스토스테론 증 가율을 보였으며 250 μg/mL 및 500 μg/mL의 각 추출물 처 리에 따른 테스토스테론 농도가 일정한 경향성을 보이며 유 의적으로 증가하였다(P<0.001). 같은 조건으로 500 μg/mL 농도의 각 소재별 테스토스테론 합성에 관여하는 mRNA 발 현을 검토한 결과, control군과 비교하여 3:1의 KGC08EA 는 17β-HSD1, 3β-HSD4의 발현을 유의적으로 증가시켰 으며 eu군 또한 17,20-desmolase, 17β-HSD1, 3β-HSD4 의 발현을 유의적으로 증가시켰다. 반면에 분해에 관여하는 5α-reductase2, aromatase의 mRNA 발현을 검토한 결과, aj군은 5α-reductase2와 aromatase의 발현을 유의적으로 감소시켰으며 eu군은 5α-reductase2의 발현을 증가시켰 다. 이러한 결과는 eu군이 KGC08EA(3:1)보다 테스토스테 론 및 테스토스테론 합성 관련 mRNA 발현을 가장 유의적으 로 증가시켰지만, 테스토스테론 분해와 관련한 5α-reduc- tase2의 발현도 증가시켰다. 5α-reductase2는 DHT를 증 가시키고 이는 전립선비대증을 유발할 수 있다. 반면 eu:aj 의 복합 추출물인 KGC08EA(3:1)군의 경우 aj가 eu군에서 나타난 5α-reductase2의 발현을 억제하면서 5α-reductase2

의 유의적 증감 없이 테스토스테론 합성관련 mRNA 발현만 을 관여한다. 결론적으로 3:1의 KGC08EA가 남성갱년기 개 선을 위한 기능성 소재로서 적합하다고 여겨지며 이후 동물 실험을 통한 추가적인 연구와 테스토스테론 합성 효소의 상 위 기전에 대한 보완 연구가 필요하다고 생각한다.

감사의 글

본 연구는 한국인삼공사의 연구비 지원으로 수행되었습니 다.

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