목 차
목 차 … … … .ⅰ List of tables … … … ...ⅲ List of figures … … … ⅳ 국문요지 … … … ⅴ
Ⅰ. 서론 … … … . . 1
Ⅱ. 실험 재료 및 방법 . … … … ...4
1. 시료추출 … … … ... 4
2. 세포배양 … … … ... 7
3. 실험재료 … … … ...7
4. 실험방법 … … … ...8
1) 계대배양 … … … 8
2) 시료처리 … … … 9
3) MTT assay … … … 9
4) Caspase-3 activity … … … ...11
5) Protein assay … … … ... 15
5. 자료의 처리 … … … ..15
Ⅲ. 실험결과 및 고찰 … … … . 14 1. 버섯류의 첨가가 암세포의 성장에 미치는 영향 … … … . 14 1) 버섯 추출액의 첨가량에 따른 HT-29 세포의 성장 … … … . .14
2) 버섯 추출액의 첨가 후 배양 시간에 따른 HT-29 세포의 성장 … … … . 18
3) 버섯 추출액의 첨가량에 따른 Caco-2 세포의 성장 … … … ... 23 4) 버섯 추출액의 첨가량에 따른 SNU484 세포의 성장 … … … … ... 25 2. 버섯류의 첨가가 자가사멸에 미치는 영향 … … … ...30 1) 버섯 추출액의 첨가량에 따른 HT-29 세포의 자가사멸 … … … … 3 0 2) 버섯 추출액의 첨가량에 따른 SNU484 세포의 자가사멸 … … … 3 3
Ⅳ. 결론 … … … . 35
Ⅴ. 참고문헌 … … … . 37
Abstract
List of Tables
Table 1. 버섯 추출액의 첨가 수준에 따른 HT-29 세포 성장 Table 2. 버섯 추출액의 첨가 후 시간별 HT-29 세포 성장 Table 3. 버섯 추출액의 첨가 수준에 따른 SNU484 세포 성장
List of Figures
Figure 1. 버섯시료 전처리 과정 Figure 2. CPP 분석원리
Figure 3. Caspase-3 assay procedur
Figure 4. 버섯 추출액의 첨가 수준에 따른 HT-29 세포 성장의 대조군에 대한 비율
Figure 5. 버섯 추출액의 첨가 후 배양 시간별 HT-29 세포 성장의 대조군에 대한 비율
Figure 6. 버섯 추출액의 첨가 수준에 따른 Caco-2 세포 성장의 대조군에 대한 비율
Figure 7. 버섯 추출액의 첨가 수준에 따른 SNU484 세포 성장의 대조군 에 대한 비율
Figure 8. 차가버섯 추출액의 첨가 수준에 따른 SNU484 세포 성장의 대조군에 대한 비율
Figure 9. HT-29 세포에서 caspase-3 activity/protein Figure 10. SNU484 세포에서 caspase-3 activity/protein
국 문 요 지
최근에 부작용이 심한 화학 항암제 대신 치료제로 사용할 수 있고, 현대인의 불치병으로 알려진 AIDS, 치매, 악성신생물의 예방 및 치료에 적용할 수 있는 생리활성물질을 식물체에서 찾아보려는 연구가 많이 이루어지고 있다. 식물체 중 특히 버섯은 약리 효과를 갖는 것으로 알려져 있어 본 연구에서는 차가버섯, 표고버섯, 새송이버섯의 수용성 물질이 인간의 위암세포 SNU484와 두 종류의 대장암세포 HT-29, Caco-2 의 증식과 자가사멸에 미치는 영향을 관찰하기 위한 실험을 하였다.
자가사멸은 caspase-3 활성을 통하여 측정하였으며, 버섯에서 수용성 물질을 추출하여 암세포에 대하여 수준별, 첨가 후 시간별로 처리하여 암세포에 대한 항암 효과를 알아보고자 하였다.
본 연구 결과를 요약하면 다음과 같다.
1. 차가버섯, 표고버섯, 새송이버섯 추출액 20 ㎕와 40 ㎕를 HT-29 세포 에 첨가하고 48시간 배양하였을 때 세 종류의 버섯 첨가군 모두에서 세포증식이 유의적으로 억제되었다(p<0.05). 20 ㎕ 첨가시 세 종류의 버섯 모두에서 대조군에 비하여 세포 수가 유의적으로 적었으며, 그리고 40 ㎕ 첨가시는 20 ㎕에 비하여 유의적으로 세포증식을 억제하 는 것으로 나타났다.
2. 버섯 추출액 20 ㎕ , 80 ㎕ , 160 ㎕ 첨가 후 24시간, 48시간 , 72시간 , 96시간의 경과함에 따라 HT-29 세포증식의 경우에서 24시간 경과에서 는 대조군에 비해 오히려 다소 증가하는 경향을 보였으나 48시간 경과 에서는 차가버섯과 새송이버섯에서 대조군에 비해 유의적으로 억제 되었고 72시간과 96시간 경과에서는 대조군에 비해 버섯의 첨가량이 높을수록 세포증식이 억제 되었고 특히 96시간 경과에서는 첨가량이 높은 처리군에서 세포 증식이 더 큰 폭으로 억제되었다.
3. 차가버섯, 표고버섯, 새송이버섯 추출액 20 ㎕와 40 ㎕시 Caco-2 세포에 첨가하여 48시간 후 세포 증식이 세 종류의 버섯 첨가군에서 억제되었다 . 20 ㎕ 첨가보다는 40 ㎕ 첨가에는 세포증식이 훨씬 억제 되었으며 40 ㎕ 첨가 시 차가버섯의 경우는 대조군의 59.3%로 표고 버섯은 39.7%, 새송이버섯은 35.4%로 감소하였다.
4. 위암세포인 SNU484에 버섯 추출액을 20 ㎕, 40 ㎕ , 80 ㎕ , 160 ㎕ , 240
㎕, 320 ㎕첨가하여 48시간 배양하였을 때 차가버섯 처리군에서 세포 의 증식이 첨가량에 따라 매우 유의적으로 억제 되었으나(p<0.05), 표 고버섯과 새송이버섯을 처리한 군에서는 세포증식이 억제됨을 나타내 지 않았다. 차가버섯 처리군에서 보면 20 ㎕의 첨가에서 대조군은 56.14%로 감소하였고 240 ㎕ 이상의 첨가에서는 세포가 거의 보이지 않을 정도였다.
5. 20 ㎕ , 40 ㎕ , 80 ㎕ , 160 ㎕, 240 ㎕로 시료를 처리한 HT-29 세포의 경우 세 종류의 버섯 처리군에서 첨가량이 많아짐에 따라 caspase-3 활성이 증가함을 나타내었다.
6. 20 ㎕ , 40 ㎕ , 80 ㎕ , 160 ㎕, 240 ㎕ , 320 ㎕로 시료를 처리한 SNU484 세 포의 경우 세 종류의 버섯 처리 군에서 첨가량이 많아짐에 따라 caspase-3 활성이 증가함을 나타내었다. 특히 차가버섯의 처리군에서 caspase-3 활성이 큰 폭으로 증가함을 나타냈다.
대장암 세포인 HT-29에 버섯 추출액을 첨가하였을 때 20 ㎕과 40 ㎕을 첨가하고 48시간 배양하였더니 첨가 수준의 증가에 따라 세포 증식이 억제됨을 알 수 있었다. 이들 세 종류의 버섯을 첨가하고 24, 48, 72, 96시간 배양하였을 때 시간의 경과함에 따른 HT-29 세포 증식에서 시료처리 후 24시간 이후부터 시간이 경과할수록 암세포 증식이 억제 됨을 볼 수가 있었다. 다른 종류의 대장암 세포인 Caco-2에 버섯 추출 액을 20 ㎕와 40 ㎕ 첨가한 경우에서도 첨가 수준이 증가함에 따라 암세포 증식이 억제됨을 볼 수가 있었다. 따라서 대장암 세포에 세 종류의 버섯 모두가 암세포의 증식을 억제함을 알 수 있었다. 위암 세포 인 SNU484의 경우에서는 표고버섯과 새송이버섯의 첨가 수준이 많아 져 도 암세포의 증식 억제효과를 볼 수가 없었으나, 차가버섯의 첨가 농 도가 높아짐에 따라 비례적으로 암세포의 증식이 감소하는 효과를 나 타내었다.
Caspase-3 활성이 버섯 추출액의 첨가에 따라 SNU484 세포의 활성 이 증가함을 나타내었다 . 특히 차가버섯의 활성이 가파르게 증가하여 위암세포의 자가사멸에 탁월한 효능이 있음을 알 수가 있다. 인간의 대장암 세포인 HT-29 세포의 자가사멸에서 세 종류의 버섯 첨가가 동일 첨가량에서 거의 동일한 caspase-3 활성의 증가를 나타내었다 .
그러므로 본 실험에서 사용한 차가버섯, 표고버섯, 새송이버섯은 소화기계 암세포의 성장을 억제하고 특히 차가버섯은 위암세포의 증식을 매우 억제할 뿐 아니라 자가사멸을 유도하므로 항암물질로 개발할 필요 가 있을 것으로 사료된다.
Ⅰ. 서 론
오늘날 선진국을 중심으로 한 세계 각국에서는 천연물로부터 항암 효능을 갖는 생리활성물질을 찾는 연구가 활발하게 이루어지고 있으며, 국내에서도 우리 나라에 자생하는 채소나 약용식물 등에서 생리활성물질 을 추출하여 생체 내 면역반응효과를 살펴보는 연구가 많이 진행되고 있다1)-4).
생리활성물질은 종양세포에 작용하여 성장을 억제 또는 사멸 시키거 나, 생체의 면역반응을 강화시켜 종양에 대한 방어력을 높이며5-11), 생체 의 생물적 반응을 변화시켜 종양세포의 감수성을 높이고12)-13), 항암 약물 과 방사선 조사에 따르는 독성에 대한 피해를 경감 시키므로서15) 치료 효과를 증가시킨다.
여러 종류의 식물체 중에서 특히 버섯은 약리 작용을 갖는 것으로 알려져 있다. 우리 나라에서 고등 담자균류인 약용버섯과 식용버섯 등 여러 종류의 균사체로부터 다당류와 단백질로 구성된 고분자물질 등을 분리하여서 Sarcoma-180 복수암 세포에 항암 작용 및 항돌연변이성 효과 를 나타낸다는 보고가 있으나16)17), 실제 이러한 버섯추출물 성분을 가지고 생리활성에 대한 연구는 아직 부족한 실정이다.
차가버섯(Inonotus obliquos)은 북위 45°이상의 깊은 산에 자생하는 검은 자작나무에 덩이로 자생하는 버섯으로, 러시아 시베리아와 캐나다, 일본 홋카이도 지역에서 많이 발견된다. 차가버섯은 갓을 형성하지 않고 표면은 딱딱하고 검은 광택이 있으며 내부는 딱딱한 코르크질로 되어
있어 상황버섯과 모양이 비슷하다. 끓였을 때 색깔이 상황버섯은 황금 빛인데 반하여 차가버섯은 더 검은 황금 빛을 띄며 , 맛과 향기는 없는 편으로 담백하고, 자생하는 지역에서 소화기계 암과 당뇨병 환자에게 특히 우수한 치료효능을 보인다고 알려져 있다18).
표고버섯[Lentinus edodes (Berk.)sing.]는 송이과에 속하는 식용버섯 으로서 봄부터 가을에 걸쳐 참나무, 졸참나무, 너도밤나무 등 활엽수에 기생하며, 동아시아와 뉴질랜드 등에 많이 분포한다. 독균 중독, 간 경화 , 고혈압 등에 약리 효과가 있는 것으로 알려져 있다.
최근에 인공 재배하여 시판되고 있는 새송이버섯[Pleurotus eryngii (De Candolle ex Fries) Quel]은 주름버섯목 느타리과에 속하는 담자균 버섯으로 떡갈나무와 벚나무에 자생하며, 남유럽 일대가 원산지로 북아프리카 , 중앙아시아, 남러시아 등지에서 분포하며, 일본 , 중국, 대만, 한국 등의 아시아에서는 자생하지 않는 것으로 알려져 있다. 시판되는 새송이버섯은 국내에서 개발한 품종으로 유백색인 대의 크기에 비해 상대적으로 작은 갓이 대에 역삼각형으로 분화되어 있으며 갓의 맨 윗부분은 연회색 또는 연분홍색을 띄고 평편하며 생체조절기능, 성인병 예방, 노화억제, 항암작용 등의 약리 효과가 있는 것으로 알려져 있다.
신체를 구성하고 있는 기본 단위인 세포는 조직의 항상성을 유지 하기 위하여 세포분열과 죽음을 조절하는데 이 중에서 능동적인 죽음을 자가사멸(apoptosis) 또는 programmed cell death라고 한다. 이 과정에서 원하지 않거나 손상을 입은 세포는 제거되어진다19). 이러한 자가사멸은
자극에 의하여 활성화되어 계획한 대로 스스로 죽는 현상으로 세포의 괴사(necrosis)와는 달리 죽어 가는 세포의 내용물이 세포 외로 유리되지 않아 다른 세포에 손상을 주지는 않는다. 형태학적으로는 세포의 비중 감소와 세포막의 파괴 및 염색체의 응축과 더불어 사멸체(apoptotic body) 형성과 함께 식세포 작용을 거치는 작용을 의미하며, 생화학적으로는 염색체 DNA가 큰 조각에서 작은 조각으로 갈라지는 DNA fragmentation 을 의미한다20). 자가사멸은 ①유도(induction), ②신호조절(signal cascade modulation), ③실행경로의 활성화(commitment with activation of execution pathway)의 세 과정으로 진행된다 . 이러한 실행경로의 활성에서 caspase 효소가 관여된다21). 자가사멸 과정에서 caspase는 세포 사멸시 활성화되 는 중요한 단백질 분해 효소이므로 이 효소의 활성도를 측정하여 자가사 멸 정도를 파악할 수도 있다. 자가사멸의 저해와 억제는 종양의 성장과 퇴화, 국소 빈혈, 노인성치매, 뇌졸중, 간질 , 파킨슨병 등과 같은 퇴행성 신경질환, AIDS와 같은 면역계 질환, 심장질환 등 여러 종류의 발병 원인과 관련이 있는 것으로 알려져 있다22)-24).
여러 질병 중 특히 신생악성물인 암 발생은 암의 유전적 원인과 환경적인 원인이 복합적으로 작용하여 일어나는 것으로 알려져 있는데 WHO의 보고에 의하면 환경적 요인들로 인한 발생율이 85%로 유전적인 요인보다 크다고 한다. 환경요인 중에서도 식사 요인이 전체 암 발생의 35%를 차지한다고 알려져 있다. 한국인의 경우 여러 부위의 암 발생 에서 위암 발생율이 감소하는 추세이기는 하나 여전히 위암이 1위를 차지하고 있으며 최근에는 소화기계에서 대장암의 발생율이 증가하는
경향을 보이고 있다. 이는 염분의 과잉섭취, 고탄수화물 ・ 저단백 식사, 채소류 섭취 감소 등의 식이 요인에서 그 추세를 이해해 볼 수 있다25). 그러므로 천연물에서 생리활성물질을 찾아 이를 부작용이 심한 화학적 항암제 대신 치료제로 사용할 수 있고, 현대인의 불치병으로 알려진 AIDS나 치매의 치료에도 적용할 수 있을 것이며, 또한 식용 가능한 물질이면 식사에 포함시켜 만성질환의 발생을 예방해 볼 수도 있을 것이다.
따라서 본 연구에서는 항암 효능이 있다고 일반적으로 알려져 있는 버섯류가 위암과 대장암세포의 증식과 자가사멸에 미치는 영향을 살펴 봄으로서 버섯류의 소화기계 항암 효능을 확인하고자 하였다.
Ⅱ. 실험 재료 및 방법
1. 시료추출
본 실험에 사용한 시료는 차가버섯(Inonotus obliquos), 표고버섯 [Lentinus edodes(Berk.)sing.] 및 새송이버섯 [Pleurotus eryngii(De Candolle ex Fries)Quel]의 세 종류였다. 차가버섯은 러시아산으로 인천계양영농 버섯조합에서 구입하였고, 표고버섯은 강원도 원주 2000년산 말린 표고로 우리농산물 공판장에서 구입하였고, 새송이버섯은 현대백화점에 서 구입하였다 . 구입한 버섯은 Figure 1에서와 같이 차가버섯은 25 g을 증류수 200 ml에 넣고 90분간 가열하였으며 그 추출액을 따라 놓고 다시 200 ml의 증류수를 넣고 120분간 가열한 후 1차 추출액과 합하였다.
표고버섯은 증류수로 수세하여 불순물을 제거한 후 25 g을 증류수 100 ml에 넣고 60분간 가열하였고 새송이버섯도 증류수로 수세한 후 50 g을 증류수 200 ml에 넣고 60분간 가열하여 각각 차가버섯 150 ml, 표고버섯 78 ml, 새송이버섯 83 ml를 추출하였다. 이들 각 버섯을 Whatman filter paper(#2)로 여과하였으며 이를 eppendorf에 1 ml씩 담아 -40℃에서 6～8시간 진공냉동건조(freeze-dryer with concentrator : Lisin , Korea) 하였다. 완전 건조된 버섯 시료에 serum free medium 1 ml을 넣어 용해 시킨 후 sterile disposable syringe(acetate, 0.22 um, 25 mm)으로 여과 하여 사용하였다.
차가버섯 (25g) 표고버섯 (25g) 새송이버섯(50g) H₂O (200ml)
100℃, 90min
Residue 1차추출액
H₂O (200ml) 100℃, 120min
Residue 2차추출액
mix 차가버섯추출액(150ml)
Residue 1차추출액
(78 ml) H₂O (100ml) 100℃, 60min
1차추출액 (83 ml) H₂O (200ml) 100℃, 60min
Residue
Paper Filtration 시료여과액
Freezing Dry -40℃, 360min 농축시료
37℃ Serum free medium 농축시료액
Disposable syringe filtration
차가버섯 (0.17g/1ml)
표고버섯 (0.32g/1ml)
새송이버섯 (0.60g/1ml)
Figure 1. 버섯시료 전처리 과정
2. 세포배양
배양액은 90%의 Dulbecco's modified Eagles medium(DMEM/F12)과 10%의 FBS, 1%의 penicillin-streptomycin, 0.2%의 fungizone을 혼합하여 사용하였으며, 배양액은 pH7.4를 기준으로 하여 멸균된 HCl과 NaOH로 pH를 일정하게 조절하였다 . 세포의 배양은 Water-jacketed CO2 incubator (NAPCO, Japan)에서 37℃의 온도에서, 5% CO2와 95% air의 환경에서 이루 어졌다.
3. 실험재료
본 실험에서 사용한 세포는 두 종류의 대장암세포와 한 종류의 위암 세포 였다. 대장암 세포는 HT-29(human, adenocarcinoma, colon)과 Caco-2(human, adenocarcinoma, colon)로 한림대학교 식품영양학과에서 ATCC(American Type Culture Collection, U.S.A.)으로부터 구입한 것을 제공 받아 사용하였고, 위암세포 SNU484(human, adenocarcinoma, primary)로 한국세포주은행에서 구입하여 사용하였다. 본 실험에서 HT-29는 passage 161～ 168에서 , Caco-2는 passage 29～ 35에서, SNU484는 passage 18～ 21 에서 사용하였다.
세포 배양액인 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM/F12), fetal bovine serum(FBS), trypsin-EDTA, penicillin-streptomycin은 Bio/Whittaker (Maryland, U.S.A.)의 제품이었고, fungizone은 Gibco/BRL(Grand Island
U.S.A.)에서 3-(4,5)-dimetylthiazol-2yl-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide(MTT) 는 Sigma Chemical(st.Louis, U.S.A.)에서 구입하였으며 , iso-propyl alcohol은 Duksan Pure Chemical Co.(Korea)에서 구입하였고 , ApoAlert caspase-3 colorimetric assay kit는 Clontech Co.(U.S.A.)에서 구입하였고, Protein assay kit는 Bio-Rad Laboratories(U.S.A.)에서 구입하였다 . 세포 배양에 사용한 1회용 멸균 용기는 대부분 Corning과 Falcon (U.S.A.)의 제품이었다. 그 외 실험에 사용한 초자 기구들은 121℃에서 15분간 고압증기멸균 처리하여 사용하였다 .
4. 실험방법
1) 계대배양
T75 flask에 세포가 75～85% confluence되면 배양액을 제거한 뒤 phosphate-buffered saline(PBS) 1 ml로 monolayer를 2회 씻어내고, 세포를 T75 flask에서 떼어내기 위해서 trypsin-EDTA 1 ml를 처리하여 37℃에서 3～ 5분간 incubation한 뒤에 세포가 플라스크 바닥에서 떨어지는 것이 보이면 trypsin-EDTA을 제거하고 배양액 20 ml을 첨가하여 20 ml disposable syringe(20 ml; 18 gauge needle)로 세포와 배양액을 혼합 시 single cell suspension을 만들었다.이것을 1:10～ 1:20으로 배양액을 혼합한 후 35 mm dish에 2 ml씩 넣고 37℃ , 5% CO₂ , 95% air에서 배양하였다.
2) 시료처리
본 실험은 35 mm dish에서 세포가 75～85% confluence해지면 시행 하였고, FBS를 첨가하지 않아 영양성분이 없는 serum free medium(SFM) DMEM/F12을 2 ml씩 첨가하여 24시간 배양하였다. 24시간 후 배양액을 제거하고 PBS 1 ml로 씻어내고 dish당 SFM 2 ml을 분배한 뒤 버섯 추출 물을 실험 내용에 따라 필요한 양을 첨가하고 시료와 배양액이 골고루 섞이도록 dish를 잘 흔든 뒤 24～ 96시간 배양하였다 .
3) MTT assay
세포 수의 측정은 MTT assay법을 이용하였는데 이는 살아있는 세포 의 수를 측정할 수 있는 좋은 방법으로 알려져 있다. 이 방법은25) mitochondria dehydrogenase가 3-(4,5)-dimetylthiazol-2yl-2,5-diphenyl tetrazolium bromide를 환원시켜 푸른색 물질인 formazon을 만든다는 원리 에 기초한 것이다. PBS에 MTT 시약을 1 ml당 5 mg을 넣어 stock solution 을 만든 후 이 용액 1 ml당 SFM 19 ml을 넣고 20배 희석하여 working solution을 만들었다. 이 때 MTT 용액을 담은 용기는 햇빛을 차단하였다 . 시료를 첨가한 dish의 세포 수를 측정하기 위해 배양액을 제거한 후 PBS 로 씻고 MTT 용액 1 ml을 첨가한 후 37℃에서 3시간 배양하였다. 3시간 후 MTT 용액을 제거하고 PBS로 씻은 후 iso-propanol 1 ml을 첨가하여 세포를 녹였다. 96-well plate에 일정량을 넣고 microplate reader(Bio-Rad
Laboratories, U.S.A.)로 560 nm에서 흡광도를 측정하였다 .
Induction of apoptosis in cells
CPP32
DEVD+pNA DEVD- pNA
(p-nitroanilide )
Figure 2. CPP 분석원리
Protease activation
4) Caspase-3 activity
이 분석법은 Figure 2에서와 같이 예정된 세포사멸인 apoptosis를 이끄는 cysteine protease의 일부인 caspase-3의 활성을 조사하는 방법으로 세포 내에서 자가사멸이 유도되면 단백 분해효소가 활성화되고, 이는 caspase-3 효소를 활성화하면 caspase-3 효소는 세포내의 p-nitroanilide와의 substrate conjugate 인 DEVD-pNA를 분해하여 푸른빛의 pNA와 DEVD를 만든다. ApoAlert CPP32 분석 방법을 Figure 3에서와 같이 먼저 배양접시 에 배양 medium을 제거하고, PBS 1 ml로 세척한 뒤 trypsin 1 ml을 첨가 하여 3～5분 incubation하여 dish에서 세포를 떼어내어 eppendorf에 넣고 1,500 r.p.m.에서 5분간 원심분리(Microspin, Hanil Co. Korea)하여 침전물을 제외한 부유액을 제거하였다. 그 침전물에 chilled cell lysis buffer 50 ㎕를 첨가한 후 얼음에 10분간 두었다가 4℃ , 15,000 r.p.m.에서 3분간 원심분리 하여 부유액 50 ㎕를 96 well에 넣고 2X reaction buffer을 50 ㎕ 첨가하여 37℃에서 30분간 둔다. 30분 후에 caspase-3 substrate 5 ㎕ 첨가하고 37℃에서 1시간 후 microplate reader로 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.
10 min on ice
37℃ for 30 min
37℃ for 1 hr
Figure 3. Caspase-3 assay procedure
Suspend cell in lysis buffer
Transfer samples to 96-well plate
Add 50 ㎕ reaction buffer Containing DTT
Add 5 ㎕ conjugated Caspase-3 substrate
Analyze in spectrophotometer
Determine caspase-3 activity
5) Protein assay
단백질의 분석은 Bradford법에 근거한 Bio-Rad Protein Assay를 이용 하였다 . 이는 용해성 단백질의 농도를 측정하는 단순하면서도 정확한 방법이다.
배양접시에 세포가 75% ～85% conflue nce해지면 medium을 제거하고 , PBS 1 ml로 세척한 뒤 trypsin 1 ml을 첨가하여 3～5분 incubation하여 dish에서 세포를 떼어내어 eppendorf에 넣고 1,500 r.p.m.에서 3분간 원심분리하여 침전물을 제외한 부유액을 제거하였다. 그 침전물에 chilled cell lysis buffer 50 ㎕를 첨가한 후 얼음에 10분간 두었다가 4℃, 15,000 r.p.m.에서 3분간 원심분리하여 단백질 용액과 염색시약이 고르게 혼합되도록 96well을 흔들어
준 뒤 37℃에서 5분간 배양 후 microplate reader(Bio-Rad Laboratories, U.S.A.)로 흡광도를 측정하였다.
5. 자료의 처리
모든 자료의 처리는 평균을 구하고 대조군에 대한 백분위를 구하였다. 세포 수의 경우 각 처리군에 따라 평균치±표준편차(SD)를 구하였으며 , 이들은 SPSS를 이용하여 일원분석을 한 후 각 군간의 유의성은 Duncan's multiple range test를 이용하여 차이를 검증하였다.
각 평균에서 세포의 배양접시는 2-6개 였으며, 실험은 3-5회 반복하여 그 경향을 확인하고 그 중에서 결과가 분명한 실험을 제시하고자 하였다.
Ⅲ. 실험결과 및 고찰
1. 버섯류의 첨가가 암세포의 성장에 미치는 영향
1) 버섯 추출액의 첨가 수준에 따른 HT-29 세포의 성장
대장암 세포인 HT-29에 버섯 추출액을 첨가하고 첨가 수준에 따른 세포 성장을 알아보고자 하였다. 차가버섯, 표고버섯, 새송이버섯의 추출 액을 serum free medium에 각각 0 ㎕, 20 ㎕ , 40 ㎕ 첨가하고 48시간 배양 하였으며, 세포 수를 측정한 결과는 Table 1에서와 같다. 세 종류의 버섯 추출액의 첨가에서 모두 20 ㎕ 첨가 시에 세포 수는 유의적으로 감소 하였으며, 40 ㎕ 첨가에서는 20 ㎕ 첨가에 비해 다시 유의적으로 감소 하였다(p<0.05).
박무현25) 등의 연구에서 간암 세포인 H22와 백혈병 세포인 L1210 에 대한 표고버섯과 느타리버섯 효능을 확인하였고, 버섯의 첨가 수준이 증가할수록 암세포의 저지율이 증가한 결과와 유사한 경향이었다 . Figure 4에서 보면 차가버섯 추출액의 경우 20 ㎕첨가하였을 세포 수는 대조군의 82.7%로 감소하였고 40 ㎕ 첨가에서는 77.2%로 감소하였다.
표고버섯 추출액의 경우에서도 대조군에 비해 첨가 수준이 높아짐에 따라서 HT-29세포가 감소함을 볼 수 있었는데, 20 ㎕ 첨가에서는 80.1%
추출액의 경우에서도 20 ㎕ 첨가에서 63.8%, 40 ㎕ 첨가에서 55.2%로 감소하였다 . 따라서 HT-29 세포에 대해 차가버섯, 표고버섯, 새송이버섯 은 세포증식을 억제하는 효과가 있음을 알 수 있었으며, 버섯 추출액의 첨가 수준이 높아짐에 따라 증식 억제 효과가 더 뚜렷함을 알 수가 있었다.
Table 1. 버섯 추출액의 첨가 수준에 따른 HT-29 세포 성장
시 료 세포 수(×105/dish)
차가버섯 0 ㎕ 20 ㎕ 40 ㎕
19.4±2.91)a2) 16.0±3.0 b 13.2±1.7 c
표고버섯 0 ㎕ 20 ㎕ 40 ㎕
19.4±2.9 a 15.3±2.2 b 11.1±1.1 c
새송이버섯 0 ㎕ 20 ㎕ 40 ㎕
19.4±2.9 b 13.5±2.7 b 7.1±1.1 c
1) 평균±표준편차
2) 같은 항에서 알파벳이 다른 평균값간에는 Duncan's multiple range test에 의해 α=0.05 에서 유의적 차이가 있다.
a a
b a
c a
0 20 40 60 80 100
20㎕ 40㎕
(% of Control)
차 가 버 섯 표 고 버 섯 새 송 이 버 섯
* 같은 농도에서 알파벳이 다른 평균값간에는 Duncan's multiple range test에 의해 α=0.05 에서 유의적 차이가 있다.
Figure 4. 버섯 추출액의 첨가 수준에 따른 HT-29 세포 성장의 대조군에 대한 비율
2) 버섯 추출액의 첨가 후 배양 시간에 따른 HT-29 세포의 성장
차가버섯, 표고버섯, 새송이버섯 추출액의 첨가가 HT-29 세포에 대해 항암 효과가 있음을 확인한 후 버섯 추출액을 첨가하고 처리 시간에 따라 HT-29 세포에 대한 증식이 어떠한지를 알아보고자 하였다.
차가버섯, 표고버섯, 새송이버섯 추출액을 20 ㎕, 80 ㎕ , 160 ㎕씩을 넣고 24시간 , 48시간 , 72시간, 96시간을 배양한 후 세포 수를 측정하였다 . 그 결과는 Table 2에서와 같다. 대조군의 경우 세포는 처리 후 배양 시간의 경과에 따라 24시간에 비해 48시간에 유의적으로 증가하였으며, 72시간에 는 약간의 증가 경향을 보였고 96시간에는 유의적으로 감소하여 24시간 의 수준으로 되돌아갔다 . 차가버섯의 경우 20 ㎕ 첨가 시에 대조군과 마찬가지로 24시간에 비해 48시간과 72시간에 증가하였고 96시간에도 유의적으로 감소하였다. 그러나 80 ㎕와 160 ㎕에서는 24시간이나 48시간의 처리에 비해 유의적으로 세포 수가 감소하였고 96시간에서는 대조군에 비해 세포 수가 매우 감소하였다. 표고버섯의 경우 20 ㎕ , 80 ㎕ 160 ㎕ 첨가 모두에서 48시간에는 24시간에 비해 유의적으로 세포 수가 증가하였으며 72시간에서는 48시간에 비해 20 ㎕과 80 ㎕에서는 비슷하였으나 160 ㎕에서는 약간 증가하였다. 96시간에서는 72시간에 비하여 세 종류의 첨가량 모두에서 세포 수가 유의적으로 감소하였으며 24시간에 비해서도 80 ㎕와 160 ㎕에서는 유의적으로 감소하였다 . 새송이버섯의 경우 20 ㎕의 첨가에서는 시간 경과에 따라 대조군과
24시간 수준으로 감소하였다. 그러나 80 ㎕ 첨가에서는 48시간에 24시간 에 비해 유의하게 세포수가 증가하였다가 72시간에는 유의하게 감소 하였고, 96시간에는 급격한 감소를 나타내었다. 160 ㎕ 첨가에서는 96시간 에 세포 수가 더 많이 감소를 보였다.
Table 2. 버섯 추출액의 첨가 후 시간별 HT-29 세포 성장
1) 평균±표준편차
2) 각 줄에서 알파벳이 다른 평균값간에는 Duncan's multiple range test에 의해 α =0.05 에서 유의적 차이가 있다.
시 료 세포 수(×105/dish)
24hr 48hr 72hr 96hr 차가버섯
0 ㎕ 20 ㎕ 80 ㎕ 160 ㎕
19.7±0.91)a2) 35.0±1.5 b 37.5±4.0 b 21.9±0.8 a 16.4±3.0 b 31.8±2.6 c 34.0±1.6 c 9.7±2.2 a 22.8±1.0 c 22.0±0.8 c 18.3±0.2 b 5.2±1.8 a 28.1±1.2 d 20.9±0.5 c 1.4±0.8 a 2.9±0.0 b
표고버섯 0 ㎕ 20 ㎕ 80 ㎕ 160 ㎕
19.7±0.9 a 35.0±1.5 b 37.5±4.0 b 21.9±0.8 a 22.8±2.0 ab 31.8±1.0 c 28.0±6.4 bc 21.3±2.8 a 27.0±1.0 b 36.4±1.0 c 36.4±1.0 c 3.8±0.6 a 28.5±2.0 b 34.0±2.6 c 37.2±0.0 d 1.3±0.1 a
새송이버섯 0 ㎕
20 ㎕ 80 ㎕ 160 ㎕
19.7±0.9 a 35.0±1.5 b 37.5±4.0 b 21.9±0.8 a 23.9±1.0 a 29.3±0.9 b 32.1±1.6 c 22.4±0.4 a 25.4±1.7 b 32.0±1.3 d 28.7±1.3 c 12.7±2.4 a 26.0±1.9 b 29.3±1.3 b 28.0±2.0 bc 5.0±0.2 a
차 가 버 섯
0 20 40 60 80 100 120 140
0 24 48 72 (hr)
(% of control)
2 0 ㎕ 8 0 ㎕ 1 6 0 ㎕
표 고 버 섯
0 20 40 60 80 100 120 140
0 24 48 72 (hr)
(% of control)
2 0 ㎕ 8 0 ㎕ 1 6 0 ㎕
Figure 5. 버섯 추출액 첨가 후 배양 시간별 HT-29 세포 성장의 대조군에 대한 비율
새 송 이 버 섯
0 20 40 60 80 100 120 140
0 24 48 72 (hr)
(% of control)
2 0 ㎕ 8 0 ㎕ 1 6 0 ㎕
그러므로 시간이 경과함에 따라 대장암 세포 수를 3일까지는 증가하 지만 4일째에는 감소하는데 버섯 추출액의 첨가는 대조군에 비해 세포수 를 감소시킴을 알 수가 있었다. 또한 버섯의 첨가 수준이 높아질수록 세포 증식을 억제함을 알 수 있었는데 특히 처리시간이 길수록 증식의 억제 효과가 더 뚜렷하였다 . 이를 대조군에 대한 비율로 처리하였을 때 Figure 5에서 보면 세 종류의 버섯 모두에서 24시간 경과 시에 세포 수가
증가하고 그 후 감소함을 알 수 있다. 최미연 등26)이 표고버섯의 다당체를 흰쥐의 백혈병성 임파모 세포인 P388에 처리한 결과 대조군은
24시간 , 48시간 , 72시간 후에 세포 수가 4.0×104/ml, 12.0×104/ml, 60.0×104/ml로 급속히 증가하였으나 표고버섯의 열수추출물을 첨가
하였을 때 24시간 경과에는 대조군과 차이가 없었으나 72시간 경과에는 0.4×104/ml로 급속히 증식이 억제된 결과와 유사하다. 이영숙 등27)의 연 구에서도 파래와 곤피의 당단백질을 처리한 Sarcoma-180 암세포가 시간 의 경과함에 따라 증식이 억제되었다는 연구와 동일하다. 차가버섯의 경 우 첨가 수준이 늘수록 48시간 이후에서 보면 세포수가 감소함을 나타 내었고, 표고버섯의 경우에서는 96시간에 80 ㎕와 160 ㎕ 첨가가 세포 증식을 많이 억제함을 알 수 있었고 새송이버섯은 160 ㎕ 첨가에서 그 효과가 두드러짐을 알 수 있었다. 쑥의 열수추출물과 향기성분이 세균의 증식에 미치는 영향을 살펴본 연구5)에서 배양시간이 길어짐에 따라 함 유 성분에 따라 12시간에 항균 효과가 큰 경우도 있고 36시간에 항균효 과가 큰 경우도 있고 36시간에 항균 효과가 나타나는 경우도 있었다. 본
을 억제한 것으로 보아 첨가액의 종류와 세포 종류에 따라 필요한 배양 시간은 다른 것으로 보인다.
3) 버섯 추출액의 첨가 수준에 따른 Caco-2 세포의 성장
대장암 세포의 다른 종류인 Caco-2 세포에서 버섯류 첨가가 미치는 영향을 살펴보고자 하였다. 세포 배양과 버섯 추출액 첨가 수준은 HT-29 세포에서와 같은 방법으로 실험하였다. 대조군을 100%로 하여 첨가 하였을 때 Figure 6에서 보면, 차가버섯의 경우 20 ㎕과 40 ㎕ 첨가에서 세포 수는 77.8%, 59.3%로 감소함을 나타내었고 표고버섯의 경우에서는 66.6%와 39.7%로 감소하였으며 새송이버섯의 경우에서는 53.3%, 35.4%로 감소함을 볼 수가 있었다. 따라서 Caco-2 세포에서도 차가버섯, 표고버섯, 새송이버섯은 세포증식을 억제하는데 효과가 있고 또한 첨가 수준이 높아짐에 따라 항암 효과가 증가함을 알 수가 있었다. 본 연구에서 사용한 인간의 대장암 세포인 Caco-2 세포에 epiderma growth factor(EGF) 의 작용기전을 살펴본 연구7)10)에서는 Caco-2 세포 증식에 EGF가 중요한 영향을 미치며 EGF 농도가 증가하면 세포 활성이 유의적으로 감소함을 나타내었다 . 즉 버섯뿐 아니라 다른 물질의 경우에서도 첨가 수준에 의존적으로 반응함을 알 수 있다.
a a
a b
b c
0 20 40 60 80 100
20㎕ 40㎕
(% of control)
차 가 버 섯 표 고 버 섯 새 송 이 버 섯
* 같은 항에서 알파벳이 다른 평균값간에는 Duncan's multiple range test에 의해 α=0.05 에서 유의적 차이가 있다.
Figure 6. 버섯 추출액의 첨가 수준에 따른 Caco-2 세포 성장의 대조군에 대한 비율
4) 버섯의 첨가 수준에 따른 SNU484 세포의 성장
세포의 배양은 HT-29 세포 및 Caco-2 세포와 동일한 조건으로 진행하였고 , 버섯 추출액은 20 ㎕, 40 ㎕, 80 ㎕, 160 ㎕ , 240 ㎕ , 320 ㎕의 농도로 첨가하여 48시간 배양하였으며, 세포 수를 측정한 결과는 Table 3 에서와 같다.
차가버섯의 경우 20 ㎕ 첨가에서는 세포 수가 9.2×105으로 대조군의 19.5×105에 비해 매우 유의적으로 감소하였으며 40 ㎕와 80 ㎕ 첨가에서 는 세포 수가 8.9×105 및 7.4×105로 감소하였다. 160 ㎕와 240 ㎕ 에서는 80 ㎕에 비해 다시 유의적 감소를 나타내었고 320 ㎕ 첨가에서는 세포가 거의 관찰되지 않았다. 즉 차가버섯의 첨가 수준이 증가 할수록 SNU484 세포 수는 매우 감소하는 경향을 알 수 있었다. 표고버섯과 새송이버섯 의 경우 버섯 추출액의 첨가 수준에 따라 차가버섯에서와 같은 세포수의 감소경향을 뚜렷이 알 수는 없었다. 그러므로 버섯의 종류에 따라 위암 세포의 증식에 미치는 영향은 다름을 알 수 있었고 특히 차가버섯은 위암세포에 매우 좋은 효과를 미침을 알 수 있었다. 이를 대조군 100%
로 하여 첨가 수준에 따른 세포의 성장을 Figure 7 에서 보면 차가버섯 의 경우 20 ㎕ , 40 ㎕ , 80 ㎕ , 160 ㎕, 240 ㎕ , 320 ㎕에서 대조군의 54.8%, 48.3%, 30.6%, 24.7%, 5.1%로 감소하였다. 그러나 표고버섯의 경우에서는 103.2%, 108.5%, 119.2%, 76.5%, 91.9%, 116.8%였으며, 새송이버섯에서는 106.7%, 111.3%, 108.0%, 100.1%, 109.2%로 나타났다. 이로 미루어 볼 때 차가버섯의 첨가 수준이 증가함에 따라 SNU484 세포에 대해 세포 증 식이 매우 억제됨을 알 수가 있었고, 표고버섯과 새송이버섯의 첨가는
SNU484 세포의 증식에 영향이 없음을 알 수 있었다. 따라서 차가버섯은 SNU484 세포에 대해 항암 효과가 크다는 것을 알 수가 있었다. Figure 8 에서 보는 바와 같이 차가버섯의 첨가 수준이 진할 수 Y=-0.202X+61.904 (r2=0.98)의 반비례 직선식을 갖는 효과가 있어 차가버섯은 위암 치료제 로 적용해 볼 수 있을 것이다. 차가 추출물은 위암에 매우 특효의 작용을 가질 뿐만 아니라 AIDS에도 효과가 있다고 한다28). 버섯의 추출물을 처리하여 항암성을 증명한 많은 연구에서 이러한 항암 성분이 바로 리그닌 유도체인 것으로 보고된 것으로19)26)29) 미루어 보아 차가 버 섯, 표고버섯, 새송이버섯의 추출액 중 위암과 대장암 세포에 항암 작 용을 하는 성분이 리그닌 유도체의 한 종류일 것으로 생각되어진다.
able 3.
Table 3. 버섯의 첨가량에 따른 SNU484 세포 성장
1) 평균±표준편차
2) 알파벳이 다른 평균값간에는 Duncan's multiple range test에 의해 α=0.05 에서 유의적 차이가 있다.
농 도 세포 수(×105/dish) 차가버섯 0 ㎕
2 0 ㎕
40 ㎕
80 ㎕
160 ㎕
240 ㎕
320 ㎕
19.5±1.1 a 9.2±0.8 b 8.9±1.4 b 7.4±1.7 b 3.3±1.4c 1.9±0.1cd 0.0±0.0 d 표고버섯 0 ㎕ 2 0 ㎕ 40 ㎕
80 ㎕
160 ㎕
240 ㎕
320 ㎕
19.5±1.1cd 21.0±1.6 bc 21.5±0.3 abc 24.5±1.0 a 16.4±4.2 d 17.6±0.7 d 23.5±0.0 ab 새송이버섯 0 ㎕ 2 0 ㎕ 40 ㎕
80 ㎕
160 ㎕
240 ㎕
320 ㎕
19.5±1.1 b 20.9±1.4 b 21.1±1.1 b 22.2±1.2 b 26.5±5.9 a 19.5±1.3 b 22.0±0.7 b
a a
a
a a
a b
b
b b
b b
c b
b b
c b
0 20 40 60 80 100 120 140
20 40 80 160 240 320
(㎕)
(% of Control)
차 가 버 섯 표 고 버 섯 새 송 이 버 섯
* 같은 항에서 알파벳이 다른 평균값간에는 Duncan's multiple range test에 의해 α=0.05 에서 유의적 차이가 있다.
Figure 7. 버섯 추출액의 첨가 수준에 따른 SNU484 세포 성장의 대조군에 대한 비율
y = - 0 . 2 0 2 x + 6 1 . 9 0 4 R2 = 0 . 9 7 5 8
0 10 20 30 40 50 60 70
0 40 80 120 160 200 240 280 320
(% of Control)
Figure 8. 차가버섯 추출액의 첨가 수준에 따른 SNU484 세포 성장의 대조군에 대한 비율
2. 버섯류의 첨가가 자가사멸에 미치는 영향
1) 버섯 추출액의 첨가 수준에 따른 HT-29 세포의 자가사멸
인간의 대장암 세포인 HT-29 세포의 자가사멸에 버섯류가 미치는 영향은 figure 9 에서 보는 바와 같이 세 종류의 버섯이 비슷하였다.
20 ㎕ 첨가에서 차가버섯은 대조군의 152%, 표고버섯은 112%, 새송이버섯은 118%였고, 40 ㎕에서 각각 153%, 154%, 134%였으며, 80 ㎕
에서 각각 171%, 166%, 162%였으며, 160 ㎕에서 198%, 175%, 181%였고, 240 ㎕에서 254%, 186%, 187%였으며 , 320 ㎕에서 각각 270%, 193%, 216%로 나타났다. 대장암세포의 경우 위암 세포와 마찬가지로 소화기계 암세포이기는 하나 차가버섯의 첨가에 의한 위암 세포에서와 같은 caspase-3 활성의 높은 증가를 볼 수는 없었다.
Shim JS등31)은 curcumin을 human epithelial carcinoma인 A-431에 처리하고 48시간 배양하였더니 세포의 생존율은 10 μ M에서 80% 이상 이었으나 20 μM 이상에서는 20% 이하로 감소하였으며 , caspase-3활성은 p-nitroaniline 농도로 측정하였을 때 24시간 이상 배양하였더니 증가 하였으므로 curcumin에 의해 유도된 자가사멸을 확인하였다 . 반면 식용 채소인 머위에서 분리한 [3-(3,4-dihydroxyphenyl)-2-oxopropyl]ester 및
petasiphenol은 백혈병 세포에서 caspase-3 활성을 저해하는 것으로 나타났다. 비스테로이드 항염제제, 예를 들어 sodium salicylato는 대장암,
한다. caspase가 자가사멸의 중요한 중재자인데 그 중에서 caspase-3은 특정한 세포 단백질의 절단을 촉매함으로써 사멸을 유도하는 단백분해
효소이다. Inanami등33)은 인간의 백혈병 세포에 X-ray를 조사한 후 지방과산화를 방지하는 항산화제인 Trolox를 투여하고 X-선에 의해 유도된 자가사멸과의 관계를 살펴보았는데, 세포사멸은 Ac-DEVD-DHO 에 의해 방지됨을 알 수 있었으므로 사다리와 같은 절단이 caspase-3와 관련이 됨을 알 수 있었다. 영양상태가 원하지 않는 손상된 세포를 제거하는 과정인 자가사멸을 조절할 수 있는지는 잘 알려져 있지 않다.
choline 부족은 자가사멸을 유도하는데 PC12 세포에서 choline 결핍에 의해 유도된 자가사멸은 choline을 보충하였을 때 완전히 방지되고 choline 결핍 시 48시간 내에 배양액에 caspase inhibitor를 참가하였을 때도 자가사멸이 방지되었다34).
0 50 100 150 200 250 300
0 20 40 80 160 240 320(㎕)
caspase-3 activity/protein (% of control)
차 가 버 섯 표 고 버 섯 새 송 이 버 섯
Figure 9. HT-29 세포의 caspase-3 activity/protein
2) 버섯의 첨가량에 따라 SNU484 세포의 자가사멸
caspase-3 활성이 SNU484 세포에 미치는 영향은 figure 10 에서와 같이 버섯 추출액의 첨가에 따라 활성이 증가하는 경향을 보였다. 세 종류의 버섯 중 특히 차가버섯의 경우에 20 ㎕의 소량 첨가에도 caspase-3 활성이 대조군의 209%로 2배가 증가하였으며 80 ㎕의 첨가 에서 대조군의 327%, 160 ㎕에서 391%, 240 ㎕에서 481%, 320 ㎕에서 529%로 가파른 증가를 나타내었다 . 그러나 표고버섯과 새송이버섯의 경우 320 ㎕ 첨가에서 각각 대조군의 220%와 216%로 2배정도 증가함을 보였다. 그러므로 차가버섯은 일반적으로 위암치료에 가장 효능이 있다고 알려진 바와 같이 위암세포의 자가사멸에 탁월한 효능이 있음을 알 수 있었다. 표고버섯과 새송이버섯 추출액의 SNU484 세포에 첨가는 대장암세포인 HT-29 세포에서와 비슷하게 동일 첨가 수준에서 거의 동일한 caspase-3 활성의 증가를 나타내었다.
0 100 200 300 400 500 600
0 20 40 80 160 240 320(㎕)
caspase-3 activity/protein (% of control)
차 가 버 섯 표 고 버 섯 새 송 이 버 섯
Figure 10. SNU484 세포의 caspase-3 activity/protein
Ⅳ. 결 론
본 실험에서는 일반적으로 여러 종류의 질병에 약리 효과가 있다고 알려진 버섯류 중 차가버섯, 표고버섯, 새송이버섯의 수용성 추출액을 인간의 위암세포인 SNU484와 대장암 세포인 HT-29와 Caco-2세포에 첨가한 후 첨가 수준과 첨가 후 배양시간에 따라 성장과 자가사멸에 미치는 영향을 알아보고자 하였다.
대장암 세포인 HT-29에 버섯 추출액을 첨가하였을 때 20 ㎕과 40 ㎕을 첨가하고 48시간 배양하였더니 유의적으로 대조군에 비하여 세포 수가 감소하였으며 20 ㎕에 비해 40 ㎕ 첨가에서 유의적으로 세포 수가 감소하였으므로 첨가 수준의 증가에 따라 세포 증식이 억제됨을 알 수 있었다. 이들 세 종류의 버섯을 첨가하고 24, 48, 72, 96시간 배양 하였을 때 시간의 경과함에 따른 HT-29 세포 증식에서 시료처리 후 24시간에서는 세포의 증식이 억제됨을 볼 수가 없었으나 24시간 이후 부터 시간이 경과할수록 암세포 증식이 유의적으로 억제됨을 볼 수가 있어 버섯 시료가 암세포와 반응을 하는데는 시간이 걸리는 것으로 생각 된다. 다른 종류의 대장암 세포인 Caco-2에 버섯 추출액을 20 ㎕와 40 ㎕ 첨가한 경우에서도 첨가 수준이 증가함에 따라 암세포 증식이 유의적으로 억제됨을 볼 수가 있었다. 따라서 대장암 세포에 세 종류의 버섯 모두가 암세포의 증식을 억제함을 알 수 있었다. 위암 세포인 SNU484의 경우에서는 표고버섯과 새송이버섯의 첨가 수준이 320 ㎕로
많아져도 암세포의 증식 억제효과를 볼 수가 없었으나, 차가버섯의 첨가 농도가 높아짐에 따라 비례적으로 암세포의 증식이 유의적으로 감소하는 효과를 나타내었다.
Caspase-3 활성이 버섯 추출액의 첨가에 따라 SNU484 세포의 활성이 증가함을 나타내었다. 특히 차가버섯의 활성이 가파르게 증가 하여 위암세포의 자가사멸에 탁월한 효능이 있음을 알 수가 있다.
인간의 대장암 세포인 HT-29 세포의 자가사멸에서 세 종류의 버섯 첨가가 동일 첨가량에서 거의 동일한 caspase-3 활성의 증가를 나타 내었다.
인간의 대장암 세포인 HT-29 세포의 자가사멸에서 세 종류의 버섯 첨가가 첨가 수준별에 따라 caspase-3 활성이 거의 동일하게 증가하였다.
위암세포인 SNU484 세포에서도 caspase-3 활성이 버섯 추출액의 첨가에 따라 증가하였는데, 특히 차가버섯의 첨가에서 caspase-3 활성이 5배까지 가파르게 증가하여 위암세포의 자가사멸에 탁월한 효능이 있음을 알 수가 있다. 그러므로 본 실험에서 사용한 차가버섯, 표고버섯, 새송이 버섯은 소화기계 암세포의 성장을 억제하고 특히 차가버섯은 위암세포의 증식을 매우 억제할 뿐 아니라 자가사멸을 유도하므로 항암물질로 개발할 필요가 있을 것으로 사료된다.
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