[특별기획 I] 인공피부와 콜라젠스캐폴드

드레싱제 및 인공 피부의 분류

드레싱 또는 피부이식법에는 크게 자가 이식과 같 은 영구적인 이식(permanent graft)과 일시적인 이 식(temporary graft)으로 나눌 수 있다[그림 1]. 일 시적인 이식물에는 표피층이 제거된 냉동 보존된 사 체피부나 세포가 제거된 사체피부, 그리고 양막과 같 은 동종이식물이 있으며, 돼지피부, 게 껍질에서 추출 한 키토산, 해조류에서 추출한 알지네이트, 소의 피부 또는 건에서 추출한 콜라젠, 그리고 콜라젠을 변형시 킨 젤라틴 등이 드레싱 제재로 개발되어 이용되고 있 다. 그리고 조직공학 기술을 이용하여 상피세포만을 배양한 배양상피, 콜라젠 젤에 상피세포를 배양한 젤 형 바이오인공피부[그림 2], 콜라젠 스폰지에 상피세 포를 배양한 스폰지형 바이오인공피부, 폴리글라이콜 산(polyglycolic acid; PGA) 또는 나이론 메쉬에 섬 유모세포를 배양한 바이오인공진피 등이 개발되어 현 재 임상에 이용되고 있다[표 1].

자가이식은 가장 효과적이고 치료효과가 좋은 이식 방법이나 한번에 넓은 부위를 이식하면 공여부위가 넓어져 주위로부터 감염 등의 위험이 있어 2~3회 시 술을 해야 하며 한번 이식 후에는 2~3주간 공여부가

재생될 때까지 기다려야 한다. 따라서 이식이 필요로 하는 다른 환부가 수축되는 문제와 입원기간이 길어져 환자의 부담이 커지는 경제적 부담이 늘어나게 된다.

자가이식이 부족할 경우 효과적인 방법은 사체피부 를 이용하는 것으로서 사체피부를 냉동보존, 동결건 조, 또는 글리세롤로 처리하여 세포를 제거하여 드레 싱을 실시하고 환부의 바닥으로부터 혈관이 진입하면 드레싱한 사체피부를 제거하거나 더마톰(dermatome) 으로 생착된 사체피부의 표피층과 진피층의 일부를 제거한 뒤 자가이식 또는 배양표피 이식을 실시하게 되며 이렇게 이식을 하면 배양표피층의 생착률이 최 대 95%까지 향상시킬 수 있다.

이러한 사체피부의 높은 치료 효과를 유지하면서 생착률을 높 이고 다시 제거할 필요가 없이 가공된 이식물이 알로덤 (AlloDerm

)이라는 상품으로 표피층과 진피세포, 혈관내피세 포를 완전 제거하고 기저막과 진피의 구조만을 남겨 동결 건 조한 이식물이다. 깊은 화상의 서영권·박정극

동국대학교 생명화학공학과 {bioseo, jkpark}@dongguk.edu

Permanent graft

Temporary graft

Autografts

Allografts: cadaver skin, Alloderm , amniotic membrane

Xenografts: pig skin(Alloask), chitosan, gelatin, bovine collagen(Integra

), Alginate

Cultured bioartificial skin: Apligraf

, Dermagraft

, CCS

, Epicel

, Biobrane

그림 2. Histology of reconstructed gel-type bioartificial skin composed of fibroblasts, keratinocytes and collagen.

Original magnification: ×200, Scale bar=50µm.

경우 환부에 혈관 없어 생착이 잘 되지 않기 때문에 먼저 알로덤을 이식하여 혈관형성을 유도하고 생착된 알로덤 위에 메쉬형태의 자가 피부이식이 가장 좋은 치료효과를 보임이 관련 논문을 통해 보고되고 있다.

알로덤은 자가이식 다음으로 치료효과가 높으나 공급 의 제한과 감염 및 에이즈와 같은 질병이 전파될 문제 점은 아직 해결하지 못하고 있다.

양막은 구조적인 특징과 다양한 구성 성분으로 인 하여 드레싱으로 사용시 환부의 염증 감소, 물과 단백 질 등의 전해물질의 손실 억제로 인한 반흔 감소 및 통증의 경감 등의 효과가 있고, 라미닌과 제4형 콜라 젠 등의 기저막 성분들이 남아 있어 상피세포의 이동 및 재상피화를 촉진시켜 준다. 양막 역시 생착되지 않 고 일정기간이 지나면 분해되거나 건조되어 환부로부

터 박리된다.

이종이식으로 이용되는 이식물은 젤라틴, 알지네이 트, 키토산 등이 있으며 2도 이상의 깊은 화상에 진피 대체물로는 아직까지는 임상에 이용되지 못하고 있다.

현재 돼지의 진피를 동결건조하여 드레싱으로 이용하 는 연구는 현재 임상에 이용되고 있으며 동결건조된 돼지 진피는 구조적으로 인체의 진피와 유사한 장점 이 있고, 글리세롤처리, 동결건조와 감마 멸균을 처리 함으로서 바이러스 등이 감염되는 문제를 최소화 하 려는 연구들도 진행 중에 있다. 돼지의 진피는 2도 정 도의 화상에 약 10일 정도 드레싱을 시켜주는 목적으 로 이용되며, 메쉬 형태의 자가이식위에 덮어주는 드 레싱제로도 사용되어지고 있다. 또한 그 위에 인체 각 질형성세포를 배양하여 배양상피가 환부를 향하게 덮

Algiderm in bleeding wound, nose bleeds, dental

(Convatex/BM-S) calcium alginate dressing extracion

more expensive than hydrocolloid dressing TerMax bovine/porcine tissue

applied in ulcers & burns (CytRx Corporation) xenografts dressing

AlloDerm

using of human cadaver skin using of freeze drying technology

(Life Cell Corporation) applied in full thickness wound

Integra

bovine collagen sponge covered with silicon membrane (Integra LifeScience)

Teruderm(Terumo) bovine collagen sponge covered with silicon membrane

Dermagraft(ATS) 3-D tissue bioartificial dermis

foreskin in new-born baby PLGA+allogenic fibroblast Biobrane(Dow Hickam skin substitutes dressing

applied in burn and full thickness wound Pharmaceutical) animal collagen

EPICEL-CEA autografts

(Biosurface Technology) ephithelical cell culturing not demand FDA approval technology

Apligraf

collagen gel applied in ulcers

(Organogenesis) fibroblasts/keratinocyte

OrCel-CCS

collagen sponge fibroblasts/keratinocyte

(Ortec.) applied in ulcers

HoloDerm(Tego sciensce) human keratinocyte auto epithelial cell sheet Keraheal(MCTT) human keratinocyte auto epithelial cell

SureDerm(Hans Biomed) using of human cadaver skin applied in full thickness wound

Trade Name(Company) Components Distinguishing Mark

Foreign

Korea

어주는 세포전달체 등 다양한 용도로 환부의 치료를 돕는데 이용되고 있으나 생착이 되지 않아 인체의 진 피를 대체하여 이식하지는 못한다.

영양공급세포(NIH J2 3T3)를 이용한 각질형성세 포의 배양법이 개발됨에 따라 배양상피세포층 (cultured epidermal sheets)을 이용한 화상치료가 가 능하게 되었다. 마덴(Madden) 등은 배양된 동종 상 피세포층은 T세포가 배양되지 않기 때문에 사람 백혈 구 항원(human leukocyte antigen; HLA)을 발현하 지 않으며 손상된 조직을 제거하고 이식하여야 치료 효과가 높아짐을 보고하였으며, 필립스(Phillips) 등은 동종 상피세포층도 궤양의 치료에 있어서 자가 상피 세포층 이식부위만큼 치료효과를 향상시켰음을 보고 하였다. 또한 버트(Burt) 등은 남성의 각질형성세포 로 배양된 배양 상피층이 여성 화상 환자에게 잘 생착 되었으며, 브레인(Brain) 등 역시 동종이식이 성공적 으로 생착되었음을 보고하였다.

그러나 파브레(Fabre) 등은 흰쥐의 각질형성세포 를 배양하여 배양 상피층을 제조한 뒤 동종이식을 하 였으나 생착이 되지 않았다고 보고하였으며, 오우벅 (Aubock) 등은 이식 2주후 분해되거나 박리되어 이 식된 동종 상피세포층은 제거됨을 보고하였다. 이러

한 연구결과의 차이는 배양 상피층 제조시 사람 백혈 구 항원을 유발하는 랑게르한스세포가 제거 되었는지 와 이식 후 면역억제방법, 그리고 환부의 깊이와 이식 부위의 진피층이 제대로 형성되어 있는지에 따라 이 식물의 생착 여부가 달라질 수 있다.

서(Seo) 등은 상피세포를 동결건조된 양막위에 10 일간 배양한 뒤 바로 환부에 양막이 위로 향하게 뒤집 어 이식(up and down)함으로서 배양상피층 이식의 새로운 방법을 시도하였다[그림 3]. 이는 이식시 양막 이 수분의 증발을 억제해 주며 배양상피층을 디쉬로

dry methods research beginning of research for porous collagen sponge binding of CS by pH crosslinked with 0.25% glutaraldehyde

Yannas dehydrothermal temperature and time insoluble collagen + CS

typeⅠ/ typeⅡ+GAG cell morphology

evaluation of GAG content

insoluble collagen regulation of pore size by control of pH, concentration, Silver

regulation of pore size and freezing temperature crosslinked with 1% cyanamide Boyce soluble collagen + CS addition of Biotin for cell growth

important of storage solution estimation of CS elution

insoluble collagen GAG content assay

Piper mechanical property of collagen sponge + CS water binding capacity estimation of degradation & denature crosslinked with carbodiimide

temperature cell morphology and viability

표 2. Current research status for collagen scaffolds

Author Methods Results

그림 3. Histology of the cultured epithelial cell sheet on amniotic membrane(AM). Approximately 6~10 keratinocyte cell layers were formed on the deepithelialized AM. Original magnification:

×200, Scale bar=10µm.

부터 떨어뜨리기 위해 효소처리하는 단계를 생략할 수 있으며, 양막위에 각질형성세포가 단층으로만 배 양되어도 이식이 가능하기 때문에, 화상과 같이 응급 한 수술을 필요로 하는 환자에게 매우 유용하게 이용 될 수 있다.

천연고분자인 콜라젠이나 생분해성 합성고분자인 폴리글라이콜산을 기질로 섬유모세포 및 각질형성세 포를 배양한 바이오인공피부도 개발되어 현재 임상에 이용되고 있다. 소유래 콜라젠으로 제조된 인테그라 (Integra

, Integra Life Corp.)는 세포가 없는 콜라 젠스폰지 형태의 인공피부로서 진피재생을 목적으로 이용되고 있고, 이와 유사한 제품으로 콜라젠과 변성 된 콜라젠으로 제조된 테루더미스(Terudermis , Terumo Co., Japen)와 돼지콜라젠으로 제조된 펠락 (Pelnac , Gunze Ltd., Japen)이 현재 사용되고 있으 며 아플리그라프트(Apligraf

, Organogenesis, USA)는 전층 세포가 있는 젤형 바이오인공피부로서 궤양치료용으로 허가를 받았다. 그리고 더마그레프트 (Dermagraft

, ATS, USA)는 바이크릴(Vicryl)로 직조된 메쉬에 섬유모세포만을 배양하여 당뇨성 궤양 (diabetic ulcer)과 정맥성 궤양(venous ulcer) 치료 용으로 승인을 받았으며 트렌스사이트(TransCyte

) 는 화상치료용으로 승인추천을 받았다. 그리고 씨씨에 스(CCS , Oretec international, USA)는 콜라젠 스 폰지에 섬유모세포와 각질세포가 배양되어 있는 전층 바이오인공피부로 개발되어졌다[그림 4]. 노톤 (Naughton) 등은 더미그래프트를 당뇨성 족부궤양 에 이식하여 치료효과를 확인하였으며, 사블린스키 (Sabolinski) 등은 임상실험에서, 배양된 3차원 젤형 바이오인공피부인 그레프트스킨(Graftskin

)을 궤 양부위에 5회 반복 이식을 통하여 환부가 효과적으로 치료됨을 보고하였고, 이글스테인(Eaglstein) 등은 피 부암 제거부위에 그레프트스킨을 이식하여 외과적 수 술로 발생된 환부(지름 50mm)에 치료효과가 있음을 관찰하였다. 그리고 코퍼(Cooper) 등은 인체의 조직 에서 분리된 각질형성세포와 섬유모세포를 배양하여

콜라젠 스폰지에 전층 생인공피부를 제조한 뒤 누드마 우스 이식실험을 통하여 치료효과를 검증하였으며, 보 이스(Boyce) 등은 환자의 조직으로부터 세포를 배양 하여 콜라젠 스폰지에 전층 바이오인공피부를 제조한 뒤 화상환자 본인에게 이식하여 자가이식(autograft) 과 유사한 치료 효과가 있으나 바이오인공피부를 여러 차례 이식해야하는 문제점이 있음을 보고하였다.

이와 같이 환부의 치료를 위한 드레싱제 및 바이오 인공피부는 더 효과가 우수한 제품의 개발을 위해 많 은 연구자들에 의해 계속적인 연구가 진행중에 있다.

인공피부 제조를 위한 콜라젠 스캐폴드

인공합성 스캐폴드는 천연 재료를 이용한 스캐폴드 에 비해 세포적합성이 떨어지고 체내에서 염증반응 유발정도가 높다. 따라서 인공합성재료보다 천연재료 가 현재 임상에 많이 이용되고 있으며, 천연재료를 이 용한 스캐폴드의 물성 및 생체적합성을 향상시키려는 연구들이 진행되어 왔다.

스캐폴드 제조에 있어 스캐폴드가 너무 강직하면

상처부위에 밀착되지 않아 수술 후 생착률이 떨어진

다. 그리고 인공피부의 경우 이식부위의 최적 수분 투

그림 4. Commercial bioartificial skin, (A) Integra

(Integra Life Corp.), (B) OrCel-CCS (ortec.),

(C)Apligraft

(Organogenesis Inc.), (D)Dermagraft

(Advanced Tissue Science Inc.).

과율(moisture flux rate)은 0.5mg/cm

/hr인데 이식 부위가 건조하게 되면 수축을 하거나 환부와의 경계 부위가 생착되지 못하며 이로 인해 혈관이 들어오지 못해서 영양과 수분공급이 이루어지지 못하면서 이식 한 인공피부가 괴사되어 수술 실패의 원인이 된다. 따 라서 인공피부를 제조하기 위해서는 굴곡강도 (bending rigidity), 수분투과율(moisture flux rate), 혈액 적합성, 강도, 감염조절, 함출물 조절(fluid loss control), 분해속도, 면역거부반응, 공극 및 두께 조절 등에 역점을 두어야 한다.

콜라젠 젤에 섬유모세포를 배양하면 단백질 및 콜 라젠 합성이 단층배양에 비해 현저히 줄어들며, 과도 하게 수축된 젤은 화상환자치료용으로 이용하기에 크 기가 작은 문제점이 있다. 따라서, 젤 형태의 스캐폴드 에서 다공성 스폰지 형태의 스캐폴드로 연구의 방향 이 전환되었다[표 2].

야나스(Yannas) 등은 송아지 건으로부터 추출한 불용성 제1형 콜라젠을 0.05M 초산에 넣어 60분간 분 쇄기에 녹였고 이때 콘드로이틴-6-설페이트를 초산에 녹여 1.375mg/ml/min의 속도로 첨가하여 응집을 최 소화하였다. 이를 동결 건조한 스폰지는 다공성 형태 이고 수용액의 가교시약에 넣으면 구조가 파괴될 수 있으므로 먼저 진공오븐에 넣고 먼저 2시간 정도 진공 을 걸어 스폰지내의 미량의 수분을 제거한 뒤 105℃까 지 온도를 상승시켜 24시간 동안 진공을 걸어주어 1 차적으로 약한 가교결합을 형성하였다[그림 5]. 그리 고 콜라젠과 글루코사미노글리칸의 결합률은 pH가

낮을수록(pH 3.0) 높았으며 보관액의 종류에 따라 글 루코사미노글리칸 용출량에 차이가 있었으며 콜라젠 의 종류에 따라서도 글루코사미노글리칸 결합력에도 차이를 보이며 열처리(DHT) 가교결합시에 온도와 시간에 따라 가교정도가 달라지며 가교가 될수록 분 자량이 줄어든다고 보고하였다.

실버(Silver) 등은 불용성 콜라젠을 소가죽으로부 터 추출하여, 콜라젠의 농도(0.5~1.0%, w/v)와 pH(2.0~3.75)를 변화시켜 공극의 크기를 조절하였 다. 특히 냉동 및 동결건조과정에서 공기접촉면과 용 기접촉면의 온도 차이가 표면의 형태학적 차이를 만 들게 되며 공기접촉면은 동결건조과정에서 비다공성 구조가 형성되며, 이는 용기접촉면 쪽으로 콜라젠 근 원섬유(fibril)가 이동되어 형성된 구조라고 보고하였 다. 그리고 냉동시에 -80℃이하로 급속하게 냉각시키 면 균열이 생기기 때문에 이를 해결하기 위해 -60℃

와 -80℃로 단계적인 냉각방법으로 흠 없는 스폰지를 제조하였으며 냉동시간을 오랫동안 방치하면 시료중 약 25%는 균열이 발생함을 관찰하였다. 그리고 낮은 점도의 용액은 섬유형태(fibrous)와 통로(channel)가 있으며 약 300µm크기의 구조를 형성하며 높은 점도 의 용액을 이용하면 통로와 층(sheet)구조가 적으며 약 30 µm 크기의 공극구조를 형성함을 관찰하였다. 냉 동온도와 냉각속도는 얼음결정형성(ice crystal growth)에 중요한 역할을 하게 되며 pH가 증가될수 록 큰 통로와 공극의 섬유질(fiber)구조가 관찰되며 pH가 낮으면 콜라젠의 용해 정도가 증가하여 물분자 와의 결합이 증가되기 때문에, 물분자와 경계층의 물 분자의 비율 그리고 pH의 변화가 구조에 영향을 미친 다고 보고하였다.

또한 보이스(Boyce) 등도 제조된 다공성 콜라젠 스폰지의 공극 크기를 콜라젠 용액의 농도 및 냉동온 도에 의해 조절하였으며, 스폰지 표면의 막 제조를 위 해 콜라젠과 글루코사미노글리칸 그리고 3%(v/v) 디메틸설폭옥사이드(DMSO)를 섞어 부드러운 표면 에 40㎕/cm

로 바른 후 스폰지를 덮고 동결 건조하여

collagen sponge after cross-linking agent treatment.

(A) with DHT treatment, (B) without DHT treatment.

Scale bar=100µm.

(A) (B)

한쪽면에 각질형성세포를 배양하기 위한 막을 형성시 킨 콜라젠 스캐폴드를 개발하였다.

기존의 연구에서는 대부분 글루타르알데하이드 (glutaradehyde)가교시약을 사용하였으나, 세척후에 도 염증반응을 유발하는 문제가 남아있었다. 따라서 이를 대체할 수 있는 가교방법이 필요하게 되었으며, 에틸디메틸아미노프로필 카보디이마이드(1-ethyl-3- (3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide; EDC)가 도입되기 시작하였다. 파이퍼(Piper)와 쿠페벨트 (Kuppevelt)는 1.6% 제1형 불용성 콜라젠 용액을 동 결 건조하여 스폰지를 제조하고 가교시약으로 카보디 이마이드를 사용하여 가교유무에 따른 특성과 콘드로 이틴설페이트를 스폰지에 첨가했을 경우의 물리적 변 화에 대해 연구하였다. 카보디이마이드 시약으로 가 교결합전후 표면의 구조적 특징을 전자현미경으로 관 찰한 결과 가교전 열처리를 한 스폰지는 전처리를 하 지 않은 스폰지보다 공극구조가 많이 파괴되었음을 보여주었고 가교시에 40%에탄올에 카보디이마이드 시약을 넣어 처리한 것은 원래구조를 잘 유지하며 콘 드로이틴설페이트의 부착력도 높일 수 있었다. 가교 처리는 수분과의 결합(water-binding capacity)을 감 소시키나 콘드로이틴설페이트를 함께 가교처리하면 오히려 수분과의 결합력을 향상시키고, 변성온도(Td) 와 인장강도는 약해진다고 보고하였다.

또한 프랭시오스 브레스드(Francios Brethod) 등 은 제1, 3형 소 콜라젠과 콘드로이틴 설페이트 그리고 키토산을 혼합하여 콜라젠-키토산 스폰지를 제조하였 으며, 여기에 섬유모세포를 배양하면 섬유모세포가 이동 및 증식하며 높은 콜라젠 합성능력을 보여주며 배양 4주 후에는 체내와 유사하게 콜라젠 합성이 감 소됨을 보고하였다. 이러한 콜라젠스폰지에 대한 다 양한 연구를 통하여 인테그라, 테루더미스, 그리고 펠 락 등이 개발되었으며, 콜라젠스폰지에 섬유모세포와 각질형성세포가 배양된 씨씨에스도 제품화되어 임상 에 이용되고 있다.

최근에 와서 콜라젠에 동종 섬유모세포가 배양되어

있는 경우 자가 섬유모세포에 비해 염증세포, 섬유화, 그리고 환부의 수축이 증가하는 연구결과들이 보고되 면서 새로운 형태의 바이오인공피부의 개발이 시도되 고 있다. 박(Park) 등은 기존의 인공피부의 개념을 바꾸어 세포가 함유되지 않아도 환부의 치료효과가, 세포가 있는 바이오인공피부와 유사한 효과가 나도록 고안하였다. 이들은 섬유모세포를 콜라젠스폰지에 배 양한 뒤 세포만을 제거하는 공정을 도입하여 섬유모 세포를 제거함으로서 세포가 분비한 세포외기질만을 함유한 바이오인공피부를 개발하였으며 이는 환부의 재생을 촉진시키는 것이 세포에서 분비된 성장인자와 사이토카인 뿐만 아니라 다양한 세포외기질에 의해서 도 치료가 촉진된다는 원리를 이용한 것이다.

결론

지금까지 다양한 바이오인공피부에 관련된 연구와 임상적결과에 대하여 살펴보았다. 초기의 드레싱제로 부터 조직공학기법으로 제조된 바이오인공피부에 이 르기까지 많은 연구자들의 노력에 의해 화상과 욕창 등과 같은 피부질환을 치료하기 위한 결과물들이 개 발되었다. 그린(Green) 박사 등에 의한 배양상피층이 개발되기 시작하고, 야나스(Yannas) 등에 의해 스폰 지형 인공피부가 상업화되면서 바이오인공피부는 놀 랄만한 발전을 이룩하고 있다.

현재 순수 분리된 콜라젠 및 히아루론산으로 제조 된 바이오인공피부들이 이용되어 좋은 임상적인 결과 를 얻고 있으나, 화상과 같이 감염률이 높은 경우 매 트릭스 메탈로프로테아제(matrix metalloprotease;

MMPs)의 증가로 이식된 바이오인공피부가 쉽게 분 해되는 문제점이 있다. 또한 아직까지 가격이 비싼 문 제가 남아있어 환자들의 경제적인 문제가 바이오인공 피부의 대중화를 저해하고 있다.

그러나 새로운 재료들이 합성되거나 천연고분자들

이 발견되어 생체재료로 연구되어지고 있어 앞으로

실제 피부와 좀 더 유사하면서 가격이 저렴한 바이오

인공피부가 개발될 것으로 예상된다.