A Study on Animal Skin Irritation Measurement of Ozoneized Olive Oil for Cosmetic Ingredients

화장품원료를 위한 오존화 올리브오일의 동물 피부자극 측정에 관한 연구

김덕술

동명대학교 공과대학 전자및의용공학부

A Study on Animal Skin Irritation Measurement of Ozoneized Olive Oil for Cosmetic Ingredients

Ducksool Kim

School of Electronic and Biomedical Engineering, Tongmyong University

요 약 본 연구는 오존화 올리브오일이 피부 질환에 우수한 치료효과를 가진다는 연구 결과가 알려지면서 오존을 피부 질환치료 에 사용하려는 다양한 시도가 있어 왔지만, 적절한 계측 절차가 수립되지 않아 국내에서는 임상적으로 가치가 있는 양질의 데이터 를 확보할 수 없었다. 일반적으로 화장품의 성능확인을 위한 목적으로 동물실험을 통해 실측 데이터 계측을 진행하는 경우는 많지 않지 않으나, 독성실험의 경우 피부의 반응을 정확히 계측하는 것이 반드시 필요한 사항으로 권고되고 있어 본 실험이 실시되었 다. 본 실험에서는 실험 Rabbit에 대한 오존화오일(고농도)에 대한 피부자극 평가를 위하여 오존화오일(고농도)을 털을 제거하여 피 부가 노출된 Rabbit의 등 부위에 도포한 후 24시간 동안 영상처리장치와 육안 검사를 통해 피부 반응을 관찰하여 피부자극 평가를 위한 데이터를 확보하고자 하였고 오존화오일(고농도)의 의한 일반적인 반응, 사망과 같은 반응을 함께 측정하는 과정을 진행하였 다. 총 24시간 이내의 결과에서 실험에 사용된 동물들 모두에서 시험물질 처치 부위의 육안관찰, 영상촬영을 통한 이상 반응은 관 찰되지 않았고 사망과 같은 돌발적인 이상반응 역시 확인되지 않아 오존화오일(고농도)의 생체 안전성을 확인할 수 있었다.

• 주제어 : 피부자극, 영상 처리, 생체 안정성, 오존화 올리브오일, 영상계측

Abstract This study has attempted to use ozone for the treatment of skin diseases as research results that ozonated olive oil has an excellent therapeutic effect on skin diseases are known. However, there is hardly any accurate data in Korea. Usually, animal tests related to cosmetics are not performed, but toxicity tests were conducted because they were absolutely necessary. In general, there are not many cases of measuring actual data through animal tests for the purpose of confirming the performance of cosmetics, but in the case of toxicity tests, it is recommended to accurately measure skin reactions, so this experiment was conducted. In this experiment, in order to evaluate the skin irritation of ozonated oil (high concentration) on the rabbit, the test substance was applied to the back of the rabbit for 24 hours, and then mortality, general symptoms and skin irritation were evaluated. Experimental Results As a result of evaluating the treatment site of the test substance after a certain period of time, no skin irritation was observed in all animals.

• Key Words : Skin irritation, Image Process, General symptoms, Stability test, Ozonated olive oil

Received 15 March 2021, Revised 25 March 2021, Accepted 29 March 2021

* Corresponding Author Ducksool Kim, School of Electronic and Biomedical Engineering, Tongmyong University, 428, sinsun-ro, Nam-gu, Busan, Korea. E-mail: [email protected]

Ⅰ. 서론

최근 들어 오존을 활용하는 기술은 과산화수소나 자 외선과의 병용에 의한 촉진산화처리, 생물처리와의 병 용처리 등 반응속도의 향상, 처리 대상물질의 확대를 겨냥한 새로운 반응기술을 개발하는 방향으로 주로 연 구가 이루어지고 있으며 대용량․고농도 오조나이저 (Ozonizer), 클린 오조나이저 등 적용 분야의 확대를 목 적으로 하는 오존발생기술, 하드웨어 기술의 진보가 현 저하게 이루어지고 있다.

오존은 공기의 소독, 풀장의 소독, 양식장의 소독에 서부터 왁스 혹은 셀룰로오즈 섬유의 표백, 탈취, 미생 물과 중금속의 제거, 의약품제조, 폐수처리 등 강력한 산화작용, 미생물과 진균 및 바이러스의 살균작용을 이 용하여 다방면으로 유용하다[1-4]. O3(오존)은 불완전 기체로 O2와 O로 환원(해리작용)하려는 성질을 가지며 유동성이 강하다[6, 7]. 오존의 O3가 환원되는 과정에서 바이러스나 세균 내의 DNA/RNA와 결합하여 전자를 뺏 어와 순식간에 사멸하게 되어 내성균이나 변이원성이 전혀 발생하지 않으며[8, 9], 분리되어진 O2와 O는 대사 항진작용을 촉진 시켜 피부 속 성장인자 증식에 관여 할 뿐만 아니라 면역세포증식 및 유독성, 유해물질을 분해한다[10, 11]. 다핵형 백혈구와 같은 작용을 하는 오존화 오일은 19세기부터 피부 깊숙한 곳에 일어나는 감염증, 궤양, 농양, 누공과 같은 질환의 치료에 이용되 어 왔다[11, 12]. 특히 오존화 올리브오일은 독성이 적 으면서 다양한 종류의 미생물을 사멸시키는 효과가 있 어 경구투여나 복강투여에도 인체에 해가 없는 것으로 알려져 있다[13, 14]. 최근에는 여러 가지 제품의 제조 프로세스 등에서 환경부하가 적고 생산성이 좋은 프로 세스가 요청되고 있어, 분해 후 무해한 산소로 되돌아 가는 산화제인 오존의 활용이 기대를 모으고 있다 [15-17]. 이 연구에 적용된 오존화 올리브오일 제조 공 정은 2014년 논문에서 상세히 언급하였다[18].

국내 연구성과를 통해 오존화 오일에 대한 인체 안 전성에 대한 실험이 적절히 진행되고 있지 못함을 확인 할 수 있었다. 본 연구에서는 실험용 Rabbit을 이용하여 오존화오일(고농도(1PPM))에 대한 피부자극시험을 진행 하고 이를 육안 및 영상처리장치를 통해 정량적으로 계 측하여 오존화 오일의 생체 안정성을 확인하는 연구를 진행하고자 한다.

Ⅱ. 관련 연구

2.1 시험재료 준비 분석 (Bispectral analysis)

④ 79.377g, ⑤ 79.168g, ⑥ 78.672g, ⑦ 78.917g, ⑧ 79.177g이다. 시험기간 중 보관조건은 냉장 2 - 8℃이 며, 외관 및 성상은 반투명 크림타입으로 사용하였고, 잔여시험물질은 처리 반환하였다.

Fig. 1. White NZW Rabbit

본 동물시험에 사용되는 NZW rabbit으로 성격이 온 순하여 실험을 위한 계측과 박피등에 민감하게 반응하 지 않는 특징을 가지고 있어 생식독성시험 및 항체제작 시험 등에 광범위하게 사용되고 있다. 본 실험에 사용 되는 NZW rabbit의 공급원은 천안연암대학이며 도입 시 성별, 동물 수는 수컷 7마리로 하였다. 피부자극시험 에 일반적으로 많이 사용되는 동물로서 비교할 많은 시 험기초자료가 축적되어 있어 선택하였다. 실험동물 도 입 시 모든 개체의 건강상태에 대한 외관검사를 실시하 였으며, 8일 동안의 검역 및 순화기간을 거쳐 체중 변 화 및 일반 건강상태를 관찰한 후 건강한 개체를 선별 하여 시험에 사용하였다.

순화기간 중에는 좌측 귓바퀴 내부에, 군 분리 후에 는 우측 귓바퀴 내부에 유성펜으로 동물번호를 표시하 였으며 cage에 개체식별카드를 부착하여 식별하였다.

순화 후 체중을 측정하여 순화기간 중 정상적으로 체중 이 증가하며, 실험동물의 피부 등에 이상이 없는 건강 한 동물 7마리를 선택하여 시험하였다. 본 동물시험은 동물보호법 및 실험동물에 관한 법률에 근거한 한국화 학융합시험연구원 헬스케어연구소의 동물윤리위원회에

의해 승인되었다. 군 분리 후 잔여동물은 안락사 처리 하였다.

2.2. 시험 방법

Rabbit에 대한 오존화오일(고농도)의 피부자극을 평 가하기 위하여 시험물질을 모든 동물에 대하여 Fig. 2에 서 보는 것과 같이 털을 제거한 표피에 Test Site와 Control Site로 4개 영역으로 구분하여 도포하고 1일 1 회씩 총 3일 동안 3회 육안 관찰하면서 상태를 촬영하 여 그 변화 정도를 저장하였다.

2.5 cm (Head)

2.5

cm Abraded Test site Intact

Intact Control site Abraded

(Tail)

Fig. 3. Image data acquisition process

Test Site와 Control Site는 Fig. 2와 같이 처치 약 24 시간 전에 등 부위를 약 15 × 15 cm²로 제모 한 후, 처치 직전에 각각 약 2.5 × 2.5 cm² 넓이의 처치구획 2 개소와 대조구획 2개소로 구분 및 표시하여 실험에 따 른 반응을 용이하게 확인할 수 있도록 하였고 추후 컴 퓨터를 이용해 쉽게 자동판별이 가능하도록 하였다.

실험동물 당 처치구획과 대조구획을 각각 찰과부위 와 비찰과부위로 구분하였으며, 찰과부위는 표피만 손

상되고 진피는 손상되지 않으며 피가 나지 않는 정도의 찰과상을 입혔다.

0.5 mL의 시험물질을 gauze[(2.5 × 2.5) cm2]에 처리 한 후, 상부의 찰과부위 1개소와 비찰과부위 1개소에 부착하였다.

하부의 대조구획에는 0.5mL의 대조물질을 gauze에 적용한 후 시험부위와 동일하게 부착하였다. 처치부위 를 비자극성 테이프(Tegarderm, 3M)와 탄력붕대(Coban, 3M)를 이용하여 잘 고정켰다. 첩포는 24시간 후 제거하 고 피부에 남아있는 시험물질은 세척물질을 이용해 부 드럽게 세정해주었다.

시험물질 처치 후 24 및 72 시간에 Table 1에 따라 홍반, 가피 및 부종형성의 정도를 관찰하였다.

Ⅲ. 본론

3.1 피부 처치 결과 평가

Rabbit에 대한 오존화오일(고농도)의 피부자극에 반 응하는 정도를 평가하기 위하여 시험물질을 24시간 동 안 등 부위에 도포한 후 3일(72시간) 동안의 변화를 지 속적으로 관찰하여 사망률, 일반증상, 체중 변화 및 피 부자극의 반응 정도를 계측 및 평가하였다.

Fig. 4. Skin photograph at 24 hours after application of test substance

Fig. 5. Skin photograph at 72 hours after application of test substance

3.2 피부반응 평가측정

피부반응의 평가는 Table 1의 기준에 따라 실시하였 으며, 1차 피부자극 지수(P.I.I.)를 산출하였다. 피부자극 성은 Table 2에 따라 판정하였다.

P.I.I. (Primary irritation index) =

Sum of 24 and 72 h readings

(No. of test sites = 12) × (scoring intervals = 2)

(1) Erythema/Eschar Formation

No erythema at all 0

Very mild erythema

(discernible with the naked eye) 1

Obvious erythema 2

Slightly severe erythema 3

Severe erythema (blush-colored redness) and

mild crust 4

Peak 4

(2) Edema Formation

No edema at all 0

Very mild swelling (not visible to the naked eye) 1 Mild swelling (if it is clearly swollen and the

margins are clearly distinct) 2

Moderate edema (about 1 mm swelling) 3 Severe edema (swelling more than 1 mm and extending to the outside of the exposed area) 4

Peak 4

Table 1. Evaluation of skin irritation

Table 2. Skin irritation score table Primary skin

irritation

Indices (P. I. I.) division

0.0 - 0.5 None irritant

0.6 - 2.0 Mild irritant 2.1 - 5.0 Moderate irritant 5.1 - 8.0 Severe irritant

3.3 피부처치부위분석

실험 수행 72시간 동안 시험물질이 적용된 Rabbit로 부터 Table 2의 피부자극성 기준에 따른 이상 반응은 모든 시료에서 관찰되지 않았으며 또한 실험에 투입된 Rabbit이 사망하거나 또는 생체 이상증상이 나타나지 않았다. 그 결과를 Table 3과 4에 나타내었다.

시료로 실험에 투입된 Rabbit의 이상반응에 대한 실 험 결과는 Table 3에 정리된 것과 같이 기준에 따른 이 상 반응은 전혀 관찰되지 않았음을 확인할 수 있다.

Table 3. Mortality and clinical signs

Animal number

Days after application

Mortality

0 1 2 3

1101 N N N N

0/6a

1102 N N N N

1103 N N N N

1104 N N N N

1105 N N N N

1106 N N N N

N : Normal

a : Number of dead animals/Number of total animals

피부자극에 대한 반응 측정 결과를 나타낸 Table 4 는 6개 시료 모두에서 관찰이 진행된 72시간 동안 어떠 한 피부 이상 반응도 확인되지 않음을 보여 주고 있다.

Table 3과 4의 결과로부터 Rabbit에 대한 오존화오일(고 농도)의 생체 안정성은 매우 우수한 것으로 확인되어 진다.

Table 4. Evaluation of skin irritation

Site Skin

Reaction Observation Time

Individual Scores – Animal Number

Total 110111021103110411051106

Contr site-ol

Erythema/

Eschar Formation

Intact

24h 0 0 0 0 0 0 0

72h 0 0 0 0 0 0 0

Abraded

24h 0 0 0 0 0 0 0

72h 0 0 0 0 0 0 0

Edema Formation

Intact 24h 0 0 0 0 0 0 0

72h 0 0 0 0 0 0 0

Abraded

24h 0 0 0 0 0 0 0

72h 0 0 0 0 0 0 0

Sum1 (S) 0

P.I.I. (S/24*) 0.0

Ⅳ. 결론

Rabbit에 대한 오존화오일(고농도)에 대한 피부자극 성을 평가하기 위하여 시험물질을 Rabbit의 등 부위에 도포한 후 72시간 동안 피부 상태의 변화 및 사망률, 일반증상, 체중 변화 등 오존화오일(고농도) 도포에 따 른 영향을 확인하고자 피부자극 및 계측 실험을 진행하 였고 연구 수행 결과를 다음과 같이 확인하였다,

실험기간 중 시험물질 적용으로 인한 사망동물은 관 찰되지 않았다. 모든 실험동물에서 특이할 만한 이상증 상은 관찰되지 않았다. 시험물질 처치부위를 평가한 결 과, 모든 동물에서 피부자극이 관찰되지 않았다. Draize 의 평가방법에 따라 1차 피부자극지수(P.I.I.)는 "0.0" 으 로 산출되었다.

이상의 결과로부터 Rabbit에 대한 피부자극시험에서 오존화오일(고농도)은 지극히 낮은 자극을 준다는 것으 로 동물실험을 통해 확인할 수 있었고 최종적으로 오존 화오일(고농도)은 "비자극성(None irritant)" 물질로 평가 할 수 있다는 결론에 이를 수 있었다.

ACKNOWLEDGEMENTS

이 과제는 동명대학교 2019년도 교내학술연구비로 진행되었습니다.

REFERENCES

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저자 소개

김 덕 술 (Duck-Sool Kim)

2002년 3월~현재 : 동명대학교 전자및의용공학부 교수

관심 분야 : 의료 재료, 의공 관련 물질 분석