엽 록 소 형 광 을 이 용 한 광 합 성 연 구
U s in g Ch l or oph y ll F lu ore s c e n c e t o S t u dy P h ot o s y n t h e s i s
정 병 철 , 이 춘 환 부 산 대 학 교 분 자 생 물 학 과
609 - 735 , 부 산 시 금 정 구 장 전 동 산 3 0번 지
목 차
1. 서론
2. 형광측정의 원리 3. 형광유도곡선
4. 형광유도과정과 광합성 효율 4- 1. 광화학적 과정
4- 2. 비광화학적 과정 5. 결론
6. 참고문헌
1 . 서 론
고등식물에서 광합성은 잎의 엽육조직에서 가장 활발하게 일어나며 엽록 체가 그 기능을 담당한다. 빛 에너지를 엽록소가 흡수하여 물을 분해하고(명 반응, light reaction ) 이산화탄소를 환원시켜(암반응, dark reaction ) 유기물질 (sug ar )을 얻는다. 명반응은 틸라코이드라고 불리우는 엽록체의 이중막 내부 에 존재하는 막에서 일어나며 명반응 과정에서 암반응에 쓰일 AT P와 NADPH가 만들어 진다. 암반응은 엽록체 내의 기질인 스트로마(str om a )에서 수행된다. 에너지를 생성하는 호흡과정에서의 산화반응과 같이 광합성은 산 화환원 반응을 수반한다. 전반적인 과정은 물의 산화(전자를 떼어내는 산화 반응, 부산물로 O2가 방출된다)와 CO2의 환원에 의한 탄수화물과 같은 유기 화합물의 생성과정이다. 이 반응의 역반응, 즉 CO2와 H2O를 생성하는 미토 콘드리아의 호흡과정은 에너지를 방출하는 자발적인 과정이지만, 광합성은 빛 에너지의 유입이 없이는 일어날 수 없는 비자발적 과정이다. 호흡의 경우 전자가 탄수화물로부터 이탈되고 에너지 준위가 낮은 방향으로 이동되어 H+ 와 함께 강한 전자수용체인 O2와 결합하여 안정된 H2O를 형성한다. 반대로 광합성에서는 H2O로부터 비교적 약한 전자 수용체인 CO2로 전자를 이동하 게 하기 위하여 높은 에너지 준위로 전자를 움직이는 데 빛 에너지를 이용 한다. 명반응에서 이 전자가 여러 전자운반체를 거쳐 NADP+를 환원시킨다.
고등 식물에서 대부분의 빛 에너지는 엽록소 a와 엽록소 b에 의하여 흡 수된다. 엽록소는 엽록체 내의 틸라코이드 막에서 단백질과의 비공유결합 상 태로 존재하며, 이를 엽록소- 단백질 복합체 (chlorophyll- protein complex ; CP 복합체)라 부른다. 이들은 두 광계, 광계 1과 광계 2를 구성하며, 각 광계 의 반응 중심 (reaction center ; RC)은 core complex (CC)와 광포획 엽록소 a/ b 복합체 (light h arv esting chl a/ b complex : LHC)라 불리우는 CP 복합체 로 둘러싸여 있다.
광계 2에서 (안테나 또는 광포획) 엽록소에 의하여 흡수된 빛에너지는 먼 저 에너지전이과정을 통해 RC2를 구성하는 P (P6 8 0)를 P*의 들뜬상태(여기상 태)로 되게한다. 들뜬상태의 P*는 전하분리과정에 의하여 전자를 다음 전자 받게인 I(고등식물 광계 2에서는 pheophytin )에 넘겨주어 P+I-로 되며, 다음 전하안정화과정에 의하여 전자를 QA (fir st quinone acceptor )에 전달하고 이 전자는 QB (second quinone acceptor )를 거치는 일련의 전자전달계 과정을 통하여 NADP+를 환원시킨다.
에너지 전이과정이 일어나기 위하여 안테나 역할을 하는 엽록소 분자들 이 빛 에너지를 흡수하여 들뜬상태로 되어야 한다. 엽록소는 빛을 비추면 녹 색으로 보인다. 이것은 가시광선 영역 중 420 nm근처의 파란색과 660 nm근 처의 적색을 흡수하고 녹색을 투과하고 반사하기 때문이다. 안정된 가장 낮 은 에너지 상태 즉 바닥상태(또는 기저상태: ground st ate)에 있는 엽록소 분 자는 빛을 흡수하면 들뜬상태(excited state)의 분자(Chl*)로 (상태)전이된다.
들뜬상태는 그 에너지 수준에 따라서 에너지 수준이 낮은 것부터 첫째, 둘 째, 셋째 들뜬 상태로 부른다.
그림 1에서 엽록소 분자의 흡수스펙트럼에서 적색 지역의 흡수는 바닥상 태에서 첫째 들뜬상태로의 전이를 보여주며, 보다 높은 에너지를 가지는 청 색광의 흡수는 높은 에너지 수준의 들뜬상태로의 전이가 일어남을 의미한다.
빛의 흡수과정은 대개 femtosecond (10- 15s ) 수준에서 일어난다. 청색광의 흡 수와 같이 첫째 들뜬상태 보다 높은 에너지 수준의 들뜬 상태로 전이된 엽 록소 분자는 매우 불안정하여 신속히 에너지의 일부를 1 picosecond(10- 1 2s )
이내에 열로써 주변으로 발산시키고, 첫번째 들뜬상태로 되어 수
n anoseconds (10- 9s ) 동안 안정된 상태로 머물게 된다. 그러므로 어떤 종류의 빛을 흡수하더라도 전자는 약간의 시간차이는 나지만 같은 에너지 정도를 가지게 되며, 그이후의 모든 반응은 같은 시작 지점인 "ex cited state one"에 서 시작된다. 이 상태에서 들뜬상태의 엽록소가 가지고 있는 에너지는 크게 네가지 경로로 소실된다(그림 1). 순서는 중요도와 무관하지만 우선 첫째로 그 에너지가 광자의 형태로 재방출되어 바닥상태로 되돌아오는 경로이며 이 빛을 형광(fluorescence)이라 부른다. 형광 스펙트럼의 모양은 적색부위의 흡 수스펙트럼이 거의 항상 약 10nm 정도의 장파장으로 이동되어 나타난다. 이 를 Stokes shift 라 부르는데, 이는 첫째 들뜬상태에서 에너지의 일부가 형 광광자로 방출되기 전에 열로 방출되었기 때문이다. 둘째 경로로 들뜬 엽록 소는 광자의 방출없이 들뜬 에너지가 직접 열로 전환되어 바닥상태로 되돌 아갈 수도 있다. 세번째 경로로 뜰뜬 상태의 에너지가 인광의 형태로 방출된 다. 네 번째 경로로 들뜬 상태의 에너지가 광화학 반응을 일으키기 위해 사 용되어진다. 이 광화학 반응이 효율적으로 일어나기 위해서는 광화학 반응 속도가 엽록소 분자가 들뜬상태에서 수 nanoseconds 동안 머무는 기간, 다 시말하면 형광의 수명 보다 훨씬 빨라야 한다. 즉, 광합성에 의한 에너지 저 장과정에서 처음 일어나는 초기 광화학 반응은 알려진 가장 빠른 광화학반 응 중의 하나로서 picoseconds (10- 1 2s ) 수준에서 진행된다. 이외에도 들뜬에 너지는 다른 화합물로 에너지 전이 등 여러 경로를 거쳐 소멸될 수도 있다.
이상에서 보듯이 엽록소가 흡수한 에너지는 크게 열, 형광 및 광합성(초 기 광화학반응)에 이용되므로 광합성 활성은 형광 세기의 변화로 간접적으로 측정할 수 있다. 즉 형광의 증가는 광합성 활성의 감소를 의미한다. 형광분 석법은 비파괴적인 방법으로 광합성 및 식물의 생리상태를 연구할 수 있는 좋은 방법으로 많은 연구자들에 의해 형광분석법이 발달되어왔다[1, 2, 3, 4, 5, 6]. 본 리뷰에서는 엽록소형광 분석을 통한 광합성 연구방법에 대해 알아 보고자 한다.
F ig . 1. T he ex cit ation of chlorophyll by light . T he par allel lines repres ent energy sub - st at es electronic orbit als . T hu s the ener gy deliv er ed by the ab sorption of a blue photon (left ) is sufficient to r ais e an electr on t o
"ex cit ed st at e tw o" from w here it r apidly return s by a pr oces s of r adiationles s de- ex cit ation . "cascading " through sub - st ates , t o ex cit ed st ate "on e". A phot on of r ed light (centr e) only h as enough en ergy t o r aise an electron t o ex cited st at e "on e" but this ex cited st at e is sufficiently st able t o permit u s eful chemical w ork and is , in effect , the st artin g point of all other ev ent s in phot osynthesis . "Ex cited st at e one"
can also dis sipat e energy by re- emitting light as fluor escence. (Adopt ed from Ref. [7])
2 . 형 광 측 정 의 원 리
엽록소에서 방출되는 형광은 광합성 초기 광화학 반응에 사용되지 못한 빛 에너지의 일부가 다시 빛으로 방출되는 것이다. 엽록소 분자가 여기상태 에서 기저상태로 돌아오는 방법 중 형광으로 여기에너지를 방출하는 양은 in v iv o에서 약 3 - 5% 정도로 아주 적은 비율을 차지한다. 에탄올이나 아세톤 과 같은 용액에 엽록소가 녹아있는 경우에서 약 30% 정도가 형광으로 방출 된다. 광을 측정하기 위해서는 종종 photomultipliers를 사용하지만 식물 잎 에서 나오는 형광은 photodiode만으로 충분히 측정이 가능하다. 하나의 문제 점은 photodiode가 형광과 actinic light을 구별하지 못한다는 것인데 이것은 광학 필터를 사용하여 해결할 수 있다. 광합성을 일으키는데 가장 효과적인 광은 적색광 이다. 그러나 엽록소 a의 흡수 peak는 680nm로 엽록소 a의 형 광 peak인 680nm와 충분히 멀리 있지 않다. 이러한 이유로 엽록소 형광 peak와 멀리 떨어져 있는 청색광을 이용하여 광합성을 유도하기도 한다.
3 . 형 광 유 도 곡 선
엽록소 형광과 광화학 반응의 관계에 대해서는 Duy sens와 Sw eer s[8]가 처음으로 설명하였다. 일반적으로 광합성과 열로 방출되는 양이 가장 적을 때 형광이 가장 강하다. 그러므로 형광의 변화는 광합성 효율과 열 방출의 변화를 반영한다. 잎을 어두운 곳에 수분 정도 두어 암적응이 된, 다시 말하 면 전자전달과정의 전자운반체들이 산화된 상태의, 식물 잎에 빛을 쪼이면 그림 2에서 보는 바와 같이 형광이 유도된다. 이 현상을 Kaut sky 효과 또는 형광유도(fluorescence induction )과정이라고 부른다. 형광유도곡선은 OIDP SMT 라는 꼬리표를 붙인다(그림 2). 광을 조사하면 형광은 즉시 O"(the lev el of "con st ant flu oescen ce")까지 증가한 후 I (inflection or int erm ediary peak )까지 초기증가가 일어나며 "D" (dip)를 거쳐 "P "(peak )까 지 증가한 후 "S"(quasi- steady - st ate)를 거쳐 T "(termin al v alue)까지 감소 한다(그림 2). 때때로 3 ～ 4 분 암적응 후 아주 약한 광을 조사하면 S"와 T "사이에 M "(secondary m aximum )을 가진다. O"에서 P "로의 형광의 증 가는 매우 빠르게 일어난다(약 1 ～ 2초). 그러나 형광의 변화는 시료와 조 사되는 광의 세기에 의존적이다. F o는 광계 2에 있는 엽록소 a 분자가 여기 된 후 에너지가 반응중심으로 이동하기 이전에 나오는 형광으로 여겨지고 있으며, 이때 QA는 완전히 산화되어 있는 상태이다. I"와 "D"는 QA의 환원
과 재산화 사이의 불균형을 반영하는 것으로 QA의 환원에 의해서 "I"가 유 도되고 QA에서 QB로 전자가 전달되어 QA가 재산화되면 D"가 유도된다.
P "에서 plastoquin on e pool과 QA는 크게 환원되어있다. P"에서 "S"로의 형 광 유도는 약 10초 내에 일어난다.
P SMT "로의 형광의 변화는 수분이상 소요되며 탄소동화의 개시와 관련 이 있다[9, 10, 11]. 그림 3에서 보여주는 바와 같이 순탄소동화의 개시와 S - M tr an sient의 시작이 서로 일치하며, 탄소동화의 변화와 "T "까지 도달하 는 형광유도곡선의 변화는 서로 anti- parallel한 것을 보여주고 있다 (그림 3). P에서 T 로의 형광의 감소에 영향을 미지는 요소는 크게 두 가지가 있다 [12, 13, 14]. 그중 하나는 QA의 redox st ate이며, 다른 하나는 틸라코이드막 을 가로지르는 양성자 구배이다.
F ig . 2 . Fluores cence induction kinetics . Schem atic represent ation of fast (left ) and slow (right ) fluores cence kin etics during a dark t o light tr an sition show ing the u s e of the OIDP SMT t erminology . (Adopt ed from Ref. [15])
F ig . 3 . Kinetics of 680nm fluores cence emis sion an d CO2 fix ation . (A dopted from Ref. [16]).
4 . 형 광 유 도 과 정 과 광 합 성 효 율
엽록소에서 방출되는 형광은 광합성 초기 광화학반응에 사용되지 못한 빛 에너지의 일부가 다시 빛으로 방출되는 것이다. 이와 같이 버려지는 에너 지로서 형광은 식물에게는 쓸모가 없으나 광화학 반응이 감소하면 형광이 증가하며 반대의 경우에는 증가하는 상보적인 양상을 보이므로, 형광의 측정 및 분석을 통하여 광합성 기구의 구조 및 기능의 변화를 민감하게 알 수 있 다.
암적응된 잎 또는 엽록체 현탁액에 아주 약한 빛을 비추면 F o까지 형광 이 증가한다(그림 4). F o를 "dark " 또는 initial fluores cence"라 한다. 빛이 약할 때는 엽록소가 흡수한 빛 에너지는 광합성에 이용되지 못하고 형광으 로 방출된다. 즉 반응중심에 에너지를 전달 할 수 없는 엽록소 분자들이 많 아지면 Fo값이 증가한다. 일반적으로 식물이 스트레스(특히 heat stress )를 받을 때 F o가 증가한다. 스트레스를 받은 식물에서는 보통 Fm의 감소도 보 여준다. 이들 두 값은 엽록소의 함량이 많으면 큰 값을 나타내므로 잎의 두 께나 나이에 따라 값에 차이가 있으므로 두 값의 비, 즉 Fm/ Fo를 스트레스 지표로 사용한다. F m에서 F o를 뺀 값을 Fv (m ax imum v ariable fluores cence)라 하며 F v/ Fm 값은 광화학 반응에 대한 양자수율의 최대치를
의미한다.
전체 형광유도과정에서 정류상태에 도달할 때까지 길게는 약 30분 정도 의 시간이 소요된다. 이때 형광은 포화광을 비춘 직후나 DCMU의 처리로 광 합성 전자전달을 억제하여 광합성을 억제한 경우를 제외하고는 Fm 보다는 적게 방출된다. 이와 같이 Fm까지 나올 수 있던 형광이 적게 관찰되는 현상 을 형광소멸 (fluorescence quenching )이라 한다. 이 형광소멸은 크게 광화학 적인 소멸 (phot ochemical quenching ; qQ)과 비광화학적인 소멸
(nonphotochemical quenching ; qN )의 두 가지로 구별된다[12, 17].
형광 파라미터를 계산하기 위한 형광유도 곡선은 그림 4에서 보여주고 있다. 측정광(measuring light )을 비춘 후 F o 형광값을 측정하고, 암적응된 잎에 포화광을 비추어 최대 형광 값인 Fm을 측정한다. 광합성이 일어나게하 는 광을 비춘 후 (actinic light, AL), 즉 식물이 광합성을 하고 있는 동안에 포화광을 비추어 측정한 최대 형광 값인 Fm 을 측정한다. actinic light을 계 속 비추면 형광은 계속 감소하여 수분 후 steady - state상태에 도달하게 되며 이때의 형광을 Ft라 한다. Ft측정 후 actinic light을 끄게되면 형광이 F o 값 으로 내려가게 되는데 이때의 형광을 F o '이라 하며, F o보다 낮은 값을 가질 경우 F o 소멸이라 한다.
F ig . 4 . Principles of quenching an aly sis by the s atur ation plu se method.
ML, w eak m odulat ed m easuring light ; SP , s atur ating light puls e ; Al, continuou s actinic light ; F R, far - red light . (A dopt ed from Ref. [27])
4 - 1 . 광 화 학 적 과 정
광화학적 형광 소멸은 항상 Fm '과 Ft 값과 관련이 있다. 가장 많이 사용 하는 파라미터는 광계 2 광화학의 효율(ΦP S I I)로 아래와 같이 계산된다[18].
ΦP S I I = (F m ' - F t )/ F m '
위 파라미터는 광계 2와 연관되어있는 엽록소에 의해 흡수되는 빛의 크 기로 광화학 반응에 이용되어진다. 다음으로 많이 이용되는 파라미터는 광화 학적 형광 소멸(qQ)로 아래와 같이 표시한다.
qQ = (F m ' - F t )/ (F m ' - F o )
qQ는 open P S II의 양을 반영한다. ΦP S I I와 qQ는 세 번째 파라미터인 F v/ Fm과 밀접한 관련이 있다 [14]. 광계 2가 모두 open되어 있는 경우 광계 2의 효율은 최대가 된다. 이때 F v / F m = (F m - F o )/ F m = ΦP S I I/ qQ 가 된다. qQ의 변화는 광계 2의 반응중심이 closure되기 때문이며, 이것은 빛에 의해 광합성이 포화되기 때문에 일어난다. Fv/ Fm의 변화는 비광화학적인 소멸의 효율 변화에 기인한다. 암적응된 잎의 Fv/ Fm 값은 식물 잎이 광합 성을 수행할 수 있는 최대값 즉, 잠재력을 의미한다. Fv/ Fm은 대부분의 식 물에서 건강한 잎의 경우 보통 0.83정도의 값을 가진다[19, 20]. 이 값보다 낮은 값을 가질 경우는 식물이 스트레스에 노출되었을 경우이다.
4 - 2 . 비 광 화 학 적 과 정
비광화학적 형광소멸은 Fm의 변화를 비교하여 측정이 가능하다. NPQ(때 때로 S VN이라 표기함)는 아래와 같은 식으로 나타낼 수 있으며, 0 ～ ∞의 값을 가질 수 있다. NPQ는 F o를 알지 못하여도 계산할 수 있기 때문에 광 하에서 일어나는 변화를 추적할 때 사용이 가능하다.
N P Q = (F m - F m ')/ F m '
NP Q보다 오래된 파라미터인 qN (non - phot ochemical quenching )은 F o를 필요로 하며 아래와 같이 나타낼 수 있으며, 0 ～ 1 사이의 값을 가진다.
qN = (F m - F m ' )/ (F m - F o )
이들 두 파라미터는 열의 소산을 반영한다. 여기에서는 Fo를 사용하였지 만 더욱 정확한 계산을 위해서는 F o '을 이용하여야 할 것이다.
NP Q는 여러 가지 형광의 소광을 포함하고 있다. 대부분의 환경조건에서 NP Q에 가장 큰 영향을 미치는 것은 high energy st ate qu enching (qE )으로 광에의해 유도되는 손상으로부터 식물을 보호하는데 필수적인 기작으로[21], 틸라코이드 루멘의 산성화를 요구하며, 빛에 의한 카로테노이드 제아크잔틴 의 형성을 수반한다[22, 23]. qE는 잎을 암상태에 두면 1분 이내에 없어진다.
두 번째 소광은 st ate transition (qT )이다[24]. st ate tr an sition은 광수확 단백 질의 가역적인 인산화를 수반하며, 약한 광 하에서 광계 1과 광계 2사이의 빛 에너지의 분포를 유지하는데 아주 중요한 역할을 한다. qT 는 암상태에서 수분 내에 없어진다. 그러나 relax ation kinetics로 qE와 qT 를 구분하기는 쉽 지 않다. qT 는 형광의 소광 중 아주 적은 부분만을 차지하며, 또한 약한 광 하에서만 생성된다. 세 번째 소광은 photoinhibition dependent quenching (qI) 이다. qI의 메카니즘은 아직 정확하게 밝혀져 있지 않지만, 크산토필회로에 서 제아크잔틴의 형성이 qI와 관련이 있다는 가정있다[22, 25, 26].
이와 같이 형광유도과정을 측정하면서 주기적으로 포화광을 비추어준 후 곡선의 변화를 분석하면 엽록체 내에 양성자 구배가 얼마나 생겼는지 틸라 코이드 막단백질 인산화가 얼마나 일어났는지, 광저해에 의해 손상이 얼마나 생겼는지 등을 알 수 있게 된다. 광저해는 광합성기구가 필요이상의 강한 빛 에 노출될 때 받게 되는 손상을 의미하며, 이러한 조건에서는 양성자 구배가 크게 생기고 크산토필 회로 (x anthophyll cycle)에 관계하는 색소인 제아크잔 틴 (zeax anthin )의 합성이 촉진되고, PQ pool이 크게 환원되게 된다. 이때 양 성자 구배와 제아크잔틴의 증가는 qE를 크게 하고, PQ의 환원은 여러 막 단 백질의 인산화를 초래하여 qT 가 증가하게 된다. qE와 qT 의 증가는 열의 형 태로 빛에너지가 보다 많이 사라짐을 의미하고, 이는 과다한 빛 에너지로부 터 광계 2를 보호하기 위한 조절기작으로서 광저해에 대한 식물의 주요한 방어기작으로 인식되고 있다.
5 . 결 론
이상에서 설명한 바와 같이 엽록소형광은 광합성 기구의 구성요소에 대 한 연구 뿐만 아니라 환경의 변화에 따른 광합성 및 광합성 기구의 변화를 연구할 수 있는 방법이다. 또한 엽록소형광 분석법은 비파괴적이고, 빠르고,
믿을 수 있는 방법으로 생태학적 연구, 농수산, 임업 분야에서 생산성 및 병 리학적 연구까지 다양하게 이용될 수 있는 좋은 방법이다.
6 . 참 고 문 헌
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