DOI 10.17480/psk.2018.62.4.274
초기 신약개발 단계에서의 신약후보물질 최적화를 위한 물성 스크리닝 방법 검증 및 프로파일링
이진석 · 안성훈*
강원대학교 약학대학
(Received August 2, 2018; Revised August 13, 2018; Accepted August 14, 2018)
Validation and Profiling of Physicochemical Properties Screening Methods for New Drug Candidate Optimization in Early Drug discovery
Jinseok Lee and Sung-Hoon Ahn*
College of Pharmacy, Kangwon National University, Chuncheon 24341, Korea
Abstract — Drug-like properties based on physicochemical properties are important to confer good ADME/PK char- acteristics for sufficiently effective efficacy and safety on preclinical and clinical trials. Therefore, accurate estimation and optimization of physicochemical properties such as ionization constant, lipophilicity, permeability, and solubility are import- ant factors for pharmacokinetic properties including clearance, half-life, bioavailability, drug-drug interactions. This study was performed to validate screening method of physicochemical properties. The commercially available drugs were used to validate analytical method system of physicochemical properties and experimental values were compared with literature values and in silico predictions. The experimental pKa values were in very good accordance with literature values in both case of pKa PRO (r2= 0.82) and GLpKa (r2= 0.87). Experimental values and in silico predictions of lipophilicity were also in very good accordance with literature values (r2 > 0.82). Experimental physicochemical values of KR-62980 as a new drug candidate showed similar values to in silico predictions. Finally, screenings of physicochemical properties can be applied well and this result may cause lowering cost and accelerating screening speed for the integration of ADME/PK screening data in early stage of new drug discovery.
Keywords Physicochemical property, ionization constant, lipophilicity, solubility, in silico prediction, pharmacokinetics, drug discovery
서 론 (Introduction)
신약개발은 여러 분야의 복합적이고 융합적인 연구를 필요로 하는 분야이며, 성공적인 신약개발을 위하여 신약후보물질의 효 능, 안전성 및 약동학 등의 데이터를 이해하고 통합적인 해석이 필요하다.1,2)특히 신약후보물질의 물리화학적 성질에 기초한 약 물의 물성(physicochemical property)과 같은 특성을 평가하고 이를 바탕으로 초기 신약개발 과정에서부터 신약후보물질의 효
과적인 최적화 과정이 필요하며 이는 최근의 신약개발 과정에서 전임상 시험과 임상 시험에서 우수한 효능 및 안전성을 확보를 위해 필수적인 과정으로 인식되고 있다.3,4)신약개발에 있어서 물 성적 정보는 주로 약물의 체내동태와 이에 따른 약효 및 독성에 영향을 미치는 화합물의 물리화학적인 성질을 의미하며, 약물의 분자구조를 바탕으로 수소결합(hydrogen bond), 극성표면적 (polar surface area), 분자량(molecular weight) 등과 함께 실험 적 방법으로 측정되어지는 이온화도(ionizability), 친지질도 (lipophilicity), 투과도(permeability) 및 용해도(solubility) 등이 있 다.5)또한, 신약후보물질의 물성 정보는 후보물질의 체내에서의 흡수, 분포, 대사, 배설 등의 동태(ADME/PK)를 파악하는데 중 요한 요소이고 이러한 물성 정보를 바탕으로 우수한 ADME/PK 특성을 가진 신약후보물질을 최적화하는데도 중요한 역할을 하
#Corresponding Author Sung-Hoon Ahn
College of Pharmacy, Kangwon National University, Chuncheon-si, Kangwon-do 24341, Korea
Tel.: 033-250-6912 Fax.: 033-259-5631 E-mail: [email protected] Short Report종설
는 것으로 알려져 있다.6)신약후보물질의 고유한 물성은 약리적 특성뿐만 아니라 후보물질을 신약으로 개발하기 위하여 제형, 안 정성, 약동학, 약물대사 및 독성 등의 성질을 최적화하는 데에도 큰 역할을 할 수 있다. 생물학적 측면에서, 화합물의 낮은 용해 도, 투과성 또는 안정성은 신약탐색과정의 핵심 요소인 구조-활 성관계(structure-activity relationship; SAR)를 최적화하기 위하 여 이용할 수 있으며, 생체이용률, 약물상호작용과 같은 체내동 태 성질을 결정짓고 약물대사작용 및 생체 단백질의 분자생물학 적 특성에도 영향을 줄 수 있다.
물성 분석기술은 초기 신약개발 과정에서 유효물질 및 선도물질 의 물리화학적 성질의 스크리닝을 통해 선도물질의 설계, 선정 및 최적화를 위해 활용됨으로써 신약개발의 성공확률을 높이고 일련 의 실험을 계획적이고 정확하게 수행할 수 있도록 한다.5,7,8)약물 의 이온화도(ionizability)는 이온화상수 pKa로 표시되며 용해도 및 투과성의 주요 결정인자이다.9)생체액의 pH가 약물의 pKa와 같 을 때, 생체액 내의 이온화된 중성 약물분자의 농도는 동일하다 고 가정할 수 있다.10)이러한 중성 약물분자는 막투과 및 체내동 태에 직접적으로 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 약물의 친 지질도(lipophilicity)는 일반적으로 n-octanol/water 분배시험을 통해 구할 수 있는 LogP 또는 LogD를 사용하여 산정되며 용해 도, 투과성, 약물대사 등과 같은 ADME/PK 특성에 결정적 영향 을 미친다. 용해도(solubility)는 주어진 용액 조건에서의 최대 용 해 농도이며, 그 자체는 위장관 흡수 및 경구 생체 이용률의 중 요한 결정인자이다.11)투과도(permeability)는 생체막 장벽을 통 과하는 약물의 투과속도로 표현되어지며, 위장관 흡수, 혈액에서 조직으로의 분포를 위한 세포막 투과, 치료 표적을 포함하는 세 포로의 약물의 전달, 그리고 간 및 신장에 의한 체내에서의 소실 과정을 이해하기 위한 중요한 요소이다. Caco-2 또는 MDCK 세 포주를 이용한 세포투과도 시험 또는 인공막투과도(parallel artificial membrane permeability assay; PAMPA) 시험 등의 방 법으로 측정할 수 있다.
이러한 방법을 통하여 신약후보물질의 물성 정보를 보다 빠르 고 정확하게 평가하는 것이 후보물질 최적화를 위한 중요한 과정 이며, 이를 바탕으로 우수한 약동학 성질과 결합된 효과적인 약
리적 효능을 갖는 신약후보물질을 얻는 전략을 위해 신약개발의 과정에서 필요한 시험들의 우선 순위를 변경시킬 수도 있다.12) 최 근의 신약개발 동향에 따라 보다 빠르고 효과적인 스크리닝을 위 해 in silico 예측 방법들이 개발되고 있으며,13)이는 대부분의 물 성값이 약물의 화학적 및 구조적 특성에 기인한 것으로 효과적인 in silico 스크리닝을 통한 예측 방법의 사용이 기대되고 있다.
본 연구는 초기 신약개발과정에서 약물 최적화의 결정 요인과 예측 인자로서 고품질의 물리화학적 성질을 얻기 위해 분석 방 법과 시스템을 검증하고 이를 신약개발을 위한 물리화학적 특성 간의 데이터 통합을 위한 자료로 이용하기 위하여 수행하였다.
또한 in silico방법을 통한 예측값들을 실험적인 측정값들과 비교 해보고 이를 응용하여 신약 개발의 초기 단계에서 물리화학적 성 질을 기반으로 한 ADME/PK의 고효율스크리닝의 가능성과 비 용 절감 및 스크리닝 속도의 가속화에 적용 가능성을 알아보고 자 하였다.
실험 방법 (Experimental Methods)
시약 및 재료
본 연구에서 사용한 acetylsalicylic acid, chlorpheniramine, chlorpromazine, cimetidine, clozapine, desipramine, diclofenac, famotidine, flumequine, furosemide, hydrochlorothiazide, hydrocortisone, ibuprofen, imipramine, ketoprofen, papaverine, pilocarpine, piroxicam, probenecid, procaine, promethazine, propranolol, sulpiride, theobromine, theophylline, trimethoprim, warfarin의 표준품은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)로부터 구 입하였다. 유기용매로 사용된 아세토니트릴 및 메탄올은 J. T. Baker (HPLC grade, Phillipsburg, NJ, USA)에서 구입하였다. 2차 증류수 는 Milli-Q system (EMD Millipore Corp., Billerica, MA, USA) 를 이용하여 제조하였다. 그 외 모든 시약은 분석용 또는 구입 가 능한 가장 높은 등급을 사용하였다.
Capillary electrophoresis 방법을 이용한 이온화도 평가 약물의 이온화도 평가를 위하여 capillary electrophoresis 방법을
Fig. 1 − The instrument system of pKa, logP and solubility. pKa PROTM 96XT (A), GLpKa (B), and NEPHELOstar Galaxy (C).
기반으로 pKa PRO™ 96XT (Advanced Analytical Technologies, Inc., Ames, IA, USA; Fig. 1(A)) 장비를 사용하여 이온화 경향을 측정하였다.14-16) Diode-array 방식의 자외가시부흡광도 검출기 가 장착된 capillary electrophoresis 시스템을 사용하여 이온화 되는 화합물은 pH에 따라 산, 염기 또는 양쪽성 화합물로 존재 하는 성질을 이용하여 각 pH별로 화합물과 neutral marker인 DMSO의 이동시간을 측정하여 이를 그래프로 나타내어 pKa값 을 산출하였다. Capillary electrophoresis에서의 모세관의 온도 를 25oC로 유지하였으며 214 nm에서 검출하였다. 시험에 사용 한 모든 완충액과 샘플은 0.45 µm 입자크기의 필터로 여과하여 사용하였다. 24개의 다른 pH값을 가지는 buffer (pH 2~11)를 사용하여 각 pH별 DMSO의 피크와 시험물질의 피크의 capillary 에서의 이동시간을 측정하여 이온화상수 pKa 값을 산출하였다.
적정방법을 이용한 이온화도 평가
약물의 이온화도 평가를 위하여 산-염기 자동적정법(automatic acid-base titration)을 이용하여 시험물질의 이온화도를 평가하였
다.17,18)이온화되는 시험물질은 pH 2~12 범위에서 적정법을 적
용하면 각 적정점에서 pH의 변화가 생기게 되어, 계산된 pH값 과 실제 측정된 pH값의 차이로부터 이온화상수 pKa 값을 계산 하였다. 자외가시부흡광법을 이용하여 난용성 화합물이나 미량 화합물을 측정할 수 없는 pH-미터 적정법의 단점을 극복하기 위 하여 D-PAS (dip-probe absorption spectroscopy)법을 응용하였 다. 미량의 시험물질(약 50~70 µmole)을 사용하여 GLpKa (Sirius Analytical Instrument Ltd, East Sussex, UK; Fig. 1(B)) 분석 장비를 이용하여 0.15 M KCl 20 mL에서 시험물질 적정법을 이 용하여 수행하였다. GLpKa 분석 장비의 pKa LogP 프로그램을 사용하여 pKa값을 평가하였다.
친지질도 평가
약물의 친지질도 평가를 위해 n-octanol/water 분배계수 (partition coefficient; LogP)를 구하였다. GLpKa 장치의 자동적 정법(automated titration method)을 이용하여 25oC에서 측정하 였으며, 적정법의 결과 분석은 해리상수를 구하는 분석법과 동 일하였다.19) LogP 측정을 위해 약 0.2 mg의 시험물질을 사용하 여 214 nm에서 검출하였다. 그 외 GLpKa를 이용한 적정 방법 및 조건은 앞에서 기술한 이온화도를 측정하는 조건과 같은 방 법을 사용하였다. LogP 측정 실험에서는 0.15 M KCl 20 mL에 서 50 µmole의 시험물질 적정법을 이용하여 수행하였으며, n- octanol/0.15 M KCl 완충액의 비율은 0.0025에서 18 사이의 비 율로 사용하였다. 수용액의 부피는 5 mL였으며, n-octanol을 투 여하기 전에 0.15 M KCl로 포화시켜 사용하였다. 최종적인 LogP 값은 상이한 n-octanol/water 부피비에서의 pKa 변화값에 기초 하여 계산되었으며, 이는 GLpKa 분석 장비의 pKa LogP 프로
그램을 사용하여 산출하였다.
용해도 평가
약물의 용해도 평가를 위해서 nephelometry 방법을 이용하였 다.20) Nephelometry는 용액 중의 빛의 산란을 이용하여 용액의 농도를 측정하는 방법으로 laser를 용액에 투과하면 용액 내에 녹지 않은 입자는 산란을 일으키게 되는데 이 산란광의 크기는 용액 내의 입자 수에 비례하기 때문에 이를 이용하여 용액에서 의 용해도를 구하였다. 96-well microtiter plate 를 이용하여 빠 른 속도로 스크리닝이 가능한 NEPHELOstar Galaxy (BMG LABTECH, Ortenburg, Germany; Fig. 1(C))를 사용하여 시험물 질의 용해도를 측정하였다. 시험물질 1 mg을 사용하여 시험원액 은 5% dimethyl sulfoxide (DMSO):95% 인산 완충액 (phosphate buffered saline; PBS) 완충액의 혼합액으로 10 mM로 만들어 사 용하였으며, DMSO의 비율이 일정하게 유지되도록 조절하면서 희석하여 농도별 시험용액을 제조하였다. 모든 샘플을 0.1초 동 안 스캔하고, 각각의 플레이트를 30배 및 90%의 레이저 강도로 판독하여 시료당 생성된 측정치 데이터를 사용하였으며, 이렇게 얻어진 데이터는 NEPHELOstar Galaxy Evaluation 소프트웨어 를 사용하여 시험물질의 용해도 값을 계산하였다.
인공막을 이용한 투과도 평가
약물의 막투과도 평가를 위하여 인공막투과도(parallel artificial membrane permeability assay; PAMPA) 방법을 이용하여 막투 과계수(LogPe)를 측정하였다. 96-well polycarbonate membrane 이 부착된 친수성 여과 플레이트(Millipore, Bedford, MA, USA) 에 인공지질막을 형성시켜 시험약물의 막투과도를 측정하였다.
여과 플레이트의 각 well을 인공막 조성용액(0.5% egg lecithin 을 함유하는 n-dodecane) 5 µL를 조심스럽게 떨어트려 인공지질 막을 형성하였다. Donor 및 acceptor 측의 용액은 2% DMSO가 포함된 인산염 완충 식염수(pH 7.4)로 구성하였고, donor 용액 에 200 µM의 시험물질을 가하였다. 투과된 물질을 효과적으로 측정하기 위하여 receiving plate로 시험물질을 포함하고 있지 않 은 순수한 272 µL의 인산염 완충 식염수(pH 7.4)를 함유하는 Millipore GV 친수성 여과 플레이트를 사용하였고, donor plate 는 272 µL로 채워진 Dynex 96-well 플레이트(Dynex, Ashford, Middlesex, UK)를 이용하였다. Donor 및 receiving plate는 실 온에서 2시간 동안 부드럽게 진탕시키면서 준비한 다음, receiving plate에서 시험물질의 농도를 자외가시부흡광도 검출기(235, 254 nm)와 연결된 HPLC 방법으로 분석하였다. HPLC 시스템은 아세토니트릴/0.1% 포름산암모늄 함유 완충액을 80:20 비율로 이동상으로 사용하여 분석용 column (Phenomenex Gemini 4.6× 50 mm, 2.6 µm; Phenomenex, Torrance, CA, USA)으로 분석하였다. 시료 주입량은 50 µL였으며, 시험물질의 인공막투과
도는 2% DMSO가 함유된 0.5N HCl (pH 1.5) 또는 인산염 완 충 식염수(pH 7.4)로 구성된 용액에서 평가되었다. 각 시험물질 의 겉보기 막투과계수(Pe)는 다음의 식을 이용하여 계산되었다.
Pe= C× -ln (1-Cacceptor/Cequilibrium)
In silico 방법을 이용한 약물의 물리화학적 성질 예측 약물의 이온화상수 및 친지질도 값의 in silico 예측 정보값을 얻기 위하여 시험약물의 구조 정보를 ACD/Percepta (Advanced Chemistry Development Inc., Toronto, ON, Canada) 소프트웨 어에 입력하고 계산되어지는 pKa, LogP, LogPe등의 물성정보 예측값을 구하였다.21-23) 또한 DrugBank database를 통한 Marvin (버전 16.2.29; ChemAxon, Cambridge, Ma, USA)을 이 용하여 pKa 및 LogP의 in silico 예측값을 구하였다.24,25)이들 프로그램으로 예측된 pKa 및 LogP 예측치는 실험적으로 얻어 진 시험약물의 pKa 실험값 및 이미 보고된 문헌값과 비교하였 다. Marvin과 ACD/Percepta는 다른 in silico 프로그램과 비교하 여 정확성과 빠른 성능을 보유하고 있는 것으로 알려져 있다.26,27) ACD/Percepta를 이용한 pKa 예측값은 연관된 핵심 pKa 미세상 수와 함께 미리 정의된 일련의 이온화센터와 다양한 상호작용 상 수 및 상호작용 계산 방법의 데이터베이스를 사용하여 예측값을 도출하였다. 시험약물들의 pKa 예측값은 표준온도(25oC)와 제로 이온강도의 조건에서 분석되었다. 실험적으로 얻어진 시험약물 의 pKa 실험값과 문헌치를 비교하고, 각각의 예측된 pKa 및 LogP값을 실험값 및 문헌치에 대한 상관분석을 하였다.
KR-62980의 물성값 측정 및 in silico 예측치와의 비교 신약후보물질 KR-62980을 검증된 물성 스크리닝 방법을 이용 하여 물성값을 측정하였다. 또한 in silico 방법을 이용한 물성 정 보 예측치를 구하고 이를 실험값과 비교하여 보았다. KR-62980 의 동적 용해도 측정을 위해 DMSO(최종 DMSO로 5%)에 10 mM 시험원액으로부터 KR-62980의 시험용액(200 µL)을 microplate로 옮기고 nephelometer (NEPHELOstar)에 넣고 약 하게 흔들어 주면서 30oC에서 24시간 동안 배양하였다. 시험에 사용된 nephelometer는 635 nm 레이저를 1.5~3.5 mm의 레이 저빔 초점을 갖는 방사 소스로 사용하였다. 검출기에 의해 측정 된 신호는 녹지 않은 물질의 입자 농도에 따라 선형적으로 증가 했다. 용해도는 표준편차 알고리즘을 사용하여 nephelometer 측 정값이 녹아있는 용액의 기본값에서 벗어나기 시작한 농도로 설 정하였다. KR-62980의 이온화 상수 및 친지질성 값은 GLpKa 기기를 사용하여 D-PAS 방법으로 측정하였다. 측정값은 GLpKa 분석 장비의 pKa LogP 프로그램으로 계산하였으며 in silico 예 측값은 ACD/Percepta 소프트웨어를 사용하여 구하였다.
자료 분석 및 통계 처리
측정된 pKa 실험값과 예측값 및 문헌치를 비교하기 위하여 상 관분석법을 이용하여 피어슨 상관계수(Pearson correlation coefficient)를 구하였다. 물성 스크리닝 방법을 이용하여 측정된 신약후보물질들의 분자량(molecular weight; M.W.), 친지질도 (LogP), 막투과계수(LogPe)의 실험값들을 box-and-whisker plot 을 이용하여 표현하였다. 그 외 비교가 필요한 결과는 Student’s t-test를 이용하여 검증하였다.
결과 및 고찰 (Results and Discussion)
Capillary electrophoresis 및 산-염기 적정법을 이용한 이 온화도 평가
약물의 이온화도 평가를 위하여 pKa PRO™ 96XT (Advanced Analytical Technologies, Inc., Ames, IA, USA) 장비를 사용한 capillary electrophoresis 방법과 GLpKa (Sirius Analytical Instrument Ltd, UK) 장비를 이용한 산-염기 적정법으로 이온화 상수 pKa값을 구하였다. 이 방법을 이용한 이온화도 스크리닝 방법을 검증하기 위하여 27개의 시판 중인 약물(acetylsalicylic acid, chlorpheniramine, chlorpromazine, cimetidine, clozapine, desipramine, diclofenac, famotidine, flumequine, furosemide, hydrochlorothiazide, hydrocortisone, ibuprofen, imipramine, ketoprofen, papaverine, pilocarpine, piroxicam, probenecid, procaine, promethazine, propranolol, sulpiride, theobromine, theophylline, trimethoprim, warfarin)을 사용하였으며, 이 시험 약물의 이온화상수를 pKa PRO와 GLpKa를 이용하여 구하고 이 를 문헌치와 비교하였다. 문헌치와 pKa PRO 장비를 이용하여 실험적으로 얻은 pKa값 및 GLpKa 장비를 이용하여 실험적으로 얻은 pKa값을 비교하여 보면, 두 방법으로 구한 pKa값은 모두 문헌치와 높은 상관관계를 보였다. 상관계수 r2값은 각각 pKa PRO를 이용한 경우 0.82 (Fig. 2(A)) 및 GLpKa를 이용한 경우 0.87 (Fig. 2(B))로 유의적인 차이는 없었으나, GLpKa를 이용하 여 구한 pKa값이 더 문헌치와 유사한 값을 얻을 수 있었다. 이 는 이온화도 pKa값을 구하는데 이온화 경향을 측정하기 위해 가 장 일반적으로 이용되어온 산-염기 적정법(acid-base titration)이 좀더 정확한 pKa값을 측정할 수 있는 방법에 해당한다고 볼 수 있다. 하지만, pKa PRO의 경우 capillary electrophoresis 방법 을 토대로 96-well 기반의 고효율 스크리닝에 적합한 장점이 있 고 산-염기 적정법에 기반한 GLpKa 방법에 비해 유의적으로 큰 차이를 보이지 않았으므로 초기 신약개발 단계에서 신속한 스크 리닝을 통하여 pKa 값을 얻고자 할 때는 더 적합한 방법일 수도 있으므로, 신약개발 단계에 따라 그 필요성과 중요성을 기반으 로 측정 방법을 선택하는 게 바람직할 것이다. 두 방법으로 구한
실험적 pKa값도 높은 상관관계를 보였으나(r2=0.92, Fig. 2(C)), 시험약물에 따라 두 가지 방법으로 측정한 pKa값이 다소 상이 한 값을 보이는 경우도 있었다. 두 가지 방법으로 측정한 pKa 값 이 가장 큰 차이를 보였던 약물은 promethazine (pKa PRO 의 경 우 7.17, GLpKa의 경우 8.88, 측정치 차이 1.71)및 imipramine (pKa PRO의 경우 10.62, GLpKa의 경우 9.34, 측정치 차이 1.28) 였다. Promethazine의 경우는 분자구조적으로 phenothiazine 계열 의 유도체이며, imipramine의 경우는 분자구조적으로 phenothiazine 계열과 유사한 삼환계 항우울제(tricyclic antidepressant)에 해당하 므로 방법에 따른 pKa 값이 상이하게 보인 이유는 분자구조적 이 유에 기인한 것이 가장 가능성이 클 것으로 유추된다.
In silico 방법을 이용한 이온화도 예측값 비교
물성값을 보다 빠르고 신속하게 구하기 위하여 시험물질들의 분자구조를 바탕으로 in silico 프로그램에 의해 물성값을 예측하 는 시도가 최근에 많이 되고 있다.22)본 연구에서는 in silico 물 성정보 예측값을 얻기 위하여 ACD/Percepta와 Marvin 프로그 램을 이용하여 pKa 예측값을 구하였다. ACD/Percepta를 통하여 구한 pKa 예측값은 문헌치과 유사하게 예측되었으며(r2=0.92, Fig. 3(A)), Marvin을 이용한 pKa 예측값도 문헌치과 높은 상관 성을 보였다(r2=0.92, Fig. 3(B)). 이렇게 in silico 예측 프로그램 을 이용한 물성 정보값 예측이 상당히 높은 상관관계를 보였던
이유를 고찰하여 보면 물성값이 약물의 고유한 분자구조를 바탕 으로 물리화학적 성질을 보이는 경우에 기인하여 pKa 예측의 경 우 분자구조적 예측이 상당 부분 맞아 들어간다고 볼 수 있다.
또한 이는 많은 프로그램들이 약물의 구조를 바탕으로 물성값을 예측하는데 기존 약물의 실험적 정보값을 많이 이용하기 때문에 도 기인할 수도 있을 것으로 판단된다. 또한, ACD/Percepta와 Marvin 두 in silico 예측 프로그램간의 상관관계는 r2=0.94로 문 헌치보다 더 높은 상관관계를 보였으며(Fig. 3(C)), 이는 이온화 도 예측을 위하여 Marvin은 매크로 모드에서 실행되었고 ACD/
Percepta는 GALAS 알고리즘 모드로 실행되었으나, 두 예측 프 로그램은 기존의 pKa 정보값을 바탕으로 분자구조에 기인한 pKa 값을 유사한 방식으로 계산한 것으로 유추된다.
ACD/Percepta 및 Marvin 프로그램에 의한 in silico 예측값과 pKa PRO 장비를 이용하여 실험적으로 얻은 pKa값 및 GLpKa 장비를 이용하여 실험적으로 얻은 pKa값을 비교하여 보면, 모두 예측값과 높은 상관관계를 보였으며, 상관계수 r2값은 ACD/
Percepta로 예측한 값은 pKa PRO를 이용하여 측정한 pKa값과 비교하였을 때 0.85 (Fig. 4(A)) 및 GLpKa를 이용한 경우 0.87 (Fig. 4(B)) 였다. 두 경우에서 유의적인 차이를 보이진 않았으나 산-염기 적정법에 기반한 GLpKa를 이용한 경우가 좀더 상관관 계가 높은 값으로 나타났다. Marvin을 바탕으로 in silico 예측한 값은 pKa PRO를 이용하여 측정한 pKa값과 비교하였을 때 0.83 Fig. 2 − Comparison of pKa values between literature pKa values and observed pKa by pKa PRO (A) or observed pKa by GLpKa (B).
Comparison of two experimental pKa values between pKa PRO and GLpKa (C).
Fig. 3 − Comparison of pKa values between literature pKa and predicted pKa by ACD/Percepta (A) and Marvin (B), and predicted pKa between ACD/Percepta and Marvin (C).
(Fig. 4(C)) 및 GLpKa를 이용한 경우 0.91 (Fig. 4(D)) 였다.
Marvin을 이용한 pKa in silico 예측값은 GLpKa를 이용한 산-염 기 적정법에 기반한 pKa값과 상당히 높은 상관관계를 보였다. 또 한 앞에서 기술한 실험적으로 pKa값을 구하는 두 가지 방법인 pKa Pro 및 GLpKa 측정값에서 서로 차이를 보였던 두 가지 시 험약물의 in silico 예측값을 비교하여 보면, promethazine의 경 우 문헌치는 9.1 및 in silico 예측치는 8.98 (ACD/Percepta) 및 9.05 (Marvin)였으며, imipramine의 경우는 문헌치는 9.4 및 in silico 예측치는 9.49 (ACD/Percepta) 및 9.2 (Marvin)였다. 두 방 법의 차이를 보였던 두 약물의 경우 모두 GLpKa로 측정한 pKa 값(promethazine의 pKa 8.88, imipramine의 pKa 9.34)은 문헌 치 및 in silico 예측치와 유사하였으나, pKa PRO로 측정한 pKa 값(promethazine의 pKa 7.17, imipramine의 pKa 10.62)은 문헌 치 및 in silico 예측치와 다소 차이를 보였다. 이 결과를 바탕으 로 고찰하여 보면, phenothiazine 계열 및 이와 유사한 삼환계 항우울제의 경우는 pKa PRO를 이용한 capillary electrophoresis 방법을 토대로 고효율 스크리닝 방법으로 pKa값을 구하는 것보 다 GLpKa를 이용하여 산-염기 적정법으로 구하는 것이 더 적절 할 것으로 사료된다. 하지만, 아직 약물의 분자구조에 기인하여
capillary electrophoresis 방법 혹은 산-염기 적정법 중 어떤 방 법이 더 적절한 지에 관한 논의는 현재까지 보고된 바가 거의 없 으므로 추후 실험을 통해 더 자세한 논의를 하는 것이 바람직할 것으로 판단된다.
친지질도 평가
약물의 GLpKa 장비를 이용하여 자동적정법(automated titration method)으로 앞에서 기술한 시험 약물(acetylsalicylic acid, chlorpheniramine, chlorpromazine, cimetidine, clozapine, desipramine, diclofenac, famotidine, flumequine, furosemide, hydrochlorothiazide, hydrocortisone, ibuprofen, imipramine, ketoprofen, papaverine, pilocarpine, piroxicam, probenecid, procaine, promethazine, propranolol, sulpiride, theobromine, theophylline, trimethoprim, warfarin)들의 n-octanol/water 분배 계수(partition coefficient; LogP)를 구하였다. 이렇게 측정한 시 험 약물의 LogP값을 문헌치 및 ACD/Percepta를 통하여 구한 in silico 예측치는 문헌값과 유사성을 비교하였다. 문헌치와 in silico 예측치는 높은 상관관계를 보였으며(r2=0.89, Fig. 5(A)), LogP 예측치가 문헌치와 높은 상관관계를 보이는 이유는 pKa의 경우 Fig. 4 − Comparison of pKa values between predicted pKa values by ACD/Percepta and observed pKa by pKa PRO (A) or observed pKa by GLpKa (B) and comparison of pKa values between predicted pKa values by Marvin and observed pKa by pKa PRO (C) or observed pKa by GLpKa (D).
와 마찬가지로 이러한 물성값들이 약물의 분자구조를 바탕으로 물리화학적 성질을 보이는 경우에 기인하는 것으로 판단되며, 따 라서 LogP값의 경우도 분자구조를 기반으로 하는 in silico 예측 이 높은 상관관계를 보인다고 볼 수 있다. 문헌치와 GLpKa 장 비를 이용하여 실험적으로 얻은 LogP값을 비교하여 보면 비교 적 높은 상관관계를 보였다(r2=0.82, Fig. 5(B)). LogP의 경우는 비슷한 자동적정 방법을 이용하여 구한 pKa값에 비교하면 상관 관계가 다소 떨어지는데(pKa 경우 r2=0.87, Fig. 2(B)), 이는 LogP 측정값을 위해 구해지는 n-octanol/water 분배가 pKa의 이 온화도를 바탕으로 분배계수가 지배를 받기 때문에 pKa값에 비 해서 다소 오차가 크게 나타난 것으로 판단된다. 하지만 GLpKa 장비를 이용한 LogP값도 초기 신약개발 단계에서 신속하게 LogP 값을 측정하여 이후 과정에서 주로 약물의 체내동태와 이에 따 른 약효 및 독성에 미치는 화합물의 물리화학적인 성질을 빠르 게 파악하기 위해 적절한 방법으로 판단된다.
인공막을 이용한 투과도 평가
인공막투과도(parallel artificial membrane permeability assay; PAMPA) 방법을 사용하여 앞에서 기술한 시험약물의 투 과도를 측정하였다. 인공막 형성을 위하여 0.5% egg lecithin을 함유하는 n-dodecane을 사용하여 실험적으로 구한 각 시험약물 의 막투과계수(Pe)를 ACD/Percepta를 통하여 구한 in silico 예 측치와 유사성을 비교하여 본 결과, 두 방법은 상관계수 r2=0.69 이었다(Fig. 6). 이를 통해서 유추해 보면, 막투과도 또한 어느 정 도 수준에서 예측이 가능한 것으로 판단된다. 하지만, 앞에서 논 의한 이온화도나 친지질도 같은 물성값에 비해서 예측치와 실험 치가 차이를 보이는 것으로 보였는데, 본 연구에서는 많은 시험 약물의 경우 예측치에 비하여 실험적 막투과계수 측정치가 낮게 나타났다. 그 원인은 막투과도값도 약물의 분자구조적 특징 및 친지질도와 같은 물성값에 기인하나 이를 바탕으로 간접적으로 결정되어지는 이차적인 물성 정보값이기 때문일 것으로 사료된 다. 또한, 인공막투과계수는 실험적으로 조성되는 인공막의 조성
액, 두께, 상태 등에 의해서도 영향을 받는 값으로서 그 조건들 을 일관되게 계산하여 막투과계수를 예측하는데 한계가 있다고 할 수 있다. 하지만, 이러한 이유로 다른 물성값에 비하여 막투 과계수 실험값들도 실험실간의 오차도 다소 존재하는 것으로 알 려져 있으며 본 연구를 통해 나타난 상관관계를 보면 초기 신약 개발 단계에서 후보물질의 막투과 경향을 비교하기 위해서는 유 용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
KR-62980의 물성값 측정 및 in silico 예측치와의 비교 신약후보물질 KR-62980을 본 연구에 사용한 물성 스크리닝 방법을 이용하여 물성값을 측정하고 이를 in silico 방법을 이용 한 물성 예측치와 비교하여 보았다(Table 2). KR-62980의 용해 도값은 물에서 11±0.79 µg/ml 이었으며 이 값은 in silico 예측 치인 12 µg/ml과 유사한 값으로 측정되었다. KR-62980의 pKa 값은 6.45±0.03 으로 예측치인 6.3과 유사한 값으로 관찰되었다.
LogP값의 경우는 실험값이 3.23±0.07으로 예측치 4.05 값과 다 소 다르게 측정되었다. 하지만, 이 값은 Lipinski’s rule에 의한 cLogP값 5 이하를 충족하였고 예측치를 바탕으로 화합물의 친 Fig. 5 − Comparison of LogP values from predicted (A) and observed LogP (B) compared with Literature LogP values.
Fig. 6− Comparison of LogPe values between predicted and observed LogPe.
지질도 경향을 빠르게 파악하는 데도 큰 문제가 없는 값으로 판 단되었다. 따라서 신약후보물질 KR-62980의 경우는 본 연구에 사용된 in silico 예측치와 실험값과 유사한 값을 보였다.
신약후보물질의 물성값의 분포 경향
신약후보물질로 개발되고 있는 후보물질들을 앞에서 검증한 고효율 물성 스크리닝 방법으로 시험하여 그 측정값들을 box- and-whisker plot을 이용하여 나타내었다(Fig. 7). 시험대상 신약 후보물질은 무작위적으로 선택된 것으로 특별한 질병치료제 및 특정 골격구조를 가지는 물질이 아니었다. 따라서 후보물질들의 고유한 물리화학적 성질인 물성값은 물질들의 분자구조에 영향 을 많이 받기 때문에 이 물성값이 대부분의 신약후보물질의 경 우를 대변한다고 할 수는 없다. 하지만 다양한 신약개발 과정의 후보물질들의 값을 정리하여 신약후보물질의 물성값의 대략적인 경향을 알아보고자 하였다. 또 이 값을 Lipinski의 “Rule of Five”
조건과 비교하여 보았다. “Rule of Five”는 화이자제약의 Lipinski 박사가 약물을 평가하거나 특정 약리학적 또는 생물학적으로 유 Table I − List of test drugs and their basic physicochemical properties such as molecular weight (MW), formula, reference pKa and logP values,
hydrogen acceptor count, hydrogen donor count, polar surface area, and rotatable bond count.
Drugs MW Formula Literature
pKa*
Literature logP*
Hydrogen Acceptor Count
Hydrogen Donor Count
Polar Surface Area
Rotatable Bond Count
acetylsalicylic acid 180.16 C9H8O4 3.49 1.19 3 1 63.6 3
chlorpheniramine 274.79 C16H19ClN2 9.13 3.38 2 0 16.13 5
chlorpromazine 318.86 C17H19ClN2S 9.3 5.41 2 0 6.48 4
cimetidine 252.34 C10H16N6S 6.8 0.4 5 3 88.89 5
clozapine 326.83 C18H19ClN4 7.5 3.23 4 1 30.87 0
desipramine 266.38 C18H22N2 10.4 4.9 2 1 15.27 4
diclofenac 296.15 C14H11Cl2NO2 4.15 4.51 3 2 49.33 4
famotidine 337.45 C8H15N7O2S3 10.5 -0.64 8 4 175.83 6
flumequine 261.25 C14H12FNO3 6.27 1.72 4 1 57.61 1
furosemide 330.75 C12H11ClN2O5S 3.52 2.3 5 3 122.63 5
hydrochlorothiazide 297.74 C7H8ClN3O4S2 7.9 -0.07 5 3 118.36 1
hydrocortisone 362.46 C21H30O5 13.87 1.79 5 3 94.83 2
ibuprofen 206.29 C13H18O2 4.91 3.97 2 1 37.3 4
imipramine 316.88 C19H24N2 9.4 3.9 2 0 6.48 4
ketoprofen 254.28 C16H14O3 4.45 3.12 3 1 54.37 4
papaverine 339.39 C20H21NO4 5.9 3 5 0 49.81 6
pilocarpine 208.26 C11H16N2O2 6.78 1.1 2 0 44.12 3
piroxicam 331.37 C15H13N3O4S 6.3 3.06 5 2 99.6 2
probenecid 285.4 C13H19NO4S 3.4 2.3 4 1 74.68 6
procaine 236.31 C13H20N2O2 8.05 2.14 3 1 55.56 7
promethazine 284.42 C17H20N2S 9.1 4.81 2 1 6.48 3
propranolol 259.34 C16H21NO2 9.42 3.48 3 2 41.49 6
sulpiride 341.43 C15H23N3O4S 8.99 1.2 5 2 101.73 6
theobromine 180.16 C7H8N4O2 9.9 -0.78 3 1 67.23 0
theophylline 180.16 C7H8N4O2 8.81 -0.02 3 1 69.3 0
trimethoprim 290.32 C14H18N4O3 7.12 0.91 7 2 105.51 5
warfarin 308.33 C19H16O4 5.08 2.7 3 1 63.6 4
*Literature values are from DrugBank database (https://www.drugbank.ca/).
Table II − Comparison of physicochemical properties (solubility, LogP, and pKa) values of KR-62980 between in silico estimated and experimental values.
Physicochemical property
Estimated value
(ACD/Percepta) Experimental value Solubility
(water) 12 (µg/ml) 11±0.79 (µg/ml)
LogP 4.05 3.23±0.07
pKa 6.3 6.45±0.03
효한 화합물이 어떤 물리화학적 특성을 지니고 있는지 판단하는 데 사용되어 온 규칙으로 지난 20여년간 신약개발과정에서의 후 보물질들의 약물성(drug-like property)의 기본적인 이론으로 인 정되어 온 이론이다.28,29)이 이론에 따르면 신약후보물질들의 임 상시험에서의 성공확률을 높이기 위한 약물성으로서 분자구조식 에서 수소결합 공여자(hydrogen bond donor)가 5개를 넘지 않 아야 하고, 수소결합 수용체(hydrogen bond acceptors)가 10개 를 넘지 않아야 하며, 분자량이 500 을 넘지 않고, LogP 값이 5 를 넘지 않아야 한다고 한다. 시험 대상 신약후보물질의 분자량 평균값은 483 (n=412) 이었으며(Fig. 7(A)) 이는 Lipinski 규칙 의 조건(분자량 500 이하)을 대체로 충족하였다고 볼 수 있다.
Nephelometry 방법으로 구한 374개 신약후보물질의 용해도 평 균값은 113 µM 이었으며(Fig. 7(B)), 이는 대한약전 (XI개정)의 의약품의 용해성 개념으로 대략적으로 환산하면 해당 약물 1 g 을 녹이는데 물이 2000 mL 이상 필요한 경우로 매우 녹기 어려 운 경우에 해당한다. 하지만, 최근의 신약개발 경향을 비추어 보 면 생체내에서 충분히 노출되어 약효가 발현되기 위해서 친지질 성이 충분히 확보된 골격구조를 바탕으로 신약개발 최적화 과정 이 진행되는 경우가 많아 신약후보물질들은 대체로 난용성인 경 우가 많은데, 본 연구에서 측정된 신약후보물질들도 유사한 이 유로 비교적 낮은 용해도 값을 가짐을 관찰하였다. GLpKa로 측 정한 327개 신약후보물질의 친지질도 LogP 평균값은 3.3 이었 으며(Fig. 7(C)), 이는 Lipinski의 “Rule of Five”의 cLogP가 5 이하여야 한다는 조건을 대체로 충족하였다. 따라서, 시험 대상 신약후보물질들은 대부분 적절한 LogP 값을 가진 물질로 판단 되었다. 72개의 신약후보물질의 인공막투과도 LogPe의 평균값은 -6.13 였다(Fig. 7(D)). 이는 인공막투과계수 Pe (1.34× 10-6 cm/
sec)을 로그변환한 값으로, 시험에서 사용된 신약후보물질은 비 교적 양호한 막투과계수값을 가짐을 관찰하였다. 이는 해당 신 약후보물질의 위장관 흡수 및 조직분포에서도 양호한 경향을 보 일 것으로 예상할 수 있는 물성정보값으로 판단된다.
결 론 (Conclusion)
본 연구를 통하여 신약후보물질의 최적화를 위하여 초기 신약 개발과정에서 유용하게 이용될 수 있는 물성 정보값을 얻기 위 하여 문헌치가 보고 되어 있는 시험약물을 이용하여 스크리닝 방 법과 시스템을 검증하였다. 실험적으로 물성값을 측정하는 방법 들과 in silico 예측 프로그램을 이용하여 예측한 값을 구하고 이 들의 상관관계를 구해본 결과, 대부분의 경우 높은 상관계수값 을 가지는 유사성이 관찰되었다. 이를 바탕으로 최근의 신약개 발 패러다임을 반영하고 신약후보물질의 물리화학적 특성 간의 데이터를 통합 정리하고 물성값의 고효율 스크리닝 가능성을 적 용하여 보았으며 본 연구에서 측정한 신약후보물질들의 물성값 들은 Lipinski의 “Rule of Five”를 대체로 반영하고 있었다. 이 를 바탕으로 본 연구에서 수행된 신약후보물질의 물성 스크리닝 방법을 신약개발 단계에 맞게 적용하고 후보물질들의 최적화 과 정에 응용할 수 있을 것으로 기대된다.
감사의 말씀 (Acknowledgment)
본 연구는 2015년도 강원대학교 대학회계 학술연구조성비 및 한국연구재단(2017R1D1A3B03033910)의 지원을 받아 수행되었 으며, 이에 감사를 드립니다.
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Fig. 7 − Observed physicochemical property values of test compounds. Molecular weight (A), solubility (B), lipophilicity (C), and permeability (D).
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