Vol. 44 No. 11 November 2001
난소의 재형성 (ovarian remodelling) 과정은 난소 내 여 러 조절인자들에 의해 성장 및 퇴행 과정을 반복하는 특 징을 가지고 있다.1 황체는 주기적 성장과 퇴행을 보이
며 과립세포의 세포자멸사 (apoptosis)를 통해 황체의 퇴 행이 일어나게 되며,2 이러한 세포자멸사 과정은 난소의 정상 생리에 매우 중요하다.
ATP에 의해 유도된 인간 난소 황체화 과립세포의 세포자멸사에 관한 연구
아주대학교 의과대학 산부인과학교실, 대학원 분자과학기술과*, 의과학연구소†, 자연과학대학 생명과학과‡
김미란・박동욱*・김영아・조태섭
†・황경주・임윤경・민철기
‡=ABSTRACT=
Apopt os is of h um a n lu t ein ized g r a n u losa cell v ia ch a n g e of m it och on dr ia
Mi Ran Kim , M .D ., Don g Wook Par k *, M .S c ., You n g Ah Kim , M .D ., Ta e S eop Ch o
†, M.S c ., Kyu n g J oo Hwan g , M.D.,
Yu n Ky ou n g Lim , M .D ., Ch u r l K Min , Ph .D .
‡Dep artment of Obstetrics and Gynecology, Aj ou University School of Medicine, Dep artment of Molecular Science and Technology, Graduate School, Aj ou University, * Medical Research Center†, Dep artment of Biological Science, College of Natural Science‡,
Aj ou University, Suwon, Korea
Objective : To determine the effects of extracellular ATP on mitochondrial function and apoptosis during human luteinized granulosa cell cultures.
Methods : The addition of various concentrations of ATP (0, 0.1, 0.25, 0.5, 0.75 mM) to luteinized granulosa cells obtained during In vitro fertilization ovum pickup procedures. After culture for 24 hours, purinoceptor activity and functional changes in mitochondria were measured by patch clamp, flow cytometry, and confocal microscopy.
Results : Measurement by patch clamp of the granulosa cell membrane potential after ATP addition to cultured granulosa cells showed that both the inward and outward currents were expressed. After treatment of the granulosa cells with JC-1, measurement of the mitochondrial activity by confocal microscopy showed that the with increasing concentrations of ATP the relative ratio of undamaged mitochondria (red/green ratio) tended to decrease (P=0.027). After double staining of the cultured granulosa cells with Annexin V and Propidium Iodide, quantitative flow cytometry analysis showed that apoptosis increased with increasing concentrations of ATP (7.88%, 8.44%, 11.40%, 13.52%, 18.57%).
Conclusion : The results of this study shows that apoptosis of granulosa cells increases with increasing extracellular ATP concentrations in cultured human luteinized granulosa cells. This is observed to be a consequence of cell membrane purinoceptor activity and functional changes in the mitochondria. It is therefore thought that remodelling processes of the ovarian tissue is regulated by neuroendocrine factors of the extracellular ATP.
Key Words : Purinoceptor, Apoptosis, Luteinized granulosa cell
접수일：2001. 9. 3.
주관책임자：황경주
* 본 논문은 2000년도 아주대학교 의과대학 정책연구과제 연구비 (2000-정책-01)로 수행되었음.
ATP는 자율신경으로부터 세포외유출 (exocytosis)을 통해 분비되어3 근육 수축, 신경전달체계, 외분비 및 내 분비 호르몬의 분비, 면역반응, 염증, 혈소판 응집, 동통 및 심장기능의 조절 등 매우 다양한 분야의 특징적인 생 물학적 작용에 영향을 미친다.4-5 이러한 작용은 세포 표 면에 존재하는 purinoceptor를 통해 이루어지는 것으로 알려져 있다.6 ATP는 일반적으로 세포내에서는 에너지 원으로서 작용하나 세포외부에 존재하는 ATP (extracellular ATP)의 경우에는 어떤 세포에 있어서는 세포용해를 일 으키기도 하며,7 - 8 어떤 세포에서는 세포자멸사를 유발 하기도 한다.9 세포내에 존재하는 ATP는 세포의 주요 한 에너지원으로 사용되며 살아있는 세포에서는 세포 막을 통과하지 못하는 반면 세포외에 존재하는 ATP는 말초신경계 혹은 중추신경계에 있어서 매우 중요한 신 경전달물질로 작용하고 있다.10- 11 인간 및 동물의 난소 에는 교감 및 부교감 신경이 잘 분포되어 있고 이에 의 해 프로게스테론 합성이 조절된다는 연구 결과와12 과 립 세포에서 P2 purinoceptor 수용체가 존재한다는 사실 은13 신경말단으로부터 분비된 ATP가 난소의 기능을 조절하는 중요한 조절 인자로 작용함을 시사한다. 최근 에는 인간의 과립세포에서 purinoceptor를 통한 세포내 칼슘 이온의 변화가 있음이 확인되었고,14 세포내 칼슘 이온의 변화가 세포자멸사의 핵심 신호라는 것이 보고
되어15 - 16 과립세포에 있어서 ATP에 의한 세포내 칼슘
이온 농도의 증가가 세포자멸사와 연관이 있으리라 사 료된다.
또한, 최근 들어 세포자멸사 과정을 미토콘드리아의 기능 손상으로 인한 막전위차 ( m)의 붕괴, 산소 자유 유리기의 생성, permeability transition (PT) pore의 개통 및 cytochrome c의 분비에 의한 caspases의 활성화를 통 해 세포자멸사 과정으로 돌입한다고 보고 있다.17- 19
난소의 생리에 있어서 세포자멸사가 중요함에도 불 구하고 난소 내에서 이를 조절하는 분자생물학적인 과 정은 아직까지 명확히 밝혀져 있지 않다. 따라서 본 연 구진은 ATP를 과립세포 배양시 첨가하여 미토콘드리 아에 미치는 영향을 살펴보고, ATP가 미토콘드리아에 어떠한 영향을 미친다면 이러한 결과가 과립세포의 세 포자멸사와 연관이 있는지 알아보고자 본 연구를 시행 하였다.
연구 대상 및 방법
1. 연구 대상
아주대학교 산부인과 불임클리닉에서 체외수정 및 배 아이식술 (IVF-ET)을 시행하는 환자들로부터 획득한 과 립세포를 사용하였다.
2. 연구 방법
1) 황체화 과립세포 (human luteinized granulosa cell;
hLGC)의 획득과 배양
체외수정 및 배아이식술 (IVF-ET)을 시행하는 환자 들로부터 획득한 과립세포를 사용하였다. 황체화 과립 세포를 혈청이 없는 DMEM-F12 medium (Gibco, Life Technologies, Roskilde, USA)에 수합한 후 적혈구와 분 리하기 위하여 Percoll (Sigma, St. Louis, MO, USA) 용 액을 이용하여 원심분리 하였다. 그 후 과립세포를 trypsin-EDTA solution (0.05% trypsin and 0.53 mM EDT A・4Na in Hanks' Balanced Salt Solution, Gibco, USA) 2 mL와 혼합한 후 37 에서 10분간 진탕 배양하여 단 일세포로 분리하였다. 배양액은 minimum essential medium (MEM; Gibco, USA)에 10% fetal bovine serum (FBS;
Gibco, USA)과 2 mM L-glutamine (Gibco, BRL), 100 U/mL penicillin (Gibco, BRL), 100 g/mL streptomycin (Gibco, BRL)을 첨가하여 사용하였다. 1회 원심분리 한 후 같은 배양액을 이용하여 2 X 105 cells/mL의 농도로 35 mm 배 양 접시에 접종한 후 37 , 5% CO2 배양기에서 12시간 배양한 후 동일한 배양액으로 교환하였다. 과립세포 채취 후 24시간 후에 실험 조건에 따라 0.1 mM, 0.25 mM, 0.5 mM, 0.75 mM의 adenosine tri-phosphate (ATP; Sigma) 를 배지에 첨가하여 24시간 배양한 후 실험을 진행하 였다.
2) Patch clamp analysis를 이용한 purinoreceptor 활성 Whole-cell patch clamp 방법을 이용하여 ATP에 의한 황체화 과립세포의 막전위 변화를 측정하였다. 황체화 과립세포를 1X105 cells/mL의 농도로 poly-L-lysin이 코팅 된 plastic coverslip 위에서 배양하였다. 세포가 들어있는 plastic coverslip을 inverted 현미경 (Diapot 200, Nikon, Japan)의 재물대에 고정시킨 후 21-24℃에서 실험을 진행 하였다. 세포 배양용액과 0.1 mM의 ATP가 들어 있는 시험 용액은 gravity-fed perfusion system를 사용하여 perfusion 하였다. patch electrode는 borosilicate glass tube (TW 150 F-4, World precision Instrument, FL, USA)를 사용하였고 tip의 크기는 0.5 µm 내외, 전체 저항은 2-4 ㏁ 정도로 맞추었다. 전기생리학적 기록은 bath solution (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM Glucose, 10 mM HEPES-Na, pH 7.3, 300 mosmol/L)을 준비하고 pipette solution (140 mM KCl, 5 mM NaCl, 1.0 CaCl2, 1 mM MgCl2 , 5 mM EGTA, 10 mM HEPES, pH 7.3, 285 mosmol/L)은 0.2 µm membrane filter를 이용 하여 걸러주었다. 전기신호증폭기는 Axopatch-1D (Axon instruments, Inc., USA)를 사용하였고, 실험 데이터는 pCLAMP6.0.4 (Axon instruments, Inc., USA)을 이용하여 최종 분석하였다.
3) 손상 받지 않은 미토콘드리아의 확인
배지에 첨가된 ATP의 농도를 달리 한 각각의 검체에 손상 받지 않은 미토콘드리아에만 염색이 가능한 10 µg/ml 농도의 Rhodamine 123 (Molecular Probes Inc., Eugene, USA)을 과립세포에 첨가한 후 37 에서 15분간 배양하고 PBS로 2회 세척하였다. 각각의 검체는 490 nm의 파장에 서 여기 (excitation)되고, 510 nm의 파장으로 발산되는 조건에서 공촛점 현미경 (Confocal microscope MR-AG/2, BIO-RAD, USA)으로 분석하였다.
4) 미토콘드리아의 막전위차( ) 측정
각각의 검체에 5 µg/ml의 JC-1 (5,5',6,6 -tetrachloro-1, 1',3,3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide, Molecular Probe Inc., USA)을 사용하여 37 에서 15분간 배양한 후에 PBS로 2회 세척하여 공촛점 현미경으로 분석하였 다. 각 검체를 490 nm에서 여기시킨 후 각각 510/590 nm 의 파장에서 JC-1의 발현 정도를 관찰하였다.
5) Apoptosis
배양된 과립세포를 혈청이 들어 있지 않은 phosphate buffered saline (PBS) 용액에 resuspension 시킨 후 Annexin V-FITC apoptosis detection kit (PharMingen, San diego, USA)를 이용하여 Annexin V antibody 및 propidium iodide (PI)로 처리한 후 flow cytometry로 정량화 하였다.
Flow cytometry는 single 488 nm 파장의 argon laser가 장 착된 FACScan flow cytometry (Becton Dickinson, San Jose, USA)를 사용하였다. 매 실험 당 최소 10,000개의 세포들로부터 결과를 Lysis II software program (Becton Dickinson, USA)으로 분석하였다.
모든 실험은 ATP의 농도를 서로 달리한 조건에서 각 각 실험을 실행하였다.
6) 통계학적 분석
연구 결과에 대한 통계학적 분석은 SPSS for Windows Release 10.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 프로그램을 이용하였다. Friedmann test를 사용하였고 p<0.05인 경우 통계학적 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
결 과
1. Purinoceptor의 활성
Patch clamp를 이용하여 배양된 과립세포에 0.1 mM의 ATP를 첨가함과 동시에 whole cell recording 기법을 이 용하여 과립 세포막 전위차의 변화를 측정한 결과 inward current와 outward current가 모두 80-100 pA 가량 증가되는 것이 관찰되었다 (Fig 1). Outward current의 존
재는 과립세포가 ATP에 의해 purinoceptor가 활성화되어 세포내 Ca2 +의 농도 증가에 따른 K+ channel이 개통되었 다는 것을 의미하며 inward current의 확인은 K+ channel 이외의 다른 channel도 존재함을 의미한다.
Fig. 1. Whole cell patch clamp analysis of Ca2 +activated K+ channels.
Both inward and outward currents were increased by 0.1 mM (100 mM) ATP administration.
2. 손상 받지 않은 미토콘드리아의 측정
Rhodamine 123을 과립세포에 처리한 후 공촛점 현미 경을 이용하여 측정하였다. 초록색 파장은 손상 받지 않 은 미토콘드리아를 나타내며 과립세포에 첨가된 ATP의 농도가 증가함에 따라 초록색 파장이 감소하여 미토콘 드리아의 손상이 증가됨을 알 수 있었다 (23.5±1.7, 18.7
±1.1, 20.8±1,4, 14.2±1.7, 15.0±2.1) (Fig. 2).
Fig. 2. Mean intensity of Rhodamin 123 measured by confocal microscopy.
The intensity of green color emission (510 nm) were decreased by addition of ATP in a dose dependent manner.
3. JC-1을 이용한 미토콘드리아 막전위차 ( m)의 측정 첨가된 ATP의 농도가 높아질수록 과립세포의 미토콘 드리아가 높은 막전위 (intact mitochondria)를 유지하고 있는 붉은색 파장 (590 nm)의 형광이 감소하고 (32.6±
2.2, 30.2±1.6, 28.1±1.3, 28.2±1.5, 25.3±2.1) 낮은 막전 위 (damaged mitochondria)를 가진 초록색 파장 (510 nm) 의 형광이 증가하여 (11.2±1.4, 10.4±1.6, 12.8±1.2, 14.8
±1.9, 14.1±0.8) (Fig. 3, 4), red/green ratio가 ATP 농 도증가에 따라 유의하게 감소하는 양상을 보였다 (2.49
±0.13, 2.18±0.22, 1.93±0.17, 1.79±0.17, 1.61±0.18) (P=0.027) (Fig. 5). 또한 세포질 내 미토콘드리아의 분포 에 있어서도 높은 막전위를 가진 세포에 있어서는 핵을 중심으로 고른 분포양상을 보였으나 낮은 막전위를 가 진 세포에 있어서는 세포질 내부에 불균등하게 분포하 는 양상을 보였다 (Fig. 3).
High m Low m
Fig. 3. Trasmembrane potential (DYm) of mitochondria evaluated by confocal microscopy after staining with JC- 1(X 400).
The red color is 590 nm wave length emission representing the mitochondria with high membrane potential. The yellow to green color is 510 nm wavelength emission representing the mitochondria with low membrane potential. The mitochondria with high membrane potentials were equally located in cytoplasm.
Whereas, irregular cytoplasmic localization of the mitochondria with low membrane potentials were detected by confocal microscopy (arrow).
Fig. 4. Mean intensity of JC- 1 staining measured by confocal microscopy.
Mean intensity of red color (high membrane potentials) was decreased by ATP in a dose depe nda nt ma nne r.
But, mean intensity of green color (low membrane potentials) was increased by ATP in a dose dependent manner.
Fig. 5. Red/green ratio of JC- 1 staining.
High concentration of ATP decreases red/green ratio of cultured granulosa cells.
4. Annexin V를 이용한 초기 세포자멸사 측정 배양된 과립세포를 Annexin V 와 propidium iodide (PI) 로 염색한 후 flow cytometry로 정량분석 하였다. 분석 결 과 ATP를 첨가하지 않은 대조군에서는 7.88%의 세포자 멸사를 보였으나 ATP의 농도가 증가할수록 세포자멸사 가 증가되는 (8.44%, 11.40%, 13.52%, 18.57%) 양상을 보 였다 (Fig. 6).
Fig. 6. Flow cytometric analysis of extracellular ATP induced apoptosis of cultured granulosa cells.
Cultured granulosa cells were double stained by Annexin V and propidium iodide(PI). Annexin V positive cells(apoptosis) were increased by ATP in a dose dependent manner. But there was no significant PI positive cells (necrosis) detected.
고 찰
본 연구는 인간 난소의 과립세포에 있어서 ATP에 의 한 세포자멸사 과정을 미토콘드리아와 연관된 기전으로 연구한 데 의의가 있다.
세포외 ATP는 purine 신경말단으로부터 유리되어 다 양한 조직에서 세포 표면에 존재하는 purinoceptor를 통 해 여러 가지 작용을 나타내게 된다. purinoceptor는 인지 되는 물질 및 작용기전에 따라 P1 (혹은 adenosine) 수용 체와 P2 수용체로 분류된다.6 P1 수용체는 분자 화학적 혹은 약물학적 특성에 따라 다시 4종류 (A1, A2 A, A2B, A3)의 하위형태로 분류되며 이들은 모두 막 단백질인 G-protein과 연결된 신호전달 경로를 갖게 된다. P2 수용체는
High m
Lo w m
분자적 구조 및 세포신호 전달체계 (signal transduction)에 따라 ligand-gated 이온채널인 P2X 수용체와 G-protein과 연관된 P2Y 수용체로 구분되며 특히 포유동물의 P2 수 용체는 개체의 종 (species) 및 조직 등에 따라서 상이한 기능과 형태를 가지게 된다. 현재까지 각각 일곱 종류의 P2X 수용체 (P2X1-7)와 다섯 종류의 P2Y (P2Y1, P2Y2, P2Y4, P2Y6, P2Y11)수용체가 클로닝 되어있으며 약리학적인 특성 등이 약간 밝혀져 있다. 신경 말단으로부터 세포외유출 과정을 통해 세포 밖으로 분비된 ATP는 P2 purinoceptor 와 결합한 후 G 단백질과 연합하여 phosphoinositide 가수분해 과정을 활성화하여 diacylglycerol과 inositol 1,4,5-triphosphate를 생성하고 protein kinase C (PKC)의 합성과 세포질내의 칼슘 이온의 변화를 초래한다.4,20 이 러한 일련의 과정을 통하여 extracellular ATP는 호르몬 분 비, 막전위 변화 등의 생리학적 과정에 참여하게 된다.5 단일 세포에서 일어나는 signal transduction의 과정은 patch clamp와 같은 전기생리학적인 실험을 통해 알 수 있으며 본 연구에서도 단일 과립세포에서 whole cell patch clamp 기법을 이용하여 ATP가 purinoceptor에 작용 하여 outward current (Ca2 +의 농도 증가에 따른 K+
channel의 개통)와 inward current (Na2 + channel의 개통)가 모두 반응하는 결과를 나타내었다. 이는 P2Y purinoceptor 존재와 더불어 또 다른 유형의 purinoceptor의 존재도 시 사하는 결과로써 수용체의 유형분석에 대한 연구가 더 욱 필요할 것으로 사료된다.
세포자멸사는 세포괴사 (necrosis)와는 차별되는 과정 으로써 세포괴사의 초기 단계에서는 미토콘드리아와 같은 세포 소기관이 세포막의 파괴로 인하여 팽윤 (swelling) 되면서 세포내 물질들이 세포 밖으로 빠져나오게 되어 결과적으로는 염증 반응 및 세포의 붕괴를 초래한다. 반 면에 세포자멸사를 거치는 세포는 수축 (shrinkage), 염색 질 응축 (chromatin condensation), 핵의 분절화 (nuclear fragmentation) 등의 특징적인 형태학적, 생화학적 변화를 초래하며,2 1이 과정은 세포막을 구성하는 인지질 구조의 상실을 통해 이루어진다. 이 때 일어나는 뉴클레오솜간 의 DNA의 붕괴 과정은 DNA laddering으로 나타나고,22 세포 수축, 세포막의 수포화과정 (blebbing)으로 인한 세 포의 파괴는 apoptotic body를 형성하며, apoptotic body는 결과적으로 다른 세포의 식세포작용에 의하여 제거되게 된다.23
세포자멸사 과정은 caspases를 활성화시키는 여러 물 질에 의해 세포 복제 혹은 클로닝을 억제하는 것으로 알 려져 있다. 그러나, 어떤 경우에는 세포질 내 존재하는 미토콘드리아의 막에 손상을 주어 caspases가 활성화되 지 않아도 세포자멸사가 일어남이 보고되어 세포자멸사 과정에 있어 미토콘드리아의 중요성이 대두되고 있다.
미토콘드리아의 손상으로 인한 세포자멸사 과정은 첫째,
전자 전달체계, 산화적 인산화 과정 및 ATP 생성 과정 의 파괴 둘째, caspase 효소를 활성화시키는 단백질의 분 비 셋째, 세포의 산화 환원 전위차 (redox potential)의 변 화 등을 통하여 유도된다.17손상된 미토콘드리아는 미토 콘드리아에 존재하는 불특정성의 통로인 permeability transition (PT) pore의 개통을 유발하여 mitochondrial membrane potential ( m)의 붕괴를 초래하며 결과적으로 ATP 생성에 장애를 초래하여 세포자멸사나 괴사과정으 로 돌입하게 된다.18, 19
세포자멸사를 유발한다고 알려져 있는 감마선이나 ceramide 등을 투여 받은 세포나 Fas ligand와 결합한 세 포에서 세포 전자전달체계가 손상되어 cytochrome c의 분비장애에 의해 세포자멸사가 유발됨이 보고되었다.2 4-25 Caspase를 활성화시키는 단백질의 분비 또한 미토콘드리 아에서 일어나는 주요한 과정으로 cytochrome c, Apaf-1, procaspase-9 등이 세포자멸사 과정에 참여하여 이들은 caspase-9를 활성화하여 미토콘드리아 외막의 permeability transition (PT) pore를 개통시키고 미토콘드리아의 inter- membranous space에 있는 cytochrome c를 세포질 내로 유 출시키게 된다.2 6 산소 자유 유리기는 세포질 내에 존재 하는 미토콘드리아의 전자 전달 체계로부터 방출된 전 자에 의해 생성되며 세포막 손상과27 DNA의 분절화를 일으켜 세포자멸사에 관여한다고 알려져 있다.2 8본 연구 진도 분절화를 보이는 인간 및 생쥐 배아세포에서 산소 자유 유리기와 세포자멸사 과정이 밀접한 관련이 있음 을 보고한 바 있다.29 -30 미토콘드리아에 존재하는 PT pore는 세포자멸사 과정을 총괄하는 것으로 생각되며, 이것은 미토콘드리아의 막전위차 ( m)로 나타난다.3 1정 상적인 세포대사 과정에서 m의 유지는 ATP 합성에 있 어 필수적이며 inner mitochondrial membrane을 통과하는 양자의 전위차에 의해 대략 -180 mV 정도의 음 전하를 띠게된다. 또한 m은 칼슘 이온 (Ca2 +)을 미토콘드리아 내부로 끌어들임으로써 세포에서 필요로 하는 에너지를 생산하기 위한 Ca2 + signal을 유발하게 된다.3 2 그러나 oxidative stress나 ATP의 고갈, Ca2 +의 과다한 유입 등으 로 인한 mitochondrial permeability transition (MPT)의 자 극은 PT pore를 개통시켜 m의 붕괴 및 ATP 생성 장애 로 이어져 세포자멸사나 괴사과정으로 돌입하게 된 다.18, 19
현재까지 세포자멸사 과정에서 중요한 역할을 한다고 알려져 있는 미토콘드리아의 기능을 평가하는 방법은 형광물질을 이용하여 미토콘드리아를 구성하는 요소들 에 의해 변화되는 형광의 정도를 공촛점 현미경하에서 측정하는 방법으로, 보편적으로 쓰여지고 있는 형광물 질은 rhodamine 123 (Rho 123), TMRM 과 TMRE의 derivatives 및 carbocyanine JC-1 등이 있다. 이 중 Rho 123은 488 nm 파장에서 여기되어 515-575 nm 파장으로
발산되며 살아있는 미토콘드리아에서는 모두 염색된다.
반면 JC-1은 막전위차가 약 50 mV 이하일 경우에는 monomer로 존재하며 510 nm 파장의 Stokes shift 10 nm 내의 녹색 혹은 황색으로 발산된다. 그러나 약 140 mV 이상으로 막전위차가 증가되면 J-aggregate를 형성하여 590 nm 파장의 Stokes shift가 없는 적색으로 발산된
다.33 -34 이들 중 가장 신뢰성이 있는 것은 carbocyanine
JC-1으로 알려져 있으며 그 중에서도 red/green ratio 값이 가장 중요한 것으로 알려져 있다.35 본 연구에서도 첨가 된 ATP의 농도가 높아질수록 과립세포의 미토콘드리아 가 높은 막전위 (intact mitochondria)를 유지하고 있는 붉 은색 파장 (590 nm)의 형광이 감소하고 낮은 막전위 (damaged mitochondria)를 가진 초록색 파장 (510 nm)의 형광이 증가하여 red/green ratio가 ATP 농도증가에 따라 유의하게 감소하는 양상을 보여 ATP에 의해 세포자멸사 가 유도되는 것을 관찰할 수 있었다.
세포자멸사와 미토콘드리아 내벽에 존재하는 bcl-2 유 전자는 PT pore와는 독립적으로 이온 채널을 형성하여 세포기질의 용적을 조절하는 작용을 하며,36 미토콘드리 아 내강의 pH를 조절하여 미토콘드리아 외부로 양자를 배출시켜37 Ca2 + 이온의 완충작용을 증가시킨다.3 8 또한 bcl-2 단백질은 미토콘드리아의 완전성 (integrity)을 유지 하게 하여 cytochrome c의 분비 및 caspase 9의 활성을 방 해함으로써 세포자멸사로의 진행을 억제한다고 알려져 있으며 이외에도 저산소 의존성의 세포자멸사를 억제한 다.39 이에 반면 Bax 유전자는 미토콘드리아의 내막에서 ATPase proton pump를 활성화시키거나 세포내에서의 cytochrome c의 분비를 조장하여 세포자멸사를 유도하는 것으로 밝혀져 있다.40 이외에도 caspase를 직접적으로 억제하여 세포자멸사를 억제하는 것으로 알려져 있는 serine/threonine kinase (Akt)는 중요한 세포자멸사 억제 인자로써 bcl-2, bad, caspase 9 등의 활성을 직접적으로 방해하는 것으로 밝혀져 있다.4 1
저자 등은 본 실험을 통하여 인간 난소의 황체화 과립 세포 배양액에 첨가된 ATP의 농도가 증가함에 따라 세 포자멸사가 증가되는 현상을 관찰하여 세포자멸사는 extracellular ATP에 의한 과립세포의 purinoceptor의 활성 에 기인하며, Ca2 +ion channel의 개통에 의한 미토콘드리 아의 기능학적 변화에 따른 막전위의 변화라는 것을 확 인하였다. 이러한 결과는 자율신경계에 의하여 난소 기 능이 조절되고 있음을 뒷받침하는 결과로써 신경 내분 비학의 기본 개념을 이용하여 입증한 것이라고 할 수 있 다. 즉, 난소의 주기적 변화가 extracellular ATP에 의한 신경내분비학적 조절을 받고 있음을 확인하였으며 향후 에는 purinoceptor의 활성을 억제시킬 수 있는 기전을 밝 혀내어 황체기 결함, 습관성 유산, 배란장애, 착상관련 질환 등에 응용하여 과립세포 세포자멸사를 억제할 수
있는 방법을 밝혀내는 연구가 진행되어야 할 것으로 사 료된다.
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=국문초록=
목적 : 세포외 ATP가 인간 황체화 과립세포 배양시 미토콘드리아의 기능적 변화와 세포자멸사 과정에 미치는 영향을 알아보고자 하였다.
연구 방법 : 체외수정술을 시행 받은 환자들을 대상으로 난자채취시 획득한 황체화 과립세포에 각기 다 른 농도의 ATP (0, 0.1, 0.25, 0.5, 0.75 mM)를 첨가하여 24시간 배양한 후 patch clamp, flow cytometry, confocal microscope을 통하여 purinoceptor의 활성 및 미토콘드리아의 기능적 변화를 측정하였다.
결과 : 배양된 과립세포에 ATP를 첨가한 후 patch clamp 기법을 이용하여 과립 세포막 전위차를 측정한 결과 inward current와 outward current가 모두 발현되었다. JC-1을 과립세포에 처리한 후 공촛점 현미경을 이용 하여 미토콘드리아의 활성도를 측정한 결과 ATP의 농도가 높아질수록 손상 받지 않은 미토콘드리아의 상대적 빈도 (red/green ratio)가 감소하는 양상을 보였다 (P=0.027). 배양된 과립세포를 Annexin V와 Propidium Iodide로 이중 염색한 후 flow cytometry로 정량 분석한 결과 ATP의 농도가 증가할수록 세포자멸사의 정도가 증가함을 보여주었다 (7.88%, 8.44%, 11.40%, 13.52%, 18.57%).
결론 : 인간 황체화 과립세포의 배양에 있어서 세포외 ATP는 농도에 비례하여 과립세포의 세포자멸사를 유도하는 것으로 나타났으며 이러한 과정은 세포막의 purinoceptor의 활성 및 미토콘드리아의 기능학적 변화를 통하여 이루어짐을 관찰함으로써 난소의 재형성과정이 세포외 ATP에 의한 신경내분비학적 조절을 받고 있으 리라 사료된다.
중심단어 : 퓨린수용체, 세포자멸사, 황체화 과립세포
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