The Effects of Acupuncture (ST36) on Repeated Nicotine-induced Behavioral Sensitization and C-Fos Expression in the Nucleus Accumbens of the Rats

白鼠에서 足三里 침 자극이 니코틴 반복처치로 유도된 행동적 민감화 및 腦의 측핵에서 c-Fos 발현에 미치는 영향

채윤병¹․심인섭¹․권영규²․양재하²․김미려²․김광중²․함대현¹․황은주¹․이혜정¹

경희대학교 동서의학대학원 침구경락학교실¹, 경산대학교 한의과대학 생리학 및 본초약리학교실²

The Effects of Acupuncture (ST36) on Repeated Nicotine-induced Behavioral Sensitization and C-Fos Expression

in the Nucleus Accumbens of the Rats

Y.B. Chae

․I.S. Shim

․Y.K. Kwon

․C.H. Yang

․M.R. Kim

․ K.J. Kim

․D.H. Hahm

․E.J. Hwang

․H.J. Lee

Dept. of Oriental Medical Science, Graduate School of East-West Medical Science, Kyung-Hee University

Dept. of Physiology and Pharmacology , College of Oriental Medicine, Kyung-San University

Abstract

We have previously demonstrated that repeated injections of nicotine produced an increase in locomotor activity, dopamine (DA) release and c-Fos expression in the nucleus accumbens, one of the major projection areas of the central DA system. Acupuncture as a therapeutic intervention is widely used for the treatment of many functional disorders such as substance abuse and mental dysfunction. In order to investigate whether acupuncture has an influence on nicotine-induced reinforcing and behavioral effects, we examined the effect of acupuncture on nicotine-induced behavioral locomotor activity and c-Fos expression as an important marker of the postsynaptic neuronal activity in the nucleus accumbens utilizing the immunocytochemical detection of the Fos protein.

The male Sprague-Dawly rats were given repeated daily nicotine injections (0.4 mg/kg s.c., twice daily for 7 days) followed by one challenging injection on the 4th day after the last daily injection.

Systemic challenge with nicotine produced a much larger increase in locomotor activity and accumbal Fos-like immunoreactivity(FLI) in nicotine-pretreated rats. During withdrawal period(from 8th day to 11th day) acupuncture at zusanli(ST36), but not at control points(HT7, L3) significantly attenuated expected increase in nicotine-induced locomtor activity and accumbal FLI to subsequent nicotine challenge.

These results demonstrated that reduction in locomotor activity by acupuncture may be mediated by reduction of postsynaptic neuronal activity in the nucleus accumbens. Our results suggest that acupuncture may have therapeutic effect on nicotine addiction.

Key Words : Acupuncture, Nicotine, Behavioral sensitization, C-Fos, Nucleus accumbens, Addiction J. K or. A M – M eridian & Pointology Soc.

•교신저자 : 심인섭, 경기도 용인시 기흥읍 서천리 1번지 경희대학교 동서의학대학원 침구경락학교실, Tel. 031-201-2193, Fax.031-204-4237, E-mail: [email protected]

｢본 연구는 한국과학재단 BK21 project와 보건복지부 한방치료기 술연구개발사업(HMP-99-O-01-0005)의 지원에 의해 수행되었음.｣

Ⅰ. 서 론

흡연이 건강에 해롭다는 사실은 잘 알려져 있으며, 통계에 따르면 미국의 경우 매년 30만 에서 40만 명 정도의 사람들이 직․간접적으로 담배로 인해 사망에 이르고, 매년 3500만 명의 사람들이 금연을 시도하지만 불행히도 1년 이 상 금연을 지속하는 사람은 7% 미만이며 대부 분 며칠이내에 다시 흡연하게 된다고 한다.

담배에 포함되어 있는 수많은 복합물질 중에서 담배의 중독성을 일으키는 물질로 알려진 것은 니코틴이며, 바로 이 니코틴의 강력한 중독성 때문에 이러한 문제가 발생된다고 할 수 있다.

니코틴 중독을 치료하기 위해서 Nicotine gum, transdermal nicotine patches, nasal sprays, nicotine inhalers, bupropion 등의 약 물학적 접근이 이뤄지고 있다.

이러한 새로 운 치료법의 도입과 흡연관련 피해의 심각성에 대한 의식증가가 금연 성공을 매년 20 %정도 증가시키고 있지만, 많은 한계점을 갖고 있는 것이 현실이다.

이러한 니코틴 중독의 심각성으로 인해 다양 한 치료법의 도입이 이뤄져 왔으며, 그 중 하나 로 침 치료가 오랜 기간동안 금연을 위한 치료 수단으로 사용되어져 왔다. 임상적으로 금단증 상의 완화, 금연율 증가 등의 평가지표에 있어 서 침의 효과는 여러 가지 상반되는 보고가 나 오고 있는 실정이다.

이러한 상황에 실험적 으로 니코틴의 약물 중독에 대한 침의 효과 검 증이 요구되고 있다. 침 치료는 예로부터 약물 중독과 정신 신경계통 등의 다양한 질환을 치 료하는데 널리 이용되어져 왔다. 최근 보고된 바에 의하면 전침 자극과 경피신경 자극이 각 각 몰핀과 헤로인 중독의 금단증상을 완화하는 효과와 전침 자극이 알콜 섭취행동 증가를 억 제하는 작용이 증명되어, 침 자극이 다양한 중 독성 약물에 의한 중독현상을 조절하는 효과를 보여주어 니코틴 약물 중독에 있어서도 유효한 치료작용이 기대된다.

니코틴은 니코틴성 아세틸콜린 수용체 (nAchRs)의 효능제로서 코카인, 암페타민 등과

같은 신경자극제(psychostimulant)와 신경 화 학적, 행동학적 특성을 공유한다.

니코틴 은 사람 뿐 만 아니라 동물에게도 강화 현상과 의존성을 일으키는 작용을 하는 약물이다. 실 험동물에서 니코틴은 보행성 활동량(locomotor acitivty)을 증가시키며, 다른 의존성을 지닌 신 경자극성 약물들과 마찬가지로 만성적으로 약 물을 처치할 경우 이러한 행동의 활성화가 더 욱 증대되는 “행동적 민감화 현상 (behavioral sensitization)”이 나타난다. 이러한 “행동적 민 감화 현상”은 약물중독의 발달과 약물에 의한 정신신경증의 지표로 이용되어지고 있다.

여러 선행 연구에서 중뇌변연도파민계 (mesolimbic dopaminergic system)의 활성화 가 니코틴의 강화 현상과 흥분 작용에 중요한 역할을 담당한다고 보고하였다. 중뇌변연도파 민계를 손상할 경우, 니코틴의 강화 현상 (reinforcing)과 보행성 활동의 감소가 나타났 다.

실제로 중뇌변연도파민계는 도파민을 주요 신경전달물질로 사용하는데 복측피개야(ven- tral tegmental area)와 측핵(nucleus accum- bens)에 니코틴을 국부적으로 주입하면 in vitro에서 뿐 만 아니라, 미세투석(microdia- lysis)을 이용한 in vivo 실험에서도 도파민 방 출이 증가되었으며, 전신계로 주입해도 측핵에 서 세포외액의 도파민 농도가 증가함이 관찰되 었다.

니코틴을 주입하기 전에 Haloperidol 등의 도파민 길항제를 미리 처치하게 되면, 니코틴 에 의한 도파민 방출 증가 작용을 억제하여 행 동적 민감화 현상을 차단시켜, 약물 중독의 발 달 및 발현에 있어서 억제효과를 가지고 있다.

24)

그러나, 이러한 약물들이 일으키는 운동실 조, 강직 등의 심각한 부작용으로 인해 새로운 약물의 개발 및 치료법의 필요성이 대두되고 있다.

최근에는 면역조직화학분석법(immunohisto-

chemistry)을 이용하여 proto-oncogene인 c-fos

의 발현 강도와 기간을 통하여 신경의 활성도

를 측정할 수 있어, Fos 단백의 발현을 측정하

여 다양한 행동학적, 약물학적 처치에 의한 신 경의 회로를 관찰하고 있다.

이러한 연구 결과들을 보면, 니코틴의 주입이 측핵(nucleus accumbens), 선조체(striatum), 전전두엽(pre- frontal cortex) 등의 도파민성 신경세포의 투 사부위에서 c-Fos 발현의 증가를 야기하였다.

17, 27-29)

이에 측핵에서 면역조직화학분석법을

이용하여 니코틴의 반복처치로 유도된 “행동적 민감화 현상”에 내재한 신경세포 활성도의 변 화를 관찰하여 침 자극이 니코틴의 중독을 억 제시키는 지 밝힐 수 있을 것이다.

우리는 본 실험에서 니코틴의 반복 투여로 유발된 ‘행동적 민감화 현상’을 통해 설립된 니 코틴 약물중독 동물모델에서 행동학적으로 보 행성 활동량을 측정하고, 측핵 부위에서 c-Fos 발현을 면역조직화학분석법을 통하여 침 자극 이 미치는 작용을 살펴보고자 한다.

Ⅱ. 재료 및 방법

1. 실험 동물

Sprague Dawley 종 수컷 흰쥐 40마리를 사 용하였으며, 실험동물들은 (주) 샘타코에서 공 급을 받아 동서의학대학원 부설 동물 사육실에 서 사육되었다. 실험 시작 전에 사육실에서 1 주일 정도 적응시켰으며 실험 시작시 몸무게는 250∼270g이었으며 4 마리 씩 개별장에 수용 되었다. 주야 주기는 12시간 (조명 상태: 08:00 - 20:00, 소등 상태: 20:00 - 08:00)으로 적당한 온도 상태(22℃±2℃)에서 충분한 먹이와 물을 공급받았으며 모든 약물처치(AM 11:00)와 행 동측정(AM 9:00∼12:00)은 조명주기 중에 일 정한 시간대에 실행되었다.

2. 행동 검사 (보행성 활동량 측정)

2-1. 행동 측정장치

피험동물의 활동량을 정량화하기 위하여, 본 연구에서는 S-MART프로그램(Pan Lab, Spain)을 이용하여 보행성 활동량을 측정하였

다. 크기가 가로, 세로, 높이가 각각 26×30×

45 cm인 검은 색 무광택 아크릴 상자에서 피 험동물의 움직임을 추적하였다. 8 개의 상자 약 2.5 meter 위에 설치된 디지털 카메라에서 얻어진 화상을 컴퓨터에 전달하여, 검은 배경 에 흰색 피사체의 대조의 원리를 이용하여 흰 색 피험동물 상(image)의 중심점을 초당 수 번 을 인식하는 방식으로 피험동물의 움직임을 따 라 추적하였다. 피험동물의 움직임의 궤적을 데이터화하여 움직인 거리를 정량화 하였다.

2-2. 실험절차

실험은 하루에 두 번씩 7 일 동안 연속적으 로 nicotine hydrogen tartrate (0.4mg/kg, s.c.; Sigma, St. Louis, MO)을 처치하는 민감 화 발달단계 (sensitization phase)와 3일 동안 니코틴을 철회하는 약물철회단계(withdrawal phase), 그리고 약물철회기간이 끝난 다음날 다시 동일 용량의 니코틴을 한 번 처치하는 검 사단계(testing phase)로 구성되었다. 한편, 니 코틴의 반복적인 처치에 의한 활동량의 점진적 인 증가로 표현되는 행동적 민감화 현상이 일 어나는 지 확인하기 위하여 통제군은 생리식염 수(1ml/kg, s.c.)만을 반복적으로 투여하였다.

(1) 발달단계

동물을 사육장에서 외부 소음이 차단된 실험 실로 옮겨 각각 무게를 잰 후 8개의 활동량 측 정상자에 개별적으로 넣어졌다. 상자 내에서 60분간의 적응시간(adaptaion)을 거친 후, 다 시 60분간의 기저활동량(baseline)이 측정되었 다. 기저활동량 측정기간이 끝난 후 니코틴 (0.4mg/kg, s.c.)을 투여하고 60분간의 처치후 활동량(aftertreatment;ATM)을 7일 동안 측정 하였다. 약물처치 후 약 6시간 후에 사육장내 에서 한번 더 약물을 주입하였다.

(2) 약물철회단계

발달 단계 후 3일간의 약물철회기간에 동물

을 취혈 자세만 취하고 어떤 처치도 하지 않는

대조군(Holding; n=7)과 신문(HT7; n=6), 태연

(L3; n=7), 족삼리(ST36; n=7) 경혈에 해부학 적으로 상응하는 부위에 양측으로 3분간 침 자 극하는 실험군으로 구분하여 처치하였다.

(3) 검사단계

약물철회단계가 끝난 다음 즉, 마지막 니코 틴 투여한지 72 시간 경과 후에 각 경혈에 침 자극을 한 후, 동일용량의 니코틴을 투여하는 1 회의 검사단계가 실시되었다.

3. 면역조직화학분석법

제 11일 째 검사단계에서 니코틴을 투여하 고, 1시간의 행동검사를 마친 후, pento- barbital (100mg/kg, i.p.)로 마취시킨 후에 심 장을 통해 100ml의 생리식염수로 혈액을 관류 시키고, 1000ml의 4% paraformaldehyde (PFA)로 조직을 고정시켰다. 뇌 조직을 꺼낸 후에 2시간 동안 고정액에 후고정을 한 다음, 20% sucrose용액에 담궈 4℃ 냉장 상태로 overnight하였다. -20℃상태에서 30㎛두께로 뇌 조직을 절편하여 측핵 부위를 취한다.

조직절편은 Phosphates Buffer Solution (PBS)에 3회 세척하여 0.3% Triton X, 0.1%

Sodium

azide, 1:2000 희석된 primary rabbit anti-Fos antibody (Cambridge Re- search Biochemicals, Wilmington, DE)를 이 용하였으며 발색제로는 DAB을 사용하여 Fos protein을 발현시켰다.

4. 통계처리

본 실험에서는 SPSS 프로그램을 이용하여 통계분석을 하였다.

행동 데이터는 약물처치 후 60 분 동안의 총 활동량 혹은 10 분 회기간의 활동량에서 얻어 진 값으로 평가하였으며, 반복 측정법을 이용 한 이원변량분석으로 분석하였고, 각 집단간 차이는 Tukey test로 사후검증을 실시하였다.

면역조직화학분석법의 데이터는 Fos 양성반응 을 보인 신경세포의 평균치를 계산하여, 일원 변량분석법으로 분석하였고, 각 집단간 차이는

Tukey test로 사후검증을 실시하였다. p 값이 0.05이하인 경우에 유의한 차이가 있는 것으로 인정하였다.

Ⅲ. 결 과

1. 행동검사

1-1. 니코틴 반복 처치로 유도된 행동적 민 감화 현상의 발달 및 발현

생리식염수를 처치한 통제군(통제군)의 활동 량은 제 1일째 1997±318, 제 7일째 1628±

196, 제 11일째 1536±121를 나타내며 활동량 이 기저수준으로 일정하게 유지되었다. 니코틴 을 처치한 실험군은 제 1일째 2937±254, 제 7 일째 4009±192, 제 11일째 4896±361를 나타 내며, 니코틴에 반복적으로 노출됨에 따라 활 동량이 점진적으로 증가되는 행동적 민감화 현 상을 보여주었다.

니코틴 반복처치에 대한 효과를 분석한 결 과, 실험군 간에 유의미한 차이를 보여주었다.

Fig 1. The effects of repeated nicotine (0.4mg/kg, s.c. twice per day, n=9) or saline (1ml/kg, s.c. twice per day, n=4) injections on locomotor activity of rats over 11days of treatment (included 3days withdrawal period). Data are presented as mean(±

S.E.M). The locomotor activity over 60 min following drug administration.

* Significant difference from control(saline) value

* P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001

Nicotine-induced Behavioral Sensitization

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000

d1 d2 d3 d4 d5 d6 d7 d11 Day

Activity count s

Saline -saline (n=4) Saline - nicotine (n=9)

** * ** ***

***

〔F(

)=12.638, p<0.001〕행동 측정일에 따 른 집단별 사후분석(Tukey- HSD) 결과, 니코 틴 처치군은 통제군에 비해 통계적인 유의미한 차이를 보이며 높은 활동량을 나타냈다. (p

<0.001 제 11일)

이상에서 소량의 니코틴(0.4mg/kg s.c.)을 7 일 동안 반복적으로 처치함으로써, 니코틴에 의한 행동적 민감화를 성공적으로 유도(발달) 하였으며 일단 유도된 행동적 민감화 현상은 니코틴 처치를 철회한 3일 후에 다시 한번 니 코틴에 노출되었을 때, 행동적 민감화 현상이 유지(발현)됨이 관찰되었다.

1-2. 니코틴 반복 처치로 유도된 행동적 민감 화 현상의 발현에 대한 침 자극 효과 니코틴 반복처치에 대한 효과를 분석한 결 과, 실험군 간에 유의미한 차이를 보여주어 니 코틴으로 행동적 민감화 현상을 유도하였다.

〔F(

)=12.638, p<0.001〕

침 자극하기 전인 제 7일째 행동검사에서,

대조군(holding), 신문자침군(HT7), 태연자침 군(L3), 족삼리자침군(ST36)의 활동량은 각각 4442±211, 4400±282, 4114±315, 4257±

328로 나타났다. 행동 측정일에 따른 집단별 사후분석(Tukey-HSD) 결과, 약물철회기간에 각 경혈에 침 자극을 받을 실험군과 대조군 (holding)은 니코틴을 7 일 동안 반복적으로 처 치하여 행동적 민감화 현상을 유도하는 발달단 계에서 대조군과 실험군 간에 활동량의 차이는 나타나지 않았다. (대조군과 비교에서, 각각 p>1.000, p>0.946, p>0.996)

제 11일째 니코틴으로 검사단계에서, 대조군 (holding)은 통제군에 대해서 니코틴에 의한 행 동적 민감화의 발현이 성공적으로 나타났다.

(5004±181, p<0.001) 신문자침군(HT7), 태연 자침군(L3)은 대조군에 비해서 침 자극으로 인 한 행동적 민감화 발현의 유의한 억제가 나타 나지 않았다. (4860±426, 4449±289, p>0.999, p>0.785) 그러나, 족삼리자침군 (ST36)은 대조군에 비해서 침 자극으로 인한 행동적 민감화 발현을 통계적으로 유의하게 억 제하였다. (3580±210, p< 0.05)

Fig 3. Rats were pretreated with nicotine twice daily for 7 consecutive days and were treated with acupuncture at ST36(n=7), L3(n=7), HT7(n=6) respectively during withdrawal period and tested with a nicotine challenge on day 11. The control group was not given any treatment except a slight grap during 3min and challenge with nicotine(holding).

* Significant difference from control(holding) value

*P<0.05

The Effects of Acupuncture on Nicotine-induced Behavioral Sens itiz ation

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000

d1 d2 d3 d4 d5 d6 d7 d11

Day

Activity counts

S aline -s aline (n=4) Holding(n=7)

HT7(n=6) L 3(n=7)

S T 36(n=7)

*

Fig 2. The effects of systemic nicotine on the locomotor acitivity in nicotine- or saline-pretreated rats. Rats were pretreated with saline(acute nicotine) or nicotine (repeated nicotine) twice daily for seven consecutive days and tested with a nicotine challenge on day 11. The control group was pretreated and challenged with only saline(saline).

* Significant difference from control value and # from saline-pretreated group.

*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, #P<0.05, ##P<0.01

Nicotine-induced Behavioral Sens itiz ation

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000

Saline Acute nicotine Repeated nicotine

Activity counts

***

##

Fig 4. Rats were pretreated with nicotine twice daily for 7 consecutive days and they were treated with acupuncture at ST36(n=7), L3(n=7), HT7(n=6) respectively during withdrawal periods and tested with a nicotine challenge on day 11.

* Significant difference from control(Holding) value

*P<0.05

The Effects of Acupuncture on Nicotine-induced Behavioral Sensitization

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000

Control(Holding) HT7 L3 ST36

Activity counts *

1-3. 검사단계에서 보행성 활동량 비교 (10분 회기별 분석)

검사단계에서 니코틴 약물 투여 후 60분 동 안 활동량의 변화를 10분 단위별로 관찰하였을 경우, 통제군에 비하여, 니코틴 반복처치군이 모든 회기에서 증가된 활동량을 보여주었다.

니코틴 반복처치에 대한 효과를 분석한 결과, 실험군 간의 차이를 보여주었다. 〔F(

)=

13.338, p<0.001〕니코틴 투여 후 10분 회기별 로 집단별 사후분석(Tukey-HSD) 결과, 니코틴 처치군은 통제군에 비해, 약물 처치 후 10분, 20분, 30분에 유의한 증가를 보여주었다. (각각 p<0.001, 0.001, 0.01)

족삼리자침군(ST36)은 대조군(holding)에 비 하여, 니코틴 투여 후 60분 동안의 모든 회기에 서 보행성 활동량이 감소하였으나, 통계적인 유의성은 나타나지 않았다. 각 회기별 분석에 서 신문자침군(HT7)과 태연자침군(L3)은 대조 군과 별 다른 차이를 나타내지 못하였다.

2. 면역조직화학분석법

2-1. 니코틴 반복 처치에 의한 FLI(Fos-like immunoreactivity)의 발현

측핵 core 부위에서 FLI의 발현은 통제군은 11.93±1.49, 니코틴 급성 처치군은 11.54±

1.55, 니코틴 반복 처치군은 19.16±2.72로 각 각 나타났다. 니코틴 반복처치에 대한 효과를 분석한 결과, 실험군 간에 유의한 차이를 보여 준다. 〔F(

)=5.516, p<0.001〕집단별 사후 분석(Tukey-HSD) 결과, 니코틴 반복 처치군은 통제군에 비해서 유의하게 증가하였다.

Fig 5. The effects of acupuncture on locomotor activity tested with a nicotine challenge on day 11. Means(±S.E.M.) Locomotor activity are shown for 12 consecutive 10 min periods, consisting of 6 successive 10 min baseline periods and 6 successive 10 min after treatment periods

The Effects of Acupuncture on Nicotine-induced Behavioral Sensitization (Challenge day 11: 10min x 6 session)

0 200 400 600 800 1000 1200 1400

-50 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40 50 60

Time(Baseline 60 min and After treatment 60 min)

Activity counts

n=4 Saline(n=4) n=7 Holding(n=7) n=6 HT7(n=6) n=7 L3(n=7) n=7 ST36(n=7)

Fig 6. Schematic drawing of showing the

approximate field examined in the nucleus

accumbens (NAs).

(p<0.05) 단, 니코틴 급성 처치군에 비해서 증 가하였으나, 통계적 유의성은 나타나지 않았다.

(p>0.63)

측핵 shell 부위에서 FLI의 발현은 통제군은 9.18±0.80, 니코틴 급성 처치군은 10.27±

1.16, 니코틴 반복 처치군은 21.58±3.61로 각 각 나타났다. 니코틴 반복처치에 대한 효과를 분석한 결과, 실험군 간에 유의한 차이를 보여 준다. 〔F(

)=7.563, p<0.001〕집단별 사후분 석(Tukey-HSD) 결과, 니코틴 반복 처치군은 통제군과 니코틴 급성 처치군에 비해서 모두 유의하게 증가하였다. (각각 p<0.001, p<0.01 ) 니코틴 반복처치에 의한 측핵에서 FLI발현 을 측정한 결과, 니코틴 반복 처치군이 통제군 과 니코틴 급성 처치군에 비해서 측핵 core부 위와 shell부위에서 FLI의 발현이 유의하게 증 가하였다.

2-2. 니코틴 반복처치에 의한 FLI 발현에 대 한 침 자극의 효과

측핵 core 부위에서 FLI의 발현은 대조군은

19.16±2.72, 신문자침군은 19.54±2.38, 태연 자침군은 18.81±1.49, 족삼리자침군은 11.66

±0.99로 각각 나타났다. 니코틴 반복처치에 Fig 8. Photographs illustrating Fos-immunoreac-

tive cells in the nucleus Accumbens after systemic injections of nicotine in saline- (acute nicotine; B) or nicotine-(repeated nicotine; C) pretreated rats. The control group was pretreated and challenged with only saline(saline; A).

Fig 7. Expression of c-Fos in the nucleus accum- bens after systemic injections of nicotine in saline or nicotine pretreated rats. Data are presented as the mean (±S.E.M) of Fos-like immunoreactivity neurons within the retangular grid over the nucleus accumbens at a 100× magnification (n=3∼4 for all groups).

*Significant difference from control value and #from saline-pretreated group.

*P<0.05, **P<0.01, #P<0.05, ##P<0.01

Repeated Nicotine-induced Fos-like Immunoreactivity

0 5 10 15 20 25

core shell

The number of Cells in the Nucleus Accumbens

saline acute nicotine repeated-nicotine

* ***

##

대한 침 자극의 효과를 분석한 결과, 실험군 간 에 유의한 차이를 보여준다.〔F(

)=5.516, p<0.001〕 집단별 사후분석(Tukey-HSD) 결 과, 족삼리자침군은 대조군(holding)에 비해서 유의하게 감소하였다. (p<0.05) 그러나, 신문자 침군과 태연자침군은 대조군과 차이가 나타나 지 않았다. (p>1.00)

측핵 shell 부위에서 FLI의 발현은 대조군은 21.58±3.61, 신문자침군은 11.54±1.11, 태연 자침군은 17.50±1.02, 족삼리자침군은 12.88

±1.47로 각각 나타났다. 니코틴 반복처치에 대한 침 자극의 효과를 분석한 결과, 실험군 간 의 차이를 보여준다. 〔F(

)=7.563 p<0.00 1〕 집단별 사후분석(Tukey-HSD) 결과, 족삼 리자침군과 신문자침군은 대조군(holding)에 비해서 유의하게 감소하였다. (p<0.01) 그러나, 태연자침군은 대조군에 비해서 감소는 하였으 나 통계적 유의성은 나타나지 않았다.

(p>0.535)

니코틴 반복처치에 의한 측핵에서 FLI발현 에 대한 침 자극의 효과를 살펴본 결과, 대조군

에 비하여 족삼리자침군(ST36)은 측핵 core와 shell부위에서 FLI의 발현이 유의하게 감소하 였고, 신문자침군(HT7)은 측핵 shell부위에서 FLI의 발현이 유의하게 감소하였다.

Ⅳ. 고 찰

니코틴을 포함하여 코카인, 암페타민 등의 신경자극성 약물을 반복적으로 주사하면, 약물 의 처치에 따른 보행성 활동의 점진적인 증가 로 표현되는 ‘행동적 민감화 현상’이 나타나는 데, ‘행동적 민감화’란 적은 양의 중독성 약물을 반복적, 간헐적으로 처치하면 보행성 활동 (locomotor activity)과 상동적 행동(stereotypy activity)이 점진적으로 증가하는 현상으로, 신 경계의 비교적 지속적이고 영구적인 변화를 수 반한다는 점과 약리적으로 구분 가능한 2개의 성분 즉, 점진적으로 활동량의 증가가 유도되 는 상태인 민감화 반응의 발달(development)과 일단 유도된 높은 활동량이 비교적 장기간 유 지되는 상태인 민감화 반응의 발현(expression) 으로 구성되어 있다.

따라서 본 실험에서는 반복적인 니코틴 처치로 행동적 민감화 현상을 유도한 후에, 3일간의 약물 철회기간 동안에 침 자극이 행동적 민감화 현상의 발현에 미치 는 영향을 살펴보았다.

조건화된 환경적인 단서와 무관한 약물 자체 로서의 비연합적 요소(nonassociative neural adaptation)와 조건화된 환경적인 단서와 관련 된 연합적 요소(associative neural adapta- tion)의 두 가지 요소의 복합적인 작용에 의해 니코틴의 행동적 민감화 현상이 나타나게 된

다.

따라서, 본 실험에서는 약물과 약물

처치 받는 환경적인 요소의 연합에 의한 작용 에 대한 각 집단간의 편차를 배제하기 위해 모 든 집단은 동일한 환경에서 매일 일정하게 약 물 처치를 받았다.

본 실험에서는 니코틴 중독을 유발하기 위해 7 일간 하루에 2회 씩 0.4mg/kg의 니코틴을 피 하 주사하였다. 통제군인 생리식염수 처치군은 한 시간 동안의 보행성 활동량을 측정했을 때, Fig 9. Effects of acupuncture on Fos-like immuno-

reactivity in the nucleus accumbens. The control group was not given any treatment except a slight grap during 3min and challenge with nicotine(holding). Data are presented as the mean (±S.E.M) of Fos-like immunoreactivity neurons within retan- gular grid over the nucleus accumbens at a 100× magnification (n=3∼4 for all group).

* Significant difference from control(Holding) value

*P<0.05, **P<0.01

The Effect of Acupuncture on Repeated Nicotine-induced Fos-like Immunoreactivity

0 5 10 15 20 25

core shell

The number of Cells in the Nucleu Accumbens

repeated-nicotine HT7-nicotine L3-nicotine ST36-nicotine

* ** **

활동량의 증가는 나타나지 않았다. 니코틴 반 복 처치군은 처음 니코틴에 급성으로 노출되었 을 때에는 통제군보다 약간의 활동량의 증가를 나타내었고, 반복적으로 니코틴에 노출됨에 따 라 통제군 및 니코틴 급성 처치군에 비하여 보 행성 활동량이 점진적으로 증가하여 행동적 민 감화 현상의 발달이 성공적으로 유도되었다.

또한, 7일 동안 반복적인 니코틴 처치 후에 3일 동안의 약물철회기간을 거친 후 제 11일 째 같 은 용량의 니코틴으로 검사하였을 경우, 높은 보행성 활동량이 유지되는 현상인 행동적 민감 화 현상의 발현이 나타났다.

니코틴은 0.078∼0.3mM의 농도로 nicotine cue에 대한 ED50가 나타나며, 동물실험에서

0.1∼0.4mg/kg의 농도로 처치하여 니코틴 중 독모델에 이루어지고 있고, 5번 정도의 약물주 입으로 도파민 반응의 민감화가 형성이 되고, 7일간의 지속적인 처치 후 약물철회를 통하여 니코틴의 금단현상이 나타난다고 보고되고 있 으며 본 실험에서 이상의 결과와 일치하였 다.

한편, 7일 동안 반복적인 니코틴 처치 후에 3일 동안 약물철회기간에 족삼리(ST36)경혈 부위에 침 자극을 거친 후, 제 11일 째 같은 용 량의 니코틴으로 검사하였을 경우, 보행성 활 동량이 유의하게 감소하여 행동적 민감화 현상 의 발현을 억제하는 현상을 보여주었다. 이것 은 침 자극이 니코틴 약물 중독의 치료에 유의 Fig 10. Photographs illustrating Fos-immunoreactive cells in the nucleus Accumbens after systemic injections

of nicotine in acupuncture at HT7(B), at L3(C) or at ST36(D) treated rats. The control group was

not given any treatments except a slight grap and challenged with nicotine(A).

한 작용이 있음을 나타낸다.

니코틴 의존성을 조절하기 위해 patches, chewing gum, nasal spray 등의 니코틴 대체 요법과 침 치료의 효과를 비교하는 임상적인 연구에서 침 치료가 최면효과와 마찬가지로 효 과적이지 못하다는 보고와 이침 요법으로 100Hz 전침 자극이 니코틴 금단증상을 완화하 는데 효과적이지 못하다는 보고가 있다.

한 편, 다른 보고에서 침 치료 후 4년 동안의 금연 율에서 장기간의 지속효과는 없었지만, 단기간 동안 금연을 지속시키는 효과가 있었고, 침 치 료가 다른 방법으로 금연을 시도한 후 실패한 흡연가들에게 효과적이었으며, nicotine chew- ing gum 등의 방법과 유사한 정도의 치료효과 를 보여주었다.

니코틴 중독 치료요법으로서 침 치료는 통증이 없고, 비침습적이며, 경제적 이고, 간편하게 금단증상을 완화할 수 있는 장 점이 있어서, 니코틴 중독에 대한 실험적 동물 모델에서 침 치료 효과 검증으로 보다 우수한 치료방법으로 사용될 수 있을 것이다.

본 실험에서는 니코틴 약물중독 동물 모델에 서 침 자극의 효과를 관찰하기 위해, 가장 관련 깊고 취혈상의 비교적 명확한 경혈을 취하기 위해서 手少陰心經의 原穴인 神門穴, 手太陰肺 經의 原穴인 太淵穴, 足陽明胃經의 合穴인 足 三里穴을 선택하여 피험동물에 적합한 크기의 침을 사용하여 자극하였다.

『鍼灸大成』에서 神門(HT7)은 掌後銳端骨 陷中에 위치하고 手少陰心經의 兪土穴이며 原 穴이다. 心煩, 恐悸, 面赤喜笑, 狂悲狂笑, 癡呆, 健忘 등의 심혈관계질환과 정신신경계통의 질 환에 응용한다. 太淵(L3)는 掌後內側橫紋頭의 動脈中에 위치하며 手太陰肺經의 兪土穴이며 原穴이다. 또한, 八會穴 중의 脈會穴에 해당하 여 胸痺, 咳嗽, 煩悶不得臥, 喘不得息, 心痛脈 澁, 咽乾, 狂言 등의 주로 호흡기계통의 질환에 응용한다. 足三里(ST36)는 胻骨外廉大筋內宛宛 中 兩筋肉分間에 위치하며 足陽明胃經의 合土 穴이다. 心腹脹滿, 腸鳴, 腹痛食不下, 大便不通, 卒心痛 등의 위장관 계통의 질환과 五勞․七傷 등의 소모성 질환 및 狂言, 狂歌妄笑, 恐怒大罵

등의 정신질환에도 사용된다.

여러 실험적 보고에서 神門(HT7)은 심박동 률 감소, 협심증․기관지 천식․ 불면증․치매 등의 효과적인 결과를 보여주었다.

足三里 (ST36)는 진통작용, 위장관 연동 증진 작용, 면역증진작용, 알콜 및 몰핀 등의 중독성약물 금단증상 완화 등의 효과가 밝혀졌고, 신경병 리성 동통, 중풍, 관절염 등의 동물 모델에서도 우수한 효과를 보여주었다.

니코틴은 약리학적으로 심박동량을 증가시 키고, 말초혈관을 수축시키며, 혈압을 상승시키 는 등의 심혈관계 질환을 주로 야기하며, 중추 신경계에 도파민 방출을 증가시켜서 정신분열 증의 양성증상의 범주에 해당하는 현상을 유발 하기도 한다. 정신분열증 환자의 90%정도가 니코틴중독 환자이고, 니코틴중독과 정신분열 증과의 상관관계가 많이 보고되고 있다.

정 신분열증의 신경학적 근저를 이루는 것도 측핵 과 선조체 부위의 도파민의 과도한 방출에 기 인한다는 사실이 실험적으로 증명되었으며, 정 신분열증의 동물 모델도 역시 코카인, 암페타 민 등의 약물을 반복적으로 처치하여, 행동적 민감화 현상과 도파민 방출의 증가를 통해 이 뤄진다.

이러한 신경학적, 행동학적 측면 에서 정신분열증의 동물모델과 매우 흡사하다 는 점등을 고려하여 볼 때, 한의학의 질병관 중에서 “火” 의 범주에서 접근을 해 볼 필요성 이 있다.

『黃帝 內經』에서 狂症에 관해 “足陽明之 脈, 病甚則棄衣而走, 登高而歌, 或至不食數日, 踰垣上屋, 所上之處,皆非其素所能也, 病反能者 何也? 陽盛則四肢實, 實則能登高也 (四肢者, 諸 陽之本也) 熱盛於身, 故棄衣欲走也 陽盛則 使 人妄言罵,不避親疏 而不欲食” 라고 서술하여 사지에 양이 성하여 평소에 하지 못하던 높은 곳에 오르고, 몸에 열이 성하여 옷을 벗고 뛰어 다니는 등의 정신분열증의 양성증후를 나타내 는 것을 기술하였다. 대부분 원인을 火에 기인 한다고 보았다. 치료에 있어서도 張景岳의

『景岳全書』에서 “故治此者,當以治火爲先, 而

或痰或氣, 察其甚而兼治之” 라고 하여 火를 다

스림을 가장 우선으로 하였고, 혹은 痰을 치료 하고 氣를 조절함을 보조적으로 하였다.

『內經』19 病機條에 질병의 발생 기전으로

“火”에 대한 언급이 많이 있다. “諸熱瞀瘈 皆屬 於火”, “諸禁鼓慄 如喪神守 皆屬於火”, “諸病浮 腫 痛酸驚駭 皆屬於火”, “諸逆衝上 皆屬於火”,

“諸躁狂越 皆屬於火” 등의 “火” 에 대한 병리학 적 내용을 요약해 놓았는데, 조급하고 불안하 며 정신이 이상하여 미친 듯이 뛰어다니며, 높 은 곳에 오르려고 하는 등의 증상들을 “火”의 범주에서 설명하고자 하였다. 니코틴, 코카인, 암페타민 등의 약물의 반복적인 처치로 보행성 활동이 매우 증가하고 실험동물의 상태가 매우 각성되는 등의 증상이 유사한 경향을 나타낸 다. 정신분열증의 양성증상의 신경학적 기저가 측핵에서 도파민 방출 증가가 지표가 되는 것 역시 니코틴으로 유발된 행동적 민감화 현상과 관련된다고 할 수 있다.

足三里(ST36)는 足陽明胃經의 合穴로서 陽 明經의 熱을 다스려서 정신적인 흥분상태를 조 절하고, 사지의 운동성을 조절하여 과다한 양 성증상을 억제할 수 있을 것으로 생각된다. 한 편 神門(HT7)은 手少陰心經의 原穴로서 심혈 관계 및 정신신경계통에 작용하여 과도한 정신 적인 흥분이나, 약물에 대한 탐닉 및 금단으로 인한 불안 등을 조절할 수 있을 것으로 생각된 다. 또한, 다른 실험적 보고에서, 인체의 기를 끌어올리는 작용을 갖는 百會에 침 자극은 각 성효과를 증진시키고, 보행성 활동을 증가시켰 다. 이는 각 경혈마다 보행성 활동량에 대한 작 용이 다를 수 있음을 나타낸다.

일반적으로, 중독성 약물에 의한 행동적 민 감화 현상을 담당하는 신경학적 근저(neural substrate)는 중추 도파민신경세포와 그 표적 영역인 측핵과 선조체로 알려져 있으며 니코틴 에 의한 행동적 민감화 현상도 이 두 시스템, 특히 복측피개야 (ventral tegmental area)에 서 기시하여 측핵과 후관(olfactory tubercle)내 의 표적부위에 종지하는 중뇌변연도파민계에 의해 주로 매개된다.

니코틴 반복처치로 유도된 행동적 민감화 현

상을 매개하는 신경학적 기전을 살펴보기 위해 최근 면역조직화학적 방법을 이용하여 proto -oncogene인 c-Fos의 발현의 강도와 기간을 통 하여 신경의 활성도를 측정할 수 있어, Fos 단 백의 발현을 측정하여 다양한 행동학적, 약물 학적 처치에 의한 신경의 회로를 관찰하고 있

다.

여러 연구결과들을 보면, 니코틴의 주

입이 측핵, 선조체, 전전두엽 등의 도파민성 신 경세포의 투사부위에서 c-Fos 발현의 증가를 야기시켰다.

이에 니코틴의 반복처치로 유 발된 행동적 민감화로 인한 실험동물의 뇌에 있어서 c-Fos의 변화를 관찰하고자 도파민의 방출부위인 측핵에서 면역조직화학분석법을 이용한 c-Fos 염색을 통하여 신경학적 활성도 를 확인하여 침 자극이 도파민의 방출과 관련 된 기전에 의하여 니코틴의 행동적 민감화 현 상을 억제시키는지 살펴보았다.

측핵에서 FLI는 통제군 및 니코틴 급성 처 치군에 비해서 니코틴 반복 처치군의 core와 shell 부위에서 모두 유의한 증가를 보였다. 이 는 측핵에서 도파민성 신경세포의 활성을 나타 내어 니코틴 반복 처치에 의한 중뇌변연도파민 계의 활성화를 통해 행동적 민감화 현상이 일 어남을 의미한다.

욕구회로(motive circuit)와 관련된 신경핵은

변연계 핵(limbic nuclei)에서 추체내․추체외

운동체계에 정보의 흐름으로 형성되어, 편도체

는 복측피개야(VTA)와 측핵의 shell부위와

ventral pallidum(VP)의 복내측(ventromedial)

부위에 연접을 하고, 운동성 기능을 조절하는

신경세포는 복측피개야에서 측핵 core부위와

VP의 배외측(dorsolateral) 부위에 연결되어

있다.

측핵은 각각 다른 기능을 수행하는 두

개의 주요 부분인 core부위와 shell부위로 나눌

수 있다.

해부학적으로 측핵 core부위는 운

동성 기능을 조절하는 뇌의 영역에 주로 투사

하고, 배외측 선조체와 밀접한 관련을 갖으며,

측핵 shell 부위는 편도체 등의 변연계의 주요

기능을 담당하여 복내측 선조체와 관련되어 정

서와 관련된 약물탐닉에 대한 motive와 더욱

밀접한 관련을 지닌다.

본 실험에서 족삼리(ST36) 침 자극은 면역조 직화학분석법에 따른 측핵에서 FLI의 감소와 행동학적 검사에서 보행성 활동량 측정에서의 활동량의 감소에서 제시되었듯이 중독성 약물 에 의한 운동성 기능 및 약물의 정신적인 탐닉 의 감소에 모두 관련이 있는 것으로 생각된다.

신문(HT7) 침 자극은 행동학적 검사에서는 유 의한 활동량 감소를 보이지 못했지만, 면역조 직화학분석법에서 측핵 shell 부위에서 선택적 으로 FLI를 감소시켜서 중독성 약물의 탐닉 현 상을 약화시키는 정신적인 작용에는 관련되는 것으로 생각된다. 이상의 내용에서 족삼리 침 자극이 신문이나 태연보다 니코틴으로 유도된 행동적 민감화 현상을 억제하는데 유의한 결과 를 보여주어, 니코틴 약물중독에 대한 침 치료 요법의 응용에 있어서 실험적 근거를 제시하 며, 신경학적 기전을 이해하는데 도움이 될 것 이다.

본 실험에 침 자극이 어떤 기전에 의해서 도 파민성 신경세포의 활성을 감소시키는 지에 대 해서는 알 수 없지만, 여러 실험적 보고를 종합 해보면 다음과 같이 추론된다. 다이놀핀(Dyn- orphin)은 중추신경계에서 억제적인 역할을 하 는 kappa opioid receptor의 내인성 ligand로 알려져 있으며, 다이놀핀은 도파민과 다른 신 경전달물질에 의한 선조체에서의 신경세포의 과도한 활성화를 약화시키는 작용을 한다.

중뇌변연도파민계의 과도한 활성화에 의한 opioid계의 활성화는 적응기전 혹은 보상적인 기전으로 해석되고 있다. kappa- receptor 효 능제인 spiradoline (U-62066)의 복강 투여 혹 은 선조체내 국소 투여로 급성 코카인에 의해 행동적 활성화와 선조체 내에서 c-fos와 zif 268 등의 IEG(immediate early gene)의 유도 가 감소됨을 보여주었다.

이러한 결과는 다 이놀핀이 strianigral 신경세포의 기능을 nega- tive feedback으로 조절하는 작용을 함을 나타 낸다.

또한, 행동학적 연구에서 다이놀핀의 증가가 중독성 약물인 코카인의 반복적인 처치로 유도 된 행동적 민감화 현상의 발현을 억제시키며,

코카인 자가투여 및 약물 탐색 행동 등을 감소 시킨다는 보고들이 많다. kappa agonist, U- 69593의 측핵 내에 주입은 행동적 민감화 현상 을 억제하였고, 이는 도파민 방출의 억제를 통 해서 나타났다.

또한, 최근 니코틴중독 모 델에서도 U50,488, U69,593 등의 kappa agonist 전 처치로 니코틴의 행동적 민감화 현 상을 억제시킨다는 사실로 kappa-opioid sys- tem이 행동학적으로 신경화학적으로 니코틴 약물중독과 관련된 효과를 보여주고 있다.

100Hz의 고빈도 전침 자극 혹은 경피신경 자극으로 유도된 진통효과는 실험동물 혹은 인 간에게서 모두 척수에서 다이놀핀 방출의 증가 를 통해서 이루어진다.

이러한 침 자극이 다 이놀핀 방출을 증가시키는 작용을 이용하여 100Hz 전침 자극이 몰핀의 금단 증상을 감소 시켰으며, 100Hz 경피신경 자극이 헤로인 중 독자들의 금단증상을 감소시키는데 효과적으 로 사용되었다.

이렇게 침 자극이 중추신경계 내에서 다이놀 핀의 방출 증가를 촉진시키는 작용에 대한 보 고들이 많이 있으며, 이러한 침 자극은 kappa -opioid system의 활성화를 통해서 과도한 도 파민 방출을 negative feedback으로 조절하는 작용을 하여 면역조직화학적으로 측핵으로 도 파민 방출 증가로 나타나는 c-Fos 발현을 감소 시키고, 행동학적으로 행동적 민감화 현상의 발현을 억제하였을 것으로 생각된다. 하지만, 이에 대한 실험적 검증이 더 필요하다.

Ⅴ. 결 론

니코틴 약물중독 동물모델인 니코틴 반복 처 치에 의한 행동적 민감화 현상의 발현에 침 자 극의 효과를 알아보기 위하여 행동학적으로 보 행성 활동량을 측정하고, 면역조직화학분석법 으로 측핵에서 신경세포의 활성을 살펴본 실험 의 결과는 다음과 같다.

(1) 소량의 니코틴 (0.4mg/kg s.c.)을 7일 동안

반복적으로 처치함으로써, 니코틴에 의한

행동적 민감화를 성공적으로 유도(발달)하

- 13 - 였으며 일단 유도된 행동적 민감화 현상은 니코틴 처치를 철회한 3일 후에 다시 한번 니코틴에 노출되었을 때, 행동적 민감화 현 상이 유지(발현)됨이 관찰되었다.

(2) 행동학적 검사에서 족삼리(ST36) 침 자극 은 니코틴에 의한 행동적 민감화 현상의 발 현을 유의하게 억제하였다.

(3) 행동학적 검사에서 신문(HT7), 태연(L3) 침 자극은 니코틴에 의한 행동적 민감화 현 상의 발현을 약간 감소시키나, 통계적으로 유의하지 않았다.

(4) 면역조직화학분석에서 니코틴 반복 처치군 이 측핵 core와 shell부위에서 c-Fos 발현 (Fos like immunoreactivity: FLI)이 생리 식염수 처치군과 니코틴 급성 처치군에 비 해 유의하게 증가하였다.

(5) 면역조직화학분석에서 족삼리자침군(ST36) 은 대조군에 비하여 니코틴의 반복적인 처 치에 의한 측핵 core부위와 shell부위에서 c-Fos 발현을 유의하게 감소시켰다.

(6) 면역조직화학분석에서 신문자치군(HT7) 은 대조군에 비하여 니코틴의 반복적인 처치에 의한 측핵 shell부위에서 c-Fos 발현을 유 의하게 감소시켰다.

이상의 결과에서, 족삼리(ST36) 자침은 니코 틴 반복처치로 유도된 행동적 민감화 현상으로 설정된 니코틴 약물중독 모델에서 행동학적으 로 보행성 활동량을 감소시키고, 면역조직화학 적으로 측핵에서 신경활성을 감소시킴을 보여 주어, 침 자극이 니코틴 약물 중독의 치료에 유 의한 작용이 있음을 나타낸다.

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