242 서 론
최근 인구구조가 고령화되면서 노년층에서 가장 흔히 관찰되는 퇴행성 신경질환인 노인성 치매(Alzheimer’s Dis-
ease (AD))의 발생이 급증하고 있다. 통계적으로 보면 65 세 이상의 노인 중 7∼10%가, 그리고 80세 이상의 노인 들은 40∼50% 정도가 알츠하이머병 증상을 갖게 된다.1) 알츠하이머병은 발병 원인에 따라 유전성과 산발성으로
아밀로이드 베타 단백질에 의해 유도된 신경세포 독성에 대한 백합과 숙근류의 억제 효과 탐색
1창원대학교대학원 생명공학 협동과정, 2창원대학교 유전공학연구소,
3창원대학교 자연과학대학 보건․생화학과, 4박기태 한의원
김은숙1․최수진1․이철원2․박기태4․문자영1,2,3
Protective Effects of Liliaceae Root Extracts on Amyloid β-protein-induced Death in Neuronal Cells
Eun-Sook Kim1, Soo-Jin Choi1, Chul-Won Lee2, Ki-Tae Park4 and Ja-Young Moon1,2,3
1Graduate School of Changwon National University, 2Institute of Genetic Engineering, Changwon National University, and
3Department of Biochemistry and Health Sciences, Changwon National University, Changwon 641-773,
4Dr. Park's Korean Medicine Clinic, Changwon 641-010, Korea
The amyloid β-protein (Aβ) is the principal component of the senile plaques characteristic of Alzheimer's disease (AD) and elicits a toxic effect on neurons in vitro and in vivo. Many environmental factors including antioxidants and proteoglycans modify Aβ toxicity. In this study, we have investigated the effects of methanol-extracts of Liliaceae root on Aβ-induced oxidative cell death in cultured rat pheochromocytoma (PC12) cells. For this study, we used three different Aβ fragments (Aβ25-35, Aβ1-42
Aβ1-43) for the induction of cytotoxicities to PC12 cells. We previously measured cytotoxicities of the extracts of Liliaceae to both human neuronal SK-N-MC and PC12 cells. Fifteen out of the 19 Liliaceae extracts at 100μg/ml showed no cytotoxic effects to both SK-N-MC and PC12 cells. Three different Aβ fragments (Aβ25-35, Aβ1-42 Aβ1-43) exhibited cytotoxicities to both SK-N-MC and PC12 cells, each possessing 1, 5, and 5μg/ml IC50 values, respectively. Among the Liliaceae roots, methanol-extracts of Polygonatum falcatum, Ophiopogon japonicus, Liriope platyphylla, and Hemerocallis fulva strongly attenuated cytotoxicities induced by the three Aβfragments. Especially methanol-extracts of Ophiopogon japonicus was the most effective in protecting PC12 cells from the Aβ25-35-induced oxidative cell death.
These results suggest that extracts of Liliaceae root may contain the protective component (s) against Aβ-induced cell death in PC12 cells. (Cancer Prev Res 10, 242-250, 2005)
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Correspondence to：Ja-Young Moon
Department of Biochemistry and Health Sciences, College of Natural Sciences, Changwon National University, 65 Sonamu-5 gil, Changwon, Gyeongnam 641-773, Korea
Tel: +82-55-279-7662, Fax: +82-55-279-7169 E-mail: jymoon@sarim.changwon.ac.kr 책임저자：문자영, ꂕ 641-773, 경남 창원시 소나무 5길 65
창원대학교 자연과학대학 보건․생화학과 Tel: 055-279-7662, Fax: 055-279-7169 E-mail: jymoon@sarim.changwon.ac.kr
접수일：2005년 11월 29일, 게재승인일：2005년 12월 15일
나눌 수 있으며, 아밀로이드 전구단백질이나 presenilin과 같은 특정한 유전자에 돌연변이가 생기면 100% 알츠하 이머병으로 발전하는데, 이 경우가 전체 5% 내외를 차 지하는 유전성 알츠하이머병이다. 전체 알츠하이머병의 90% 이상은 65세 이상의 노인에게 주로 나타나는 산발 성 알츠하이머병이다. 산발성 알츠하이머병은 아직까 지 정확한 원인이 밝혀지지 않아 예방과 치료가 어려운 실정이었으나 최근에 발병 원인이 하나씩 밝혀지고 있 다.
유전성과 산발성 알츠하이머병의 공통된 원인으로 알 려져 있는 아밀로이드 베타단백질(Aβ)에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. Aβ는 정상인의 경우에도 인체 곳곳에서 소량 만들어진다. 정상인의 경우 Aβ는 만들어 진 후 빠르게 분해돼 인체 내에 쌓이지 않지만 알츠하이 머병 환자의 경우에는 Aβ가 비정상적으로 많이 생성되 어 분해되지 않고 조직에 축적됨으로써 노인반이 생성 되거나 기억과 학습에 중요한 역할을 하는 해마나 대뇌 피질 같은 곳에 과다하게 쌓이게 된다. 축적된 Aβ는 주 변의 세포들에 염증반응을 일으킨다. 따라서 신경세포 가 손상되고 점점 뇌의 정상적인 기능을 유지하는 신경 회로망마저 훼손되기에 이른다. 게다가 축적된 Aβ는 신 경세포를 죽이는 신호 체계를 가동시키는 활성산소를 많이 만들어낸다.
Aβ는 β-secretase에 의해 절단된 아밀로이드 전구단백 질(amyloid precursor protein)의 일부분이다. Aβ는 그것을 구성하고 있는 아미노산의 수에 따라 여러 가지 형태가 있다. 알츠하이머병 환자의 경우 40개 또는 42개의 아미 노산으로 이뤄진 Aβ의 비율이 급격히 많아진다. Aβ를 in vitro에서 배양하는 신경세포에 처리하였을 때 신경세 포사를 유도하며 그 세포사의 기전이 알츠하이머병 환 자에서 나타나는 apoptosis의 유형과 유사하다는 많은 보 고들이 있다. Aβ1-42 또는 Aβ1-43 단백질에 의한 신경세 포의 손상이 Alzheimer형 질환 유발의 중요한 원인중의 하나로 확인되고 있으며,2∼4) Aβ25-35는 신경세포의 손상 을 유발하는 Aβ1-42 or 43의 중요한 toxic fragment로서 알려 지고 있다.4,5)
치매와 관련하여 현재 약리학적 접근법으로는 acetyl- cholinesterase inhibitors,6,7) nicotinic and muscarinic agonists,8,9) estrogen, nerve growth factor,10) neurotrophic factor11,12)를 활 성화시키는 저분자 lipophilic 물질들, ibuprofen과 COX-2 inhibitors와 같은 비스테로이드성 항염증 치료제14) 등이 포함되어 있다. 현재 세계적인 제약회사들이 나서서 β- secretase의 작용을 억제하는 약물을 개발해 Aβ가 생성되 는 것을 원천적으로 차단하고자 노력을 기울이고 있다.
최근에는 미국의 제약회사와 대학 및 연구소에서는 치 매 치료제의 개발을 위해 약용식물로부터 항산화 효과 를 나타내는 성분을 분리하는 연구가 많이 진행되고 있 으며 이들 중에서 치매의 치료제로서 사용되기 시작한 성분들로는 Ginkgo biloba L (은행나무)15,16)과 Huperzia serrata Travis (중국산이끼)17,18)들이 대표적인 경우이다. 이외에 Curcuma longa L. (강황)로부터 분리한 curcuminoids 성분 또 한 치매의 치료효능이 보고되고 있으며,19∼21) 아밀로이 드 대사물의 독성을 억제하는 것으로 알려진 인삼, tetran- drine, 은행잎 추출물(Egb761) 등은 신경세포 생존을 증가 시키거나 알츠하이머환자의 치매증상의 악화속도를 늦 출 수 있다고 보고된 바 있다.19)
본 연구에서는 국내에 자생하는 백합과 숙근류로부터 치매의 치료제로서 가능성이 있으며 부작용이 없는 성 분을 탐색하고자 Aβ25-35, Aβ1-42 및 Aβ1-43를 사용하여 유발되는 신경세포의 손상을 억제하는 백합과 숙근류의 메탄올 추출물들의 효능을 평가하였다. Aβ의 toxicity를 in vitro로 연구하는데 있어서 가장 일반적으로 많이 사용 되고 있는 PC12 (pheochromocytoma) cell line을 이용하여 Aβ의 toxicity를 실험하였으며 신경세포(SK-N-MC cell)에 도 적용하여 백합과 숙근류의 신경세포 손상억제효능을 탐색하였다.
재료 및 방법
1. 실험 재료
1) 실험 시료: 백합과 숙근류: 본 연구에 사용된 백합과
숙근류의 기초 자료는 대한식물도감(이창복 저, 향문사) 으로부터 확보하였으며, 수록되어 있는 백합과 식물 중 에서 약리 작용이 있는 19종을 우선적으로 선정하여 본 실험에 적용하였다. 19종의 백합과 숙근류의 MeOH 추 출물은 자생식물이용기술사업단(단장: 정 혁 박사)으로 부터 구입하였으며, 이 19종의 백합과 숙근류에 관한 약 리 및 독성에 대해 조사한 내용은 Table 1에 정리하였다.
이들 백합과 숙근류의 MeOH 추출물을 DMSO에 녹여서 stock solution으로 보관하였고 본 실험을 수행할 때에도 DMSO를 이용하여 원하는 농도로 희석하여 사용하였다.
2) 시약 및 기기: 본 실험에 이용한 3-(4,5-dimethyl- thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT), dime- thyl sulfoxide (DMSO), 2’,7’-dichlorofluorescin-diacetate은 Sigma Chemical 사(USA)로부터 구입하였다. 세포배양에 필요한 fetal bovine serum (FBS), horse serum, L-glutamine, non-essen- tial amino acid, penicillin & streptomycin, Minimal essential medium (MEM), 96 well plate, collagen, Phosphate Buffered
Saline (PBS), trypsin, Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)은 Gibco BRL사(Gland Island, NY, USA)로부터 구 입하였다. Amyloid fragment들인 Aβ25-35, Aβ1-42, Aβ1-43 등 은 Sigma사로부터 구입하였다. Tris-potassium chlroride buffer, 1.2% Thiobarbituric acid solution, 20% Acetic acid solution, 8.1% Sodium dodecyl sulfate (SDS) solution, malo- naldehyde standard solution 등은 MDA 측정실험에 사용하 였다. TE buffer, lysis buffer, proteinase K, 3 M sodium ace-
tate, ethanol, RNase A type 1, RNase A type 1, agarose 등은 DNA fragmentation assay 실험에 사용하였다. 본 실험에 이용한 기기로는 CO2배양기, clean bench, 항온수조, 미 량원심분리기, UV spectrophotometer, ELISA reader 및 그 밖의 여러 실험기자재 등을 사용하였다.
Table 1. 우리나라 자생식물 중 민간 및 한방요법에 사용되는 백합목 백합과 숙근류
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국명 학명 효능
ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ
1. 산달래 Allium grayi 연한 전초는 식용. 비늘줄기는 건위․정장 및 화상치료에 사용. 식용,
약용. 한방과 민간에서 전초 및 인경을 진통, 해독, 구충, 이뇨, 강장, 하리, 후종, 몽정, 심장염, 건위, 정장, 화상 등에 약재로 씀.
2. 산마늘 Allium victorialis var. platyphyllum 인경과 더불어 연한 부분을 식용으로 사용함.
3. 삿갓나물 Paris verticillata 어린 순은 나물로 함. 독성이 있는데 뿌리에 특히 많다. 항암작용, 뇌
종양, 비인암, 식도암, 피부 지방종양, 위장병, 속쓰림, 신경쇠약, 불면증, 어지럼증, 소화불량증 치료에 사용. 뿌리는 염증을 삭이고 갖가지 독을 풀며 통증을 가라앉히고 부은 것을 내림.
4. 연령초 Trillium kamtschaticum 혈압으로 인한 두통과 어지러움, 신경성 두통을 제거하는 효능. 요통,
하지신경통, 타박상, 골절상 및 외상출혈 치료에 유효.
5. 소엽맥문동 Ophiopogon japonicus 근경은 양음윤폐(養陰潤肺), 청심제번(淸心除煩), 양위생진(養胃生津) 의 효능이 있음.
6. 애기원추리 Hemerocallis minor 어린 잎과 꽃을 식용으로, 뿌리는 이뇨 작용, 유방염, 유즙분비 부족에 유효.
7. 죽대 polygonatum lasianthum var. coreanum 자양강장제, 항암제, 신체허약, 근골연약, 보신, 보정기, 보심폐, 허손 한 열, 오로칠상, 통풍, 당뇨병, 구갈에 사용.
8. 큰원추리 Hemerocallis middendorfi 어린 순을 식용 및 약용으로 함.
9. 각시원추리 Hemerocallis dumortieri 뿌리를 식용, 관상용, 밀원용, 약용으로 씀. 한방에서 이뇨, 지혈, 소염, 황달, 강장 등의 약재로 쓰임
입안이 마르고 갈증, 각혈, 폐기능이 약화, 변비 등에 효능. 괴근을 10. 맥문동(전초) Liriope platyphylla 이뇨, 심장염, 해열, 감기, 진정, 강장, 소염, 거담, 강심, 진해 등에
11. 맥문동(열매) 약재로 사용.
12. 왕원추리 Hemerocallis fulva var. kwanso 어린순은 나물로 하고 꽃도 말려서 먹는데 뿌리는 이뇨, 지혈, 소
염제로 사용.
13. 얼레지 Erythronium japonicum 식용, 관상용. 공업용, 약용(괴경), 민간에서 강장. 창종, 건뇌, 건위
등에 약으로 쓰임.
14. 중국패모 Fritillaria verticillata var. thunbergii 진해제 및 거담제로 사용.
15. 천문동 Asparagus cochinchinensis 연한 줄기는 식용. 뿌리는 진해, 이뇨, 강장제로 사용.
16. 큰연령초 Trillium tschonoskii 연령초와 더불어 약용.
17. 원추리 Hemerocallis fulva 이뇨, 해열, 진해, 진통 등의 효과, 빈혈이나 종기의 치료에도 쓰임.
자양강장, 피로회복, 주독을 푸는 데 쓰임.
18. 하늘말나리 Lilium tsingtauense 식용. 약용(인경). 한방과 민간에서 종기, 동통, 토형, 유방염, 강심, 백일해, 강장, 진정, 익지, 해소, 기관지염, 후두염, 신경쇠약, 폐렴, 익기, 해독, 각혈, 안오장, 보폐 등에 약재로 사용.
19. 진황정 Polygonatum falcatum 연한 순은 나물로 먹고 뿌리줄기는 자양강장제로 사용. 뿌리 및 줄
기를 풍습, 폐염, 나창, 강심, 명안, 안오장 등의 약으로 씀. 항균.
자양강장, 죽상동맥경화방지, 항결핵작용.
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2. 실험방법
1) Cell culture: 본 연구에서는 SK-N-MC cell과 PC12 cell을 배양하여 사용하였다. SK-N-MC cell은 10% fetal bovine serum (FBS), L-glutamine, non-essential amino acid, penicillin 및 streptomycin을 함유한 Minimum essential medium (MEM)에 37oC, 5% CO2 조건의 incubator에서 배양하였다.
PC12 cell은 collagen을 코팅한 dish 또는 96 well plate에서 5% fetal bovine serum, 10% horse serum, penicillin 및 strep- tomycin을 함유한 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)에 37oC, 5% CO2 조건의 incubator에서 배양하였 다. 배지는 2일에 1번 교체했으며, 세포가 배지 내에 80~90% 정도 성장하면 계대시켰다.
2) 백합과 숙근류가 세포의 생존에 미치는 영향 측정 (1) SK-N-MC cell; 백합과 숙근류가 신경세포(SK-N- MC)에 독성을 나타내는지를 확인하기 위해 MTT assay를 이용하여 cell viability를 측정하였다. 즉, SK-N-MC cell을 96 well plate에 well당 20,000개의 cell이 들어가도록 분주 하였다. 37oC, 5% CO2 조건의 incubator에서 24시간 배양 한 후에 백합과 숙근류 용매 추출물을 DMSO에 녹여 농 도별(25, 50, 100, 200, 300μg/ml)로 처리하고 37oC, 5%
CO2 조건의 incubator에서 24시간 동안 더 배양하였다. 그 후에 MTT 액(5 mg/ml in PBS, pH 7.5)을 20μl씩 넣고 3시 간 동안 더 배양시킨 다음에 상층액을 모두 제거하고 DMSO와 EtOH을 1：1로 섞은 용액을 100μl씩 넣어서 formazan 침전물을 녹인 다음 10분 정도 후에 ELISA rea- der를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. Cell viability는 대조군의 생존율을 100%로 하여 계산하였다.
세포 생존율은 대조군의 흡광도와 비교하여 상대적인 값으로 평가하였다.
(2) PC12 cell; PC12 cell을 collagen이 코팅되어 있는 96 well plate에 well당 20,000개의 cell이 들어가도록 분주하 였다. Overnight Culture시킨 후에 백합과 숙근류 용매 추 출물을 DMSO에 녹여 농도별(25, 50, 100, 200μg/ml)로 처리하고 37oC, 5% CO2 조건의 incubator에서 24시간 동 안 배양하였다. 그 후에 MTT 액(5 mg/ml in PBS, pH 7.5) 을 20μl씩 넣고 3시간 동안 배양시키고, 그 다음에 상층 액을 모두 제거하고 DMSO와 EtOH을 1：1로 섞은 용액 을 100μl씩 넣고 10분 정도 후에 ELISA reader로 540 nm 에서 흡광도를 측정하였다. Cell viability는 대조군의 생존 율을 100%로 하여 계산하였다.
3) 백합과 숙근류의 아밀로이드베타(Aβ)의 세포독성 억
제효과 측정: 백합과 숙근류가 아밀로이드베타(Aβ)에 의
해 유도되는 세포독성을 억제하는 효과를 조사하기 위
하여 MTT assay를 이용하여 cell viability를 확인하였다.
(1) SK-N-MC cell; SK-N-MC cell을 96 well plate에 well당 20,000개의 cell이 들어가도록 count하여 분주하고 37oC, 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 그 다 음, 1μg/ml의 아밀로이드베타(Aβ)와 백합과 숙근류 분 획을 농도 별(25, 50, 100, 200, 300μg/ml)로 함께 처리하 여 24시간 동안 37oC, 5% CO2 조건에서 더 배양하였다.
그 후에 MTT 용액(5 mg/ml in PBS, pH 7.5)을 20μl씩 넣 고 3시간 동안 배양시킨 후에 상층 액을 모두 제거하고 DMSO와 EtOH을 1：1로 섞은 용액을 100μl씩 넣고 잘 흔들어 주었다. 10분 정도 후에 ELISA reader로 540 nm에 서 흡광도를 측정하였다. Cell viability는 대조군의 생존율 을 100%로 하여 계산하였다.
(2) PC12 cell; PC12 cell을 collagen이 코팅된 96 well plate에 well당 20,000개의 cell이 들어가도록 count하여 분 주하고 37oC, 5% CO2 조건에서 overnight시킨 다음, 1μg/
ml의 Aβ와 백합과 숙근류 분획을 농도 별(25, 50, 100, 200μg/ml)로 함께 처리하여 24시간 동안 37oC, 5% CO2
조건에서 더 배양하였다. 그 후에 MTT 용액(5 mg/ml in PBS, pH 7.5)을 20μl씩 넣고 3시간 동안 배양시킨 후에 상층 액을 모두 제거하고 DMSO와 EtOH을 1：1로 섞은 용액을 100μl씩 넣고 잘 흔들어 주었다. 10분 정도 후에 ELISA reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였 다. Cell viability는 대조군의 생존율을 100%로 하여 계산 하였다.
결 과
백합과 숙근류의 MeOH 추출물로부터 치매 예방 및 치료 효능이 있는지를 탐색하기 위하여 MTT assay 방법 을 이용하였다. 우선, 백합과 숙근류의 용매 추출물 그 자체에 독성이 있는지를 확인하였다. 그리고 아밀로이 드베타(Aβ)에 의한 세포 손상을 많이 회복시켜주는 백 합과 숙근류를 탐색했고, 그 중에서 많은 효과가 나타나 는 추출물을 선별하여 더 구체적으로 치매 예방 및 치료 효능이 있는지를 한번 더 탐색하였다.
1. 백합과 숙근류가 세포 생존에 미치는 영향
백합과 숙근류가 세포 생존에 어떤 영향을 주는지 MTT assay 방법을 이용하여 흡광도를 540 nm에서 측정 하여 대조군의 흡광도 값을 100%로 하여 상대적인 값으 로 평가하였다.
1) SK-N-MC cell 생존에 미치는 영향 확인: Fig. 1은 본 실험을 위해 선정된 19종의 백합과 숙근류(Table 1)의
MeOH 추출물들을 100μg/ml 농도로 인체 신경아세포종 세포주인 SK-N-MC 세포에 적용하여 MTT assay로 세포 독성을 측정한 실험 결과이다. 선정된 19종의 백합과 숙 근류 중에서 네 종류(No. 2. 산나물, No. 3. 삿갓나물, No.
4. 연령초, No. 16. 큰연령초)를 제외한 15종의 추출물들 이 적용 농도에서 신경세포에 대하여 독성이 나타나지 않았다. 오히려 No. 6. 애기원추리, No. 8. 큰원추리 및
No. 18. 하늘말나리의 경우는 적용농도(100μg/ml)에서 세포의 분열 또는 성장을 촉진하는 효과를 나타내었다.
선정된 19종의 백합과 숙근류(Table 1)의 MeOH 추출 물들을 최고농도인 300μg/ml까지 농도를 증가하면서 SK-N-MC 세포에 적용한 다음 MTT assay로 세포독성을 측정하였다(Fig. 2). 이들 추출물 중에서 No. 6. 애기원추 리, No. 7. 죽대, No. 9. 각시원추리, No. 14. 중국패모, No.
Fig. 1. Effects of methanol extracts (100μg/ml) of Liliaceae plants on the viability of SK-N-MC cell. Refer to Table 1 for the name of Liliaceae plant corresponding to the sample number.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
MTT assay (% of control)
Sample umbern 0
20 40 60 80 100 120 140
Fig. 2. Effects of MeOH extracts of Liliaceae plants on SK-N-MC cell viability at their various concentrations.
#1 #2 #5 #6 #7 #8 #9 #10 #11 #12 #13 #14 #15 #17 #18 #19
MTT assay (% of control)
Sample umbern 0
20 40 60 80 100 120 140
Control 30 ug/ml 50 ug/ml 100 ug/ml 150 ug/ml 200 ug/ml 300 ug/ml
Table 2. Cytotoxic activities (IC50) of methanol-extracts of Liliaceae to SK-N-MC cells
ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ
Sample No1) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 9
ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ IC50 (μg/ml) 125 45 - - 130 ＞300 ＞300 250 ＞300 200 130 175 74 ＞300 46 - 130 ＞300 ＞300 ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ
1)Refer to Table 1 for detailed plant name corresponding to the sample No.
-: Not tested due to their strong cytotoxicities.
18. 하늘말나리 및 No. 19. 진황정은 최고농도인 300μg/
ml로 신경세포에 적용하여도 세포의 생존에 거의 영향 을 주지 않았다.
Table 2에서는 선정된 19종의 백합과 숙근류(Table 1)의 MeOH 추출물들을 최고농도 300μg/ml까지 농도별로 SK-N-MC 세포에 적용한 다음 MTT assay로 세포독성을 측정하여 IC50값을 계산하였다. 여기에서 IC50값은 세포 의 생존율을 50%에 도달하게 하는 추출물들의 농도로 정의하였다. 이들 중에서 네 종류(No.2. 산나물, No.3. 삿 갓나물, No.4. 연령초, No.16. 큰연령초)는 100μg/ml의 농 도에서 강한 세포독성을 나타내었기 때문에 IC50값의 측 정은 하지 않았다. No. 6. 애기원추리, No. 7. 죽대, No.
9. 각시원추리, No. 18. 하늘말나리 및 No. 19. 진황정은 300μg/ml의 매우 높은 농도로 투여하여도 세포독성이 거의 나타나지 않았다(IC50＞300μg/ml). 원추리과(Hemero- callis)의 신경세포에 대한 세포독성이 가장 낮은 것이 특 이적인 현상으로 나타났다.
2. 백합과 숙근류 분획이 아밀로이드 베타 단백질의 세포독성 억제효과 측정
Alzheimer형 질환 유발의 중요한 원인중의 하나인 Aβ25-35
또는 Aβ1-43를 사용하여 유발되는 신경세포의 손상을 억 제하는 효과를 백합과 숙근류의 MeOH 분획들을 대상으 로 탐색하였다.
Fig. 3은 1μg/ml의 Aβ25-35에 의하여 유발되는 PC12 세 포에서의 세포독성을 백합과 숙근류의 메탄올추출물을 처리하였을 때 억제하는 효능을 비교 평가한 결과들이 다. MTT assay에 의하여 측정된 바와 같이, No. 5. 소엽맥
문동, No. 6. 애기원추리, No. 10. 맥문동(전초), No. 13.
얼레지, No. 15. 천문동, No. 17. 원추리, No. 18. 하늘말나 리 및 No. 19. 진황정의 백합과 숙근류가 Aβ25-35에 의하 여 유발된 PC12 세포에서의 세포독성을 상당한 수준으 로 억제하는 효과를 보였다. 이러한 결과는 Fig. 1에서의 실험결과와 일치하였으며, 신경세포의 생존율을 증가시 키는 백합과 숙근류들이 Aβ25-35에 의해 유도된 세포독 성을 억제하는 효능을 가지고 있음이 확인되었다. 특히, No. 13. 얼레지, No. 15. 천문동, No. 17. 원추리, No. 18.
하늘말나리 및 No. 19. 진황정의 백합과 숙근류는 1μg/
ml의 Aβ25-35에 의하여 유발된 PC12 세포의 50%의 세포 생존율을 80% 수준으로 강하게 회복하는 효과를 보였 다. 맥문동은 한약재로서 사용되는 백합과로서 알려져 있는데 본 실험에서는 맥문동의 전초(No. 10) 부위 추출 물과 맥문동의 열매 추출물(No. 11)을 확보하여 Aβ25-35
단백질에 의한 신경세포 독성억제효과를 비교하였다.
그 결과 전초 추출물에서 Aβ25-35 단백질에 의한 신경세 포 독성억제효과를 나타낸 반면, 열매 추출물은 독성억 제효과를 보여주지 않았다. 신경세포에 대하여 독성이 강했던 추출물(No. 3. 삿갓나물, No. 4. 연령초, No. 16.
큰연령초)들은 1μg/ml의 Aβ25-35 단백질에 의한 신경세 포 독성억제효과도 보여주지 못했다.
다음은 연구결과에 대한 신뢰도를 높이고자 아밀로이 드 단백질 Aβ1-43에 의해 유도된 세포독성에 대한 백합 과 숙근류들의 억제효과도 확인하였다. Fig. 4는 5μg/ml 의 Aβ1-43에 의하여 유발되는 PC12 세포에서의 세포독성 을 100μg/ml 농도의 백합과 숙근류의 메탄올 추출물을 처리하였을 때 억제되는 효과를 평가한 결과이다. 적용 Fig. 3. Protective effects of methanol-extracts of Liliaceae plants on Aβ25-35-induced toxicity in PC12 cells. Refer to Table 1 for the name of Liliaceae plants corresponding to the sample number.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
Cell viability (% of control)
Liliaceae extracts (100 ug/ml) 0
20 40 60 80 100 120 140
Control 1 M µ A 25-35β 1 M µ A 25-35+100 m/ml β µ sample 100 g/ml µ sample
실험한 백합과 숙근류 추출물들 중에서 No. 5. 소엽맥문 동이 5μg/ml의 Aβ1-43에 의하여 유발되는 PC12 세포에 서의 세포독성을 가장 강하게 억제하는 효과를 나타내 었다. No. 18. 하늘말나리와 No. 19. 진황정 역시 주목할 만큼 세포독성 억제효과를 나타내었다.
본 연구에서는 이미 두 가지 종류의 아밀로이드 단백
질(Aβ25-35 또는 Aβ1-43)에 의해 각각 유도된 세포독성을
억제하는 효능이 확인된 백합과 숙근류의 MeOH 추출물 에 대하여 Aβ1-42를 처리하여 독성을 유발시킨 PC12 세 포에 다시 적용함으로써 Aβ1-42에 의하여 유발된 독성
억제효능을 재확인하고자 본 실험을 수행하였다(Fig. 5).
Fig. 5에서처럼 PC12 세포에 5μg/ml의 Aβ1-42를 처리하 였을 때 세포의 생존율이 45%로 낮아졌는데 5μg/ml의A β1-42와 선정된 숙근류 MeOH 추출물들을 각각 100μg/ml 의 농도로 병행 처리하였을 때, 세포의 생존율이 최소 50% 이상으로 회복되었다. No. 5. 소엽맥문동의 경우에 는 세포의 생존율을 무려 20% 이상 회복시키는 효과가 있었으며, 그 외 No. 13. 얼레지와 No. 17. 원추리 및 No.
19. 진황정의 MeOH 추출물의 경우에도 Aβ1-42에 의해 감소된 세포의 생존율을 상당히 회복시키는 효과가 있 음이 확인되었다.
결론 및 고찰
최근에 발표된 연구결과에 의하면 신경세포에 Aβ에 의해 유도된 산화적 스트레스가 치매발생의 중요한 원 인 중의 하나로 밝혀졌다. 그래서 Aβ의 공격을 차단하 는 것이 치매의 증상을 조절하고 치료하는 중요한 접근 법으로 생각하고 있다. 최근에는 제약회사와 대학 및 연 구소에서 치매 치료제의 개발을 위해 약용식물로부터 항산화 효과를 나타내는 성분을 분리하는 연구가 많이 진행되고 있다. 이들 중에서 치매의 치료제로서 사용되 기 시작한 성분들로는 Ginkgo biloba L15,16)과 Huperzia serrata Travis들17,18)이 대표적인 경우이다. 이외에 Curcuma longa L 로부터 분리한 curcuminoids 성분21) 또한 치매의 치료효 능이 있음이 보고되고 있다.
백합과 식물들 중에는 식용은 물론이며 민간 및 한방 요법에 사용되고 있는 많은 식물들이 존재한다. 본 연구 Fig. 4. Protective effects of methanol-extracts of Liliaceae plants on Aβ1-43-induced toxicity in PC12 cells. Refer to Table 1 for the name of Liliaceae plant corresponding to the sample number.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
Cell viability (% of control)
Liliaceae plants 0
20 40 60 80 100 120 140
Control 5 M/ml µ A 1-43β 5 g/ml µ A 1-43+100 m/ml β µ sample 100 g/ml µ sample
Fig. 5. Protective effects of MeOH-extracts of Liliaceae plants on Aβ1-42-induced toxicity in PC12 cells. The name of Liliaceae corresponding to the sample number is as follow: No. 5, Ophiopogon japonicus; No. 13, Erythronium japonicum; No. 14, Fritillara verticillata var. thunbergii; No. 17, Hemerocallis fulva; No.
18, Lilium tsingtauense; No. 19, Polygonatum odoratum.
Without A beta With A
beta 5 13 14 17 18 19
MTT reduction assay (% control)
Liliaceae extracts (100 ug/ml) 0
20 40 60 80 100
에서도 이와 같은 연구추세를 반영하여 이미 여러 가지 효능이 알려져 있는 국내에 자생하는 백합과 숙근류로 부터, 치매의 치료제로서 가능성이 있으며 부작용이 없 는 성분을 탐색하였다. 본 실험에서는 이들 식물들을 대 상으로 치매 예방 또는 치료효능물질을 탐색하기 위하 여 Aβ 단백질에 의하여 유발된 PC12 cell에서의 독성을 억제하는 효능을 우선적으로 비교 검토하였다. 백합과 추출물이 신경세포에 독성을 나타내는지를 MTT assay로 확인한 실험에서는 애기원추리, 죽대 및 각시원추리 추 출물은 200μg/ml까지의 농도에서 SK-N-MC cell의 생존 율이 100∼120%를 유지하였는데, 이러한 결과는 신경세 포의 성장과 분화를 촉진하는 효과가 이들 성분에 존재 하기 때문인 것으로 판단된다. 이 분야에 관하여는 신경 세포의 성장과 분화와 관련있는 호른몬의 분비와 전사 인자 및 수용체들의 발현에 미치는 백합과 추출물들의 효능연구 등 추가적인 연구가 수행되어야 할 것으로 사 료된다.
Aβ peptide에 의해 유도된 신경세포의 손상을 억제하 는 백합과 식물 추출물의 효능을 확인했다. 각시원추리, 애기원추리, 하늘말나리 및 진황정은 적용농도(100∼
300μg/ml)에서 신경세포에 대한 독성이 전혀 없었으며, 저농도(100μg/ml 이하)에서는 오히려 신경세포의 성장 을 촉진하는 효과가 있었다. 소엽맥문동, 애기원추리, 하 늘말나리 및 진황정은 Aβ25-35와 Aβ1-43 peptide의 처리에 의해 유도된 신경세포의 감소된 생존율을 증가시켜 회 복시키는 효과가 있음을 확인하였다. 즉, 백합과 숙근류 중에서 각시원추리, 애기원추리, 하늘말나리, 진황정 추 출물로부터 Aβ peptide에 의해 유도된 독성에 대한 신경 세포 보호효과의 존재 가능성을 확인하였다. 이러한 결 과는 이들 백합과 추출물들에는 산화적 손상을 억제하 는 효과에 의하여 신경세포를 보호할 가능성을 보여주 는 것으로 생각된다. 이를 위하여 이들 추출물들에 의한 지질 과산화 억제, 활성산소종의 제거, DNA 손상회복 및 세포사멸 억제효능 등을 확인함으로써 신경세포를 보호하는 기작이 규명될 수 있으리라 사료된다.
본 연구결과로부터 백합과 숙근류로부터 치매 예방 또는 치료제로서의 개발 가능성이 확인되었다. 이 결과 를 바탕으로 치매 예방 또는 치료제로 사용되기 위해서 는 백합과 숙근류 용매 분획으로부터 유효 단일성분 규 명이 필요하고, 비록 치매 치료 효능이 좋은 식물성분이 라고 할지라도 인체에 유해성을 나타내는지를 규명하기 위한 안전성실험이 반드시 필요하다. 이렇게 더 필요한 연구를 수행하여 알츠하이머병 치료제를 개발할 수 있 다면 급증하고 있는 노인들의 삶이 질적으로 향상될 것
이고 그로 인해 사회적으로 더 나아가 국가적으로 많은 이익을 가져올 것으로 기대한다.
감사의 글
본 연구는 농림기술관리센터 지원 연구비(ARPC203050- 03-I-CG000)로 수행되었으며, 연구비 지원에 감사합니다 [Supported by a grant from ARPC203050-03-I-CG000].
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