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3차원 세포 배양 칩에 쓰이는 생체재료
최 낙 원 한국과학기술연구원(KIST) 뇌과학연구소 바이오마이크로시스템연구단 선임연구원 ㅣ e-mail : [email protected]
이 글에서는 동물 세포의 3차원 배양 칩(생체 조직 칩)과 이에 쓰이는 다양한 생체재료들을 소개하고자 한다.
역사적 배경 및 최근 국내외 기술 동향
1993년 처음 학계에 소개된 의과학/공학이 어우러진 융합기술인 조직공학의 최종 목표는 생체재료로 구성 된 3차원 구조체(scaffold) 안에 심어진 세포들을 생체 외에서 배양함으로써 이식 가능한 조직들로 키우는 것 이다. 이러한 조직공학의 개념을 도입하여 임상적으로 성공한 실질적인 장기는 2006년 Wake Forest 대학 의 대 Atala 교수 연구팀이 실험실에서 배양하고 사람에게 이식된 방광이 처음이었다. 주목할 만한 점은 방광이 얇은 막으로 형성된 주머니 형태의 장기로서 우리 몸 안에 있는 다른 장기, 조직들보다 훨씬 덜 복잡한 구조 를 갖고 있다는 것이다. 조직공학 연구에서 기술적으로 핵심적인 부분은 3차원 생체재료 구조체 안에 심어진 세포들이 체외 환경에서 산소 및 양분의 결핍이 없이 배양되어 조직 세포에 맞는 고유한 발현형을 보여줄 수 있어야 한다는 점이다. 따라서 2000년대 중반부터는 새 로운 조직, 장기를 생체 외 환경에서 만들어 임상적으 로 이식하려는 연구 노력뿐만 아니라 어떻게 우리 몸 안의 다양한 조직 및 장기가 형성이 되고 기능을 하는 지, 생리학/병리학적 모델 구축을 통한 메커니즘 규명, 전임상 단계에서 시간/비용적으로 효율적인 약물 스크 리닝 등 새로운 연구 테마를 중심으로 우리 몸에 보다 가까운 환경에서 수행할 수 있는 세포/조직 배양 칩 등 다양한 플랫폼 기술들이 개발되고 있다. 특히 2011년 9
월 미국국립보건원(NIH: National Institute of Health) 에서 국방첨단연구원(DARPA: Defense Advanced Research Projects Agency), 식품약물관리원(FDA:
Food and Drug Administration)과 공동으로 5년 동안 7,000만 달러 규모의 조직 칩 프로젝트(Tissue Chip Project)를 시작한다고 계획을 밝혔다. 이 프로젝트는 인간 생리학을 모사하는 생물공학적 조직 모델을 포함 하는 3차원 인간 조직 칩 개발을 통해 약물 후보군의 안 전과 효율성의 예측을 극대화하는 것을 목표로 하여 2012년 중반 미국 내 총 19개 대학 및 병원 연구팀들이 선정되어 진행 중이다. 따라서 기존에 개발된 세포/조 직 칩 기술들과 더불어 이 분야의 활성화 및 발전이 더 이루어질 것으로 예상된다.
생체 조직 칩에 사용할 수 있는 생체재료의 일반적인 요건
우리 몸의 여러 가지 장기/조직을 모사하는 생체 조
직 칩 기술이 시도됨에 따라 기존의 전통적인 조직공학
측면에서 사용되고 있는 여러 생체재료들(예를 들어,
생분해성 고분자 구조체) 중에 칩 제작 기술, 미세유체
채널 집적 등에 보다 친화적인 재료들도 활발히 사용되
어 오고 있다. 생체 조직 칩은 크게 두 가지 유형으로
나뉘어 연구가 진행 중인데, 가장 널리 활용되고 있는
것은 하버드대학교 와잇사이즈(Whitesides) 교수 연구
3차원 세포 배양 칩에 쓰이는 생체재료
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실에서 시작된 PDMS 미세유체 칩 기반 세포 배양 칩이 다. 2000년대 초반 이래로 PDMS 미세유체 칩 내에 콜 라젠(collagen)과 같은 하이드로젤을 주입하고 칩 내 미 세유체 채널을 통해 세포 배양액, 성장 인자 등을 전달 하여 세포를 배양하는 방법이다. 국내에서는 서울대학 교 전누리, 고려대학교 정석 교수 연구팀이 가장 대표 적으로 PDMS 미세유체 칩 기반 세포 배양 칩을 활발히 개발 중이다. 또 한 가지 유형은 세포가 심어진 하이드 로젤 구조체 내에 직접 미세유체 채널을 임베드 (embed)하여 시스템-인-생체재료의 형태로 세포 배양 칩을 제작하는 것인데 국내에서는 한국과학기술연구원 (KIST) 최낙원 박사, 홍익대학교 성종환 교수 연구팀이 이 유형을 활용, 개발하고 있다.
이 두 가지 유형의 생체 조직 칩을 제작하는 데 있어 서 사용되는 생체재료는 대부분 천연 고분자 하이드로 젤, 합성 고분자 하이드로젤, 또는 천연-합성 고분자 하 이드로젤이 혼합된 형태인데 생체 조직 칩 제작 공정
및 온-칩 세포 배양의 관점에서 이들 생체재료를 선택 하는 조건은 다음과 같이 요약할 수 있다. 첫째, 칩 외 부에서 미리 젤 형태로 고형화 시키는 것이 아니라 세 포를 미리 심거나 혹은 세포 없이 유체의 형태로 칩 내 미세유체 채널이나 마이크로 패턴이 조립된 몰드 안으 로 주입이 용이하여야 한다. 둘째, 칩 혹은 몰드 내에 주입된 젤을 곧 채널과 몰드 내 패턴 모양대로 그 형태 를 유지할 수 있도록 고형화 과정을 거치게 되는데 이 때 고형화 조건이 세포에 독성을 미치지 않도록 해야 한다. 셋째, 칩 내에서 고형화된 하이드로젤 구조체가 수 일 또는 수 주의 배양 시간이 지남에 따라 뼈대가 되 는 구조는 온전히 남아 있는 것을 선호한다(물론, 새로 운 혈관 형성과 같은 응용 연구 분야에 따라 의도적으 로 칩 내 주입된 하이드로젤 구조체의 부분적 분해를 유도하는 경우도 있다). 넷째, 생체 조직 칩 내 세포 배 양이 진행되면서 세포-세포 외 기질, 세포 대사 활동 등 의 영향으로 세포 독성을 내는 물질을 배출하는 생체재 료의 선택은 피해야 한다.
천연 고분자 하이드로젤
생체 조직 칩을 제작하는 데 사용되고 있는 생체재료 들 중 대표적인 천연 고분자 하이드로젤로는 콜라젠, 알지네이트(alginate), 아가로즈(agarose), 젤라틴 (gelatin), 피브린(fibrin), 매트리젤(matrigel)이 있다.
콜라젠은 우리 몸을 구성하고 있는 세포 외 기질 성 분들 중 가장 많은 부분을 차지하고 있는 물질로서 pH 가 산성이고 온도가 낮은(통상적으로 얼음이 담긴 곳) 환경에서는 콜라젠 섬유가 작은 조각으로 점도가 있는 용액 상태이나, pH를 중성으로 맞추고 온도를 상온 이 상(통상적으로 세포 배양 환경을 감안해 섭씨 37도에서 진행)이 되면 콜라젠 섬유 조각들이 자가 조립으로 실 타래와 같은 섬유 구조체를 형성하게 된다. 최근 들어 국내외 생체 조직 칩 연구자들이 가장 많이 사용하고 있는 생체재료들 중 하나인데 이는 콜라젠이 동물 세포
그림 1 인간의 여러 가지 장기 및 조직을 모사하는 생체 조 직 칩 기술의 개념도
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가 붙어 이동하거나 녹여내는 등 의 세포들만의 리모델링도 용이한 물질이기 때문이다. 생체 조직 칩 내 혈관 형성, 림프 노드 형성, 암 조직 형성, 줄기 세포 배양, 신경 세포 배양 등 활용 분야도 상당히 넓은 편이다. 기계적 물성 차원에 서 실타래와 같은 구조를 갖고 있 으므로 인장 강도는 높은 편이나 위에 언급한 생체재료들 중에서는 상당히 말랑한 편에 속한다.
알지네이트는 해조류에서 추출 한 물질로 식품 가공 재료로도 쓰 이는 생체 적합성 물질이다. 보통 파우더 형태를 원하는 농도로 물에 녹이면 점도가 있는 용액 상태로 존재하게 되고 생체 조직 칩 제작 을 위해 주입을 한 후 원하는 모양 으로 고형화를 시키는 방법으로 칼 슘과 같은 2가 이온을 이용하여 가 교시킬 수 있다. 알지네이트는 콜 라젠에 비해 상대적으로 단단한 편 으로 마이크로 구조체를 형성하기 에는 용이하나 알지네이트 물질 자 체만으로는 생물학적으로 불활성 하므로 동물세포가 붙어 자라나고
이동을 하는 등의 용도로는 쓸 수 없다. 따라서, 하버드 대학 무니(Mooney) 교수 연구팀을 중심으로 알지네이 트 고분자 뼈대에 화학적으로 RGD와 같은 펩타이드를 결합시켜 이 단점을 보완하여 사용하고 있다. 대표적인 국내 외 연구진으로는 한국과학기술연구원 이강원 박 사, 일리노이 주립대학교 공현준 교수가 있다.
아가로즈는 알지네이트와 유사하게 해조류에서 추출 한 고분자 물질로 일반적으로 분자 생물학에서 DNA 전 기영동을 하는데 오래 전부터 널리 쓰이고 있다. 파우
더 형태를 물에 녹인 후 전자레인지 등으로 가열을 하 면 액체 상태가 되어 생체 조직 칩에 주입하는 데 용이 하고 이후 온도를 낮추면(예를 들어, 상온) 고형화시켜 구조체를 만들 수 있다.
젤라틴은 콜라젠과 유사한 성분으로 보통 분해된 (denatured) 콜라젠 섬유 조각들이 주 구성 물질이다.
파우더 형태를 녹여 액체 상태로 만든 뒤 온도를 낮추 면 고형화시킬 수 있다. 세포를 심어 직접 3차원 배양 등에 활용할 수 있고 대표적인 국내 연구진으로 서울대
그림 2 생체 조직 칩에 활용되고 있는 다양한 생체재료(하이드로젤)들의 예
3차원 세포 배양 칩에 쓰이는 생체재료
학교 황석연 교수 연구팀이 줄기세포 배양과 관련하여 이 재료를 사용하고 있다. 이 재료의 또 다른 특징은 섭 씨 37도 이상이 되면 젤화된 구조체가 녹아나가므로 생 체 조 직 칩 을 제 작 하 는 데 있 어 서 희 생 층 /성 분 (sacrificial layer/component)으로 이용하여 미세유체채 널 구조를 만드는 등에 응용할 수도 있다.
피브린은 섬유질 형태의 단백질로서 혈액의 응고에 관여하는 물질이다. 위에 언급한 다른 재료들과 마찬가 지로 액체 상태로 세포와 섞는 등의 과정을 거친 후 가 교제 역할을 하는 트롬빈(thrombin)과 섞어 생체 조직 칩에 주입하는 등의 방법으로 원하는 구조체를 형성할 수 있다.
매트리젤은 엄밀히 얘기하면 천연 고분자 하이드로 젤의 카테고리에 속하지는 않는다. 암세포가 발현하는 각종 세포 외 기질 성분들을 정제하여 상용화한 제품으 로 파이브로넥틴(fibronectin), 라미닌(laminin) 등 세포 성장에 도움을 줄 수 있는 다양한 인자들이 포함된 재 료로 많은 연구자들이 사용하고 있기는 하지만 매트리 젤 제조의 특성 상 어떤 성분이 얼만큼 포함되어 있는 지 정확히 알 수 없고 제품이 나오는 배치(batch)마다 상대적으로 편차가 큰 단점이 있다. 또한, 앞서 언급한 재료들 중 경도는 가장 낮은 편에 속하므로 재료 자체 만으로 활용하기보다는 다른 재료와 일부 섞어 사용하 는 방법이 보다 널리 쓰이는 편이다.
합성 고분자 하이드로젤
조직공학 분야에서 쓰이고 있는 상당수의 생체재료 들은 생분해성 등 다양한 기능들을 가진 합성 고분자 하이드로젤이다. 그 중 생체 조직 칩에 활용 가능하기 에 용이한 대표적인 재료로는 폴리에틸렌글라이콜 (PEG: polyethylene glycol)을 들 수 있다. PEG은 단백 질 등이 비특이적으로 달라붙는 것이 훨씬 적은 대표적 인 물질로 평균 분자량에 따라 점도, 친수성-소수성, 다 공성 등을 쉽게 조절할 수 있는 장점이 있다. 또한, 아
크릴레이트(acrylate)와 같은 기능기를 부착시키면 원 하는 모양, 패턴대로 광가교(photocrosslinking)도 가능 하므로 액체 상태에서 PDMS-유리 기반의 투명한 생체 조직 칩에 주입한 후 자외선(UV)을 세포 독성이 없거나 최소화할 수 있는 선에서 쬐면 고형화시킬 수 있다.
PEG은 광가교 기능기뿐만 아니라 다른 생화학적 인자 들을 고분자 체인에 결합시키는 것도 어렵지 않아 활용 가능성이 상당히 높다고 할 수 있다. PEG에 세포를 심 어 3차원 배양 등 다양한 생물학적 실험을 해오고 있는 대표적인 연구진은 콜로라도 주립 대학교에 앤세스 (Anseth) 교수 연구팀이 있다. 천연 고분자 하이드로젤 에 비해 상대적으로 생체 조직 칩에는 PEG의 활용도가 아직 크지 않은 면은 있으나 PEG 자체로서도 장기간 세포 배양, 생리학적/병리학적 모델 구축에 충분한 활 용성을 발표한 연구 논문들이 상당 수 있으므로 앞으로 PEG을 이용한 생체 조직 칩도 더 많이 개발될 것으로 예상된다.
천연-합성 고분자 하이드로젤의 하이브리드 생체재료
앞서 언급한 여러 가지 고분자 하이드로젤들 중 원하 는 응용 분야에 맞게 장점과 단점을 보완할 수 있도록 천연 고분자 하이드로젤과 합성 고분자 하이드로젤을 물리적으로 섞거나 혹은 화학적 결합을 통한 하이브리 드 생체재료도 생체 조직 칩에 이용될 수 있다. 예를 들 어, 콜라젠-PEG, 젤라틴-PEG을 이용하면 생물학적으로 용이한 성분을 추가하면서도 기계적 물성이나 광가교 패터닝이 가능하도록 활용할 수 있다. 최근 들어, 조직 구조체 내 세포 주위 미세환경 중 기계적 물성이 세포 성장 및 조직 형성에 미치는 영향에 대해 점점 더 큰 관 심이 생기고 있으므로 앞으로 다양한 조합을 통한 새로 운 하이브리드 생체재료들이 개발되고 생체 조직 칩 기 술과도 접목될 수 있을 것으로 예상한다.
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