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2015年 2月 석사학위논문
황토로부터 분리한 Paeni bac i l l us속 세균이 생산하는 지질펩타이드 f e ngyc i n의 항진균 제재로의 응용
朝鮮大學校 大學院
신재생에너지융합학과
金 鍾 旼
황토로부터 분리한 Paeni bac i l l us속 세균이 생산하는 지질펩타이드 f e ngyc i n의 항진균 제재로의 응용
I sol at i on ofl i popept i de-pr oduci ng Paeni baci l l us st r ai n f r om yel l ow l oessandappl i cat i on of
f engyci n asan ant i f ungalagent
2015年 2月 25日
朝鮮大學校 大學院
신재생에너지융합학과
金 鍾 旼
황토로부터 분리한 Paeni bac i l l us속 세균이 생산하는 지질펩타이드 f e ngyc i n의 항진균 제재로의 응용
指 導 敎 授 金 時 郁
이 論文을 工學碩士學位申請 論文으로 提出함.
2014年 10月
朝鮮大學校 大學院
신재생에너지융합학과
金 鍾 旼
金鍾旼 의 工學碩士學位 論文을 認准함
委員長 全南大學校 敎授 이 철 원 ( 印) 委 員 全南生物防除硏究員 博士 김 평 일 ( 印) 委 員 朝鮮大學校 敎授 김 시 욱 ( 印)
2014年 11月
朝 鮮 大 學 校 大 學 院
목 차
ListofTables···ⅲ ListofFigures···ⅳ ABSTRACT···ⅴ
제 1장 서 론 ···1
제 1절 연구배경 ···1
제 2절 연구목적 ···4
제 2장 연구내용 및 방법 ···9
제 1절 사용균주 및 배지 ···9
1.사용균주 ···9
2.사용배지 ···9 제 2절 시료채취 및 균주 선별 ···10 1.시료채취 ···10 2.항진균 활성이 있는 균주 선별 ···10 제 3절 균주동정 ···11 1.분자생물학적 특징 ···11 2.생리·생화학적 특징 ···12 제 4절 선별된 균주를 이용한 항진균 활성 확인 ···16 제 5절 선별된 균주의 물질 분리 및 항진균 활성 확인 ···16 1.Chloroform 추출법을 이용한 물질 분리 ···16 2.Pureculture를 통해 분리한 물질을 이용한 항진균 활성 확인 ···18 3.Competitionculture를 통해 분리한 물질을 이용한 항진균 활성 확인 ···18
제 6절 항진균 확인 물질 분석 및 항진균 활성 확인 ···19 1.HPLC를 이용한 물질 분리 및 정제 ···19 2.분획별 항진균 활성 확인 ···19 3.항진균 활성 확인 물질 분석 ···20
제 3장 결과 및 고찰 ···21 제 1절 항진균 활성이 있는 균주 선별 ···21 제 2절 균주 동정 ···23 1.분자생물학적 특징 ···23 2.생리·생화학적 특징 ···26 제 3절 선별 된 균주를 이용한 항진균 활성 확인 ···28 제 4절 선별된 균주를 이용한 물질 분리 및 항진균 활성 확인 ···29 1.Pureculture를 통해 분리한 물질을 이용한 항진균 활성 확인 ···29 2.Competitionculture를 통해 분리한 물질을 이용한 항진균 활성 확인 ···30 제 5절 항진균 확인 물질 분석 및 항진균 활성 확인 ···32 1.HPLC를 이용한 항진균 물질 분리 ···32 2.분획별 항진균 활성 확인 ···35 3.항진균 활성 확인 물질 분석 ···39
제 4장 결 론 ···45
참고문헌 ···47
Li s tofTabl e s
Table 1. Annual consumption of agricultural pesticides and chemical
fertilizerinSouthKorea···3
Table2.Generalpropertiesofbioticpesticides···3
Table3.ListofbiopesticidesusedinSouthKorea ···7
Table4.Listofpathogenicfungiusedinthisstudy···9 Table5.BiochemicalcharacterizationofP.kribbensisCU01isolate···27 Table 6. Antifungal activity of preparative HPLC fractions of P.
kribbensis and S. sclerotiorum competition cultured chloroform extracts···37 Table 7.Scanning Electron Microscopic (SEM)analysis ofmorphological
changes ofF.oxysporum withoutandwithpositiveantifungalfractions (Nos.5& 7)···38 Table8.Comparativeassesmentofantifungalfengycincompoundsproducedfrom
P.kribbensisCU01andexistingfengycincompounds ···44
Li s tofFi gur e s
Fig.1.Generalstructuresofantifungallipopeptidefamilies.···8 Fig.2.Flowchartofantifungallipopeptideextraction.···17 Fig.3.Antifungalactivityof14bacterialisolates(grownontheupperandlowerPDA
agarplates).···22 Fig.4.16SrRNAsequenceofP.kribbensisCU01isolate.···24 Fig.5.Phylogenetic tree constructed based on the 16S rRNA sequences of P.
kribbensisCU01isolateandgenetically relatedPaenibacillus strains (Genbank numbersgiven in parenthesisandCohnellathermotoleransasselectedout group).···25 Fig.6.TEM analysisofP.kribbensisCU01isolate.···26 Fig.7.AntifungalactivityofP.kribbensisCU01isolateagainstfivepathogenicfungi.28 Fig.8.AntifungalactivityofpurecultureP.kribbensischloroform extracts.···30 Fig.9. AntifungalactivityofP.kribbensisandS.sclerotiorum competitioncultured chloroformextracts.···31 Fig.10.Totalion chromatogram (TIC)ofmiddle layersupernatant(#1)ofP.
kribbensisandS.sclerotiorum competitionculturedchloroform extract.···33 Fig.11.Preparative HPLC purification of middle layer supernatant (#1) of P.
kribbensisandS.sclerotiorum competitionculturedchloroform extract.···34 Fig.12.Antifungalactivity ofpreparativeHPLC fractionsofP.kribbensisand S.
sclerotiorum competitionculturedchloroform extracts.···36 Fig.13.LC/MS spectraanalysisofpreparativeHPLC positiveantifungalfractions producedfrom P.kribbensisCU01,(A):FractionNo.5;(B),FractionNo.7; (C),FractionNo.9;and(D),FractionNo.10. ···43
ABSTRACT
I sol at i on ofl i popept i de-pr oduci ng Paeni baci l l us st r ai n f r om yel l ow l oessandappl i cat i on of
f engyci n asan ant i f ungalagent
JongMinKim
Advisor:Prof.Kim,SiWouk,Ph.D.
DepartmentofRenewableEnergyConvergence GraduateschoolofChosunUniversity
In the presentstudy,potentialantifungalactivity possessing bacterial strainswereisolated from yellow loesssoilsamplescollected from sweet potato cultivating agricultural land, Jeollanam Haenam, Korea. The enrichmentculture was performed in Tryptic Soy Agar(TSA)medium.
Theseriallydilutedyellow loesssoilsample(100µl)werewithdrawn and spreaontheTSA platedandincubatedat30℃ for24h.Afterincubation, F.oxysporum cultured containing yellow loesssoilsamplespread on the TSA plates and at30〫℃ for5day.Totally 14 potentialbacterialstrains were selected based on theclearzonearound thesmear.Theantifungal activity ofthe14isolatedstrainsweretested againstdifferentpathogenic fungalspeciessuchasvasculartissuewildcausing Fusarium oxysporum, grey mould causing Botrytiscinerea,whitemouldorwatery softrotand
cottony rotcausing Sclerotinia sclerotiorum,late blightor water mold causing Phytophthora capsiciand Florist’s cyclamen anthracnose causing Colletotrichum gloeosporioides.From theantifungalactivity testsagainst 5 pathogenic fungal species,only one bacterial strain showed higher antifungalactivity againstallfungalspecies.This bacterialisolate was selectedforfurtherexperiments.Thepotentialbacterialstrainwasfurther identifiedby16S rRNA amplificationandnucleotidesequencing.According to the results obtained from the preliminary tests, the strain was tentatively named as Paenibacillus sp. On the basis of 16S rRNA sequence studies, the isolate was found to having 99.52% sequence similarity with Paenibacillus kribbensis AM49.Finally the isolate was named as P. kribbensis CU01. The initial antifungal activity was confirmed by paperdisk method using 2daysgrown P.kribbensisCU01 in TSB at30℃.After 2 days incubation,the cells used as antifungal agentagainstaforementioned pathogenic fungalspecies.In addition,the competition culture was performed as 1 day grown S.sclerotiorum with P.kribbensisCU01andpureculturewasperfomedas2day grown,then incubated under controlled conditions.After incubation,the supernatant wascollectedandantifungalsubstancewasextractedusing chloroform as organicsolventand theextractswerelabeled as#1,#2and #3.Allthree extracts were used for antifungal activity tests against 5 pathogenic fungalspecies.Afterpurecultureextractsdidn'tshow antifungalactivity.
Butcompetition cultured 3extracts,#1showed higherantifungalactivity.
Further,theextract#1 wasseparated and purified using HPLC equipped with C18 column using a reverse phase flow mode.Afteranalysis,the collected fractions (1 ~ 12)were concentrated and dissolved in desired volumeof99% MeOH.Theantifungalactivity ofthisprepsampleswere
tested againstallfivefungalspeciesusing paperdiscmethod.From the results,thefractionNos.5,7,9and10showedantifungalactivityagainst C.gloeosporioidesandF.oxysporum.Among thesefractions,thefraction No.5and7showedhigherantifungalactivity againstF.oxysporum.The effectofantifungalfractions No.5 & 7 on F.oxysporum hypae was observed in SEM.A significantmorphologicalchangeslikedestruction of hyphae,conidia spores and growth inhibition was noted in 5 days of incubation.Forstructuralelucidation oftheantifungalagentsobtained in fraction Nos.5,7,9 and 10 were identified by LC/MS.The parental compound LC/MS peakswereobtained molecularweights1482m/z,1464 m/z,1448m/z,1492 m/zfrom fraction Nos.5,7,9 and 10,respectively.
From the generated protonated ion peaks in LC/MS,allthe fractions containing theparentalantifungalcompoundswereidentified asfengycin.
Furtherexperimentssuch asMALDI-TOF MS/MS areneed to complete structuralconfirmationoffengycincompounds.
제 1장 서 론
제 1절 연구배경
인류문명 발달은 농업의 생산성 향상과 함께 시작되었다.‘생존’을 위해 자연에서 수렵과 채집을 하던 인류가 경작을 통해 식량을 생산하면서,잉여시간을 갖게 되고 문명화의 길을 걷게 되었다.이러한 농경문화가 먼저 발달한 곳은 티그리스 -유프 라테스 강 유역의 메소포타미아,나일 강변의 이집트,인도의 인더스 강 유역 그리 고 중국의 황하 유역이었다.생육이 좋고 수확량이 많은 종자를 채종 및 개량,관 개수로 건설 등의 농업기술 개발로 인해 농업 수확량은 점차 증가하였지만,기원전 2,000년경 이집트와 메소포타미아의 기록에 맥 (麥 ;보리)류의 붉은 진균 병에 의 한 농작물 피해사례가 기록될 만큼 고대부터 현재까지 각종 병해충으로 인한 농 업 생산성 증대는 한계에 부딪히고 있다.특히,식물병원성 진균에 의한 농작물피 해는 점차적으로 증가 되고 있으며,진균에 대한 농작물의 피해를 줄이기 위해 1930년대 후반부터 농약 개발 및 보급이 본격화 되었다.현재 농작물에 사용되는 대부분의 농약은 다양한 화학물질의 합성을 통해 농약이 개발되기 시작하면서 진 균과의 전쟁이 시작되었다.효과적인 진균 제어를 위한 농약 개발을 위한 다양한 화학 기술이 가속화되면서 유기인제,비소화합물,유기염소제,카바메이트,유기수 은제 그리고 유기 불소제 등을 활용한 다양한 농약이 개발되기 시작하였다.현재 전 세계적으로 1,200여 가지 이상의 화학합성 농약이 개발되어 있으며 살포량은 연 간 250만톤 정도인 것으로 알려져 있다 [1].국내의 경우 농촌진흥청 농약등록 데이 터베이스에 의하면 2014년 4월 기준으로 2,265개의 농약 상품이 등록되어 있으며 종류별로는 살충제 661개,살균제 829개,살균살충제 45개,제초제 605개,살충제초 제 1개 그리고 생장조절제 99개,기타 25개이다.이렇듯 전 세계적으로 연구 개발 되고 있으며 국내에서도 많은 농약이 등록되고 사용되어 지고 있다.국내 평균 화 학비료 사용량의 경우 2013년도에 ha당 262kg,농약사용량은 ha당 10.9kg으로 조 사되었으며,연도별 추이를 보았을 때 최근에는 화학비료와 농약사용량이 점차 감 소되는 추세를 보이고 있다[2](Table1).이렇듯 화학농약의 사용량이 감소하는 것은
그 부작용 때문인 것으로 볼 수 있다.화학농약의 무분별한 사용은 농약의 오남용, 독성,환경오염 및 자연 생태계에 미치는 악영향과 약제 내성의 출현 등에 의한 약 효 감소 등의 부작용이 나타난다.용도에 맞지 않게 무분별하게 사용된 농약의 오 남용으로 인해 살포된 농약의 1%만이 목표 해충에 도달하고 나머지의 많은 양은 토양에 유독물질로 들어감에 따른 환경오염 그리고 오랜 기간의 사용으로 인해 약 제 내성의 출현 등에 의한 약효감소로 인해 농약의 사용이 증가되어왔던 것이 사 실이고 이로 인해 농약의 사용양이 증가 해왔었다.그리고 농약 사용에 따른 생물 농축으로 인해 우리들의 건강에도 큰 피해를 입힐 수 있는 가능성이 있다.한편으 로는 웰빙 (Well- being)또는 로하스 (LifestyleOfHealth And Sustainability, LOHAS)라는 용어에서 보듯이 자연스럽고 건강한 식습관을 찾는 것이 현대인이 추구하고 있는 소비문화이다 [3].이러한 현대인들의 의식 변화와 농약 사용으로 인 한 문제로 인해 친환경 농업이 대두되어졌고 증가되어 지고 있는 추세이다.최근 농약보다 안전하고 부작용이 적은 농약의 대체 방안의 하나가 생물농약이라고 할 수 있다.생물농약의 주체는 자연에 존재하고 있는 미생물과 미생물이 생산하는 활 성물질을 이용하는 것으로 분류 할 수 있으며 활용 분야는 농약과 동일한 살균,살 충,제초,생장조절제 및 방지제가 실용화되어지고 있다.물론 생물농약에도 장ㆍ단 점이 존재한다 (Table2)[4].하지만 생물 농약은 역할이 다양한 유용미생물 농약으 로 접목시키고 앞에서 언급한 농약의 단점을 보완하고 그 기능을 대신하고 또한 환경을 보호하고자 하는 차원에서 등장하였다.현시점에서 아직까지 생물 농약을 개발시키고 보완해 나아가야 할 사항이 많다.하지만 생물 농약은 현재의 것만이 아닌 환경을 살리는 것에도 한 몫을 할 것이다.더구나 미생물이라는 자원은 천연 부존자원이기 때문에 다른 나라에 비해 자원이 없는 우리나라에는 생물농약의 단 점을 보완해 나간다면 경제적인 측면에서도 이로운 것임에 틀림없다.
Table1.Annualconsumptionofagriculturalpesticidesandchemicalfertilizerin SouthKorea[2]
(단위:Kg) 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 농
약
총사용량 1,936 1,941 1,921 1,806 1,856 1,834 1,873 1,820 1,797 1,767 1,749 ha당
사용량 12.7 13.0 12.8 12.9 13.1 13.8 12.2 11.2 10.6 9.9 10.9 화
학 비 료
총사용량 678 747 722 477 631 570 500 423 447 472 459 ha당
사용량 350 385 376 257 340 311 267 233 249 267 262
Table2.Generalpropertiesofbioticpesticides[4]
장 점 단 점
생물 농약
저독성이다. 약효발현이 늦다.
생태계에 영향이 적다. 적용범위가 소수의 종으로 한정되 어 있다.
약제내성이나 저항성유발을 보이 지 않는다.
미생물자체 이용시 제품안 정성의 변동이 우려될 수 있다.
약제내성 병해충에 대해서도 방제 효과가 있다.
환경오염에 대한 염려가 없다.
무한한 부존자원이다.
제 2절 연구목적
생물농약은 길항미생물을 이용한 방제법으로 작물의 식물병원균을 제어하는 환경 친화적인 방제기술로써 국내ㆍ외에서 활발한 연구가 진행되고 있다.두 종류의 미 생물을 같은 배지에 배양하는 경우 한쪽의 미생물의 발육이 다른 미생물에 의해 억제 되는 현상을 미생물간의 길항 현상 (antagonism) 이라고 한다. 1876년 Thyndall이 진균과 세균과의 길항 작용을 관찰하였으며 1877년 Pesteur와 Joubert 는 1종의 세균과 탄저균과의 사이에서 길항 현상에 대한 연구결과를 발표하였다.
본 연구에서는 이런 길항 작용을 competition-culture라고 기술 하였다 [5].국내 에서는 생물농약에 대한 연구가 1970년대 후반부터 본격적으로 시작하였으며 학교 및 연구기관에서 산발적으로 시작하였었다.하지만 1990년대에 들어서면서부터 생 물농약에 대한 연구 개발이 어느 정도 활성화 되었으며 이후 1997년도 친환경농업 육성법이 1997년 12월 13일에 제정되고 정부의 화학농약 감소를 위한 친환경농업 에 대한 지원이 증가되면서 생물농약의 개발이 본격적으로 시행되고 지금까지 국 내기업에서도 생물농약의 개발이 활발히 이루어지고 있다 (Table3)[3].
생물농약을 이용해 식물병원성 진균을 방제하는 생물방제 기작은 크게 다섯가지로 구분할수 있다.① 식물병원성 진균의 세포벽을 분해하는 용균작용,② Bacillus속, Penicillium 속,Pseudomonas속,Streptomyces속 등이 생산하는 항생물질에 의 해 직접 식물병원균의 생물을 저해하는 항생작용,③ 식물병원성 진균에 기생하면 서 식물에 대한 진균의 병원성을 억제하는 기생작용,④ 생육공간에서 영양분과 같 은 생육에 필요한 인자를 경쟁함으로써 병원균의 생육 증식을 억제하는 경쟁적 길 항작용,⑤ 미생물이 생산하는 exopolysaccharide(EPS),lipopolisaccharide(LPS), salicylicacid (SA),hydrogen cyanide(HCN),2,3-butanediol등의 물질들에 의해 서 식물의 면역기능을 활성화하여 병에 대한 저항성을 유도하는 유도저항성을 이 용한 방제 기작이다 [6]. 본 연구에서는 ② Bacillus 속, Penicillium 속, Pseudomonas속,Streptomyces속 등이 생산하는 항생물질에 의해 직접 식물병원 균 진균의 생물을 저해하는 항생 작용하는 생물방제 기작을 이용하여 식물병원성 진균을 제어 하였다.
이러한 항생물질을 이용한 생물방제 기작에는 Bacillus속에서 생산하는 항생물질
에 의해 많이 의존해 왔었다. 대표적으로 B.cereus에서의 kanosamine 또는 zwittermycin A와 같은 병원균이 생장을 억제하는 다양한 항생물질이 Bacillus속 에서 생산된다 [7].Bacillus 속이 생산하는 항생물질로는 ribosome에서 합성되는 subtilin,subtilosin A,sublancin 등과 ribosome이 아닌 복합 효소(multi-enzyme) 경로를 통해 합성되는 surfactin,iturin,mycosubtilin,fengycin,bacilysin 등이 대 표적이다 [8]. 이러한 항생물질 중에서 양친매성 생물계면활성제 (amphiphilic biosurfactant)를 가지고 있는 surfactin,iturin 그리고 fengycin (또는 plipastatin) 이 포함되어 있는 cycliclipopeptides(LPs)를 이용한 생물방제의 연구가 많이 이루 어 졌다.Cycliclipopeptide는 친수성인 펩티드 고리와 소수성인 지방산 사슬이 결 합돼 있는 구조를 가지며,종류는 아미노산의 구성과 지방산의 길이,분지,포화도 에 따라 다양하게 나뉜다. 대표적인 cyclic lipopeptide로는 iturin, surfactin, fengycin으로 나뉜다.이들 물질은 항균활성을 가지고 있다고 보고되었다.Iturin은 B. subtilis 와 B. amyloliquefaciens에서 주로 생산되며 [9], surfactin은 B.
coagulans,B.pumilus그리고 B.licheniformis에서 생산된다 [10].그리고 fengycin 은 B.cereus,B.thuringiensis,B.subtilis그리고 B.amyloliquefaciens에서 생산 되어진다 [11].이 항균물질들은 acylchain의 길이에 따라 활성이 나타내는 대상이 달라지는데 지방산 길이가 비교적 짧은 lipopeptide는 항박테리아 활성과 항바이러 스 활성을 나타내고,지방산 길이가 긴 lipopeptide는 항진균 활성을 나타낸다.
Iturin은 7개의 아미노산으로 이루어진 펩티드 고리를 가지고 있고 C14~C17길이의 β-amino지방산 사슬을 가지고 있으며 주로 항균활성을 나타낸다.Fengycin은 펩 티드고리가 10개의 아미노산으로 이루어져 있고 C14~C19길이의 β-hydroxy 지방 산 사슬을 가지며 iturin과 마친가지로 항균활성을 가지고 있다.Surfactin은 7개의 아미노산 (L-asparagine,L-leucine,glutamicacid,L-leucine,L-valineand 2개의 D-leucines)과 C12~C16길이의 β-hydroxy 지방산 사슬로 이루어졌으며 항박테리아 활성과 항바이러스 활성이 있다 [20].
이렇듯 Bacillus속에서 생산되는 다양한 항생물질은 위에서 말한 길항작용을 이용 한 생물방제 뿐만 아니라 뿌리 집락형성 및 면역 부활제의 기능도 가지고 있다 [21]. 이러한 항생물질들은 Bacillus속 이외에도 Paenibacillus속 균주에서도 형성되어 진다는 연구결과가 나왔다.Paenibacillus 속은 Ash 등이 1993년에 제안한 16S rRNA 염기분석의 의하여 Bacillus속에서 분리,재분류한 이후 P.polymyxa를 포
함한 11개의 종으로 새로이 제시되었다 [22].
우리나라의 토양은 객토,미립토 및 사립토 등과 같이 여러 가지 형태로 존재하고 있으며,그 중 황토는 우리나라 국토면적의 30%를 차지하고 있다.황토 한 스푼에 는 약 2억마리의 미생물이 살고 있어 일반 토양에 비해 적은 수의 미생물 (2x108 CFU/g)이 서식 중이며 비교적 척박한 환경조건을 가지고 있다.하지만 척박한 환 경에서 서식하는 황토 미생물의 경우 특정 효소와 대사산물을 생산할 가능성이 높 을 것으로 예상되며,다양한 실험을 통해 생물의 성장에 좋은 영향을 미치는 것으 로 조사되었다.하지만 현재 국내에 보고 된 바에 따르면 황토를 이용한 미생물 제 재 성능 및 생물농약에 대한 연구는 아직 미비한 실정이다 [12].따라서 본 연구에서 는 일반토양에 비해 척박한 황토에서 친환경 및 친생태적 방제능을 갖는 항생물질 을 내는 미생물을 분리하여,그 특성을 동정한 후 분리 한 균주의 항생물질에 대해 분석하고자 한다.
Table3.ListofbiopesticidesusedinSouthKorea[3] 번
호 용도 제조 수입
취급
분야 품목명 등록규격
(%) 1 살균 제조 미생물 BacillussubtillisDBB 1501수화제 1×109cfu/g 2 살균 제조 미생물 BacillussubtillisDBB 1501입제 1×106cfu/g 3 살균 제조 미생물 BacillussubtillisCJ-9액상현탁제 1×107cfu/ml 4 살균 제조 미생물 BacillussubtillisM27고상제 2×108cfu/g 5 살균 수입 미생물 BacillussubtillisMBI600수화제 2×1011cfu/g 6 살균 수입 미생물 BacillussubtillisY 1336수화제 1×109cfu/g 7 살균 제조 미생물 BacillussubtillisEW 42-1액상현탁제 1x107cfu/ml 8 살균 제조 미생물 BacillussubtillisJKK 238액상제 5x107cfu/ml 9 살균 제조 미생물 BacillussubtillisGB 365수화제 3×107cfu/g 10 살균 제조 미생물 BacillussubtillisGB 365액상수화제 1×107cfu/ml 11 살균 제조 미생물 BacillussubtillisKB 401유상현탁제 2x107cfu/ml 12 살균 제조 미생물 BacillussubtillisKB 401유상현탁제 2x107cfu/ml 13 살균 제조 미생물 BacillussubtillisKBC 1010수화제 1x105cfu/g 14 살균 수입 미생물 BacillussubtillisQST 713수화제 5×109cfu/g 15 살균 수입 미생물 BacillussubtillisQST 713액상수화제 1x109cfu/g 16 살균 제조 미생물 Bacillusamyloliquefaciens KBC 1121 수화제 1×106cfu/g 17 살균 제조 미생물 BacillusamyloliquefaciensKBC 1121수화제 1×106cfu/g 18 살균 수입 미생물 BacilluspumilusQST 2808액상수화제 1x109cfu/g 19 살균 제조 미생물 StreptomycesgoshikiensisWYE324액제 1×105cfu/ml 20 살균 제조 미생물 StreptomycescolombiensisWYE20액제 1×104cfu/ml 21 살균 제조 미생물 Simplicillium lamellicolaBCP수화제 5×107cfu/g 22 살균 제조 미생물 AmpellomycesquisqualisAQ 94013수화제 1×107cfu/g 23 살균 수입 미생물 TrichodermaatrovirideSKT-1수화제 1×108cfu/g 24 살균 제조 미생물 Trichodermaharzianum YC 459고상제 1×108cfu/g 25 살균 제조 미생물 PaenibacilluspolymyxaAC-1액상수화제 5×106cfu/ml 26 살충 제조 미생물 M.thaumasium KBC 3017고상제 1x104cfu/g 27 살충 수입 미생물 BeauveriabassianaGHA유상현탁제 1×108cfu/ml 28 살충 수입 미생물 BeauveriabassianaTBI-1액상제 1×106cfu/ml 29 살충 수입 미생물 B.T.subsp.aizawai액상수화제 8.5BIU/kg 30 살충 수입 미생물 B.T.subsp.aizawai입상수화제 35,000BMU/mg 31 살충 제조 미생물 B.T.subsp.aizawaiNT 423수화제 1×109cfu/g 32 살충 제조 미생물 B.T.subsp.aizawaiNT 423액상수화제 1×108cfu/ml 33 살충 제조 미생물 B.T.subsp.aizawaiGB413액상수화제 1×107cfu/ml 34 살충 제조 미생물 B.T.kurstaki수화제 16BIU/kg 35 살충 수입 미생물 B.T.kurstaki액상수화제 10%
36 살충 수입 미생물 B.T.kurstaki입상수화제 64BIU/kg 37 살충 수입 생화학 Azadirachtin입제 0.15%
38 살충 제조 미생물 PaecilomycesfumosoroseusDBB-2032수화제 5×107cfu/g 39 제초 수입 생화학 Pelargonicacid유제 53%
Fig.1.Generalstructuresofantifungallipopeptidefamilies.
제 2장 연구내용 및 방법
제1절 사용균주 및 배지
1.사용균주본 연구에서 사용된 균주는 황토로부터 분리한 Paenibacillus속 균주를 사용하 였으며,항진균 실험을 위하여 농업유전자원센터 (KACC)로부터 식물병원성 진균 5종을 분양을 받아 사용하였다 (Table 4).각 실험군 진균 종은 Colletotrichum gloeosporioides,Phytopthora capsici,Sclerotinia sclerotiorum,Botrytis cinerea 그리고 Fusarium oxysporum 과 같은 식물병원성 진균을 대상으로 하였다.
No Strains KACC No. Diseases 1 Botrytiscinerea 40574 잿빛 진균병
2 Colletotrichum gloeosporioides 40003 탄저병 3 Phytophthoracapsici 40157 역병 4 Fusarium oxysporum 40031 시들음병 5 Sclerotiniasclerotiorum 40457 균핵병 Table4.Listofpathogenicfungiusedinthisstudy.
2.사용 배지
(가)TrypticSoy Broth(TSB)
본 실험은 황토에서 분리한 Paenibacillus속 균주에서 항진균 활성이 있는 물질 을 탐색하기 위해서 trypticsoy 액체배지 (TSB)를 사용하였으며,이는 많은 종류 의 미생물을 배양하기 위해 사용되는 기본 배지이다.Trypticsoy액체배지 (TSB)
는 대게 박테리아의 특정 생화학적 실험에 적용하는데 사용된다.본 연구에서는 trypticsoy 액체배지 (TSB)를 이용하여 선별된 균주를 배양하고 균주로부터 생산 되는 물질을 확인하였다.
(나)PotatoDextroseAgar(PDA)
본 실험에서 항진균 활성을 알아보기 위한 실험을 위해 식물병원성 진균 배양을 위해 potato dextrose 고체배지 (PDA)를 사용하였다.Potato dextrose 고체배지 (PDA)는 potato와 dextrose의 영양분과 한천의 고체화 성질을 이용하여 효모를 포 함해 진균을 분리ㆍ배양하는 배지이다.
제 2절 시료채취 및 균주분리
1.시료 채취항진균 활성이 있는 미생물을 분리하기 위하여 전라남도 해남군 일대의 고구마 재배지의 황토를 채취하여 실험에 이용하였다.
2.항진균 활성이 있는 균주 선별
(가)항진균 활성이 있는 균주 분리
항진균 활성이 있는 균주를 분리하기 위하여 황토 속의 균들과 식물성 병원균을 같은 배지에 배양하는 방법을 이용하여 항진균 활성이 있는 균주를 분리하였다.항 진균 활성이 있는 미생물을 분리하기 위해 채취한 황토 샘플을 연속 희석법을 이 용하여 1.0x 10-3∼10-4까지 희석하였으며,희석한 샘플은 고체배지인 Trypticsoy 고체배지 (TSA)에 도말하였다.이 TSA 배지에 시들음병의 원인이 되는 식물 병 원성 진균인 F.oxysporum를 배지 중앙에 직경 1cm으로 가운데에 접종하여 25℃
에서 5일간 동시에 배양하였다.항진균 활성이 있는 분리 균주들을 보관을 위해 TSA 배지에 3회의 계대배양을 거친 후 glycerol과 1:1비율 (v/v)로 혼합하여 –8 0℃의 deepfreezer에 보관하여 사용하였다.
(나)항진균 실험을 통한 균주 선별
식물 병원성 진균인 F.oxysporum과 황토 샘플로부터 생장한 균주를 이용하여 동시 배양한 후 1차적으로 항진균 활성이 있는 균주를 분리하였다.분리된 균주 중 항진균 활성이 뛰어난 균주를 찾고자 농업유전자원정보센터 (KACC)에서 분양 받 은 5종의 식물병원성 진균을 potatodextrose고체배지에 접종하여 25℃에서 3∼5 일간 배양하였다.식물병원성 진균의 균사체가 중심부로부터 0.5㎝정도 생장 하였 을 때 1차적으로 분리한 세균 균주를 loop를 이용하여 균사체가 뻗어 나오는 중앙 부분으로부터 바깥 부분으로 2cm 정도를 streaking하여 식물 병원성 진균과 함께 배양하였다.실험에 사용한 균주는 1차로 항진균 활성을 보인 균주이었다.선별된 우수 균주는 보관을 위해 TSA 배지에 3회의 계대배양을 거친 후 glycerol과 1:1 비율 (v/v)로 혼합하여 –80℃의 deepfreezer에 보관하여 사용하였다.
제 3절 균주동정
1.분자생물학적 특징(가)16S rRNA sequence분석
선별된 균주의 유전학적 특성을 확인하기 위하여 16S rRNA의 염기서열 분석을 수행하였다. 선별된 균주의 genomic DNA를 template DNA로 사용하였다.
GenomicDNA추출은 선별된 균주를 TSB 배지에서 배양온도 30℃에서 2일 동안 배양하여 cellpellet을 확보하여 사용하였다.추출 과정은 균체를 멸균된 증류수로 두 번 세척하고 10 ㎖의 solution (50 mM glucose,10 mM,EDTA,25 mM Tris-HCl,pH 8.0)에 재현탁 하였다.여기에 1 ㎖의 lysozyme용액 (50 ㎎/㎖)과 0.5㎖ RNase(2㎎/㎖)및 0.1㎖ proteinaseK (50㎎/㎖)을 첨가하여 37℃에서 1 시간 방치한 다음 0.6㎖의 10% SDS solution을 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 방치 하였다.반응액에 1㎖의 mercaptoethanol을 가한 후 반응액의 0.5배에 해당하 는 3M sodium acetatesolution (pH 5.2)을 가하여 반응액에 동일양의 chloroform 을 처리하였다.이후 15,000× g에서 30분간 원심분리하여 상등액을 취하였고,이
렇게 얻은 상등액에 0.6배에 해당하는 isopropanol을 가한 후 chromosomalDNA pellet을 회수하여 70% ethanol로 세척한 다음 건조하였다.3㎖의 TE buffer(10 mM Tris-HCl,pH 8.0,1mM EDTA)에 녹여 실험에 사용하였다.16S rRNA 유전 자 염기서열을 Macrogen kit (Promega Co.,)를 이용하여 Polymerase Chain Reaction(PCR)으로 증폭시켰다.두 개의 universalprimerset인 16S Forward(27 F-5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')와 16SReverse(1492R-5'-GTTTACCTTGTTA CGACTT-3')을 이용하였다.Denaturation,annealing,extension을 각각 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 2분간 수행하였다 [13]. PCR product를 DNA purification kit (QIAGEN Inc.,)로 순수 분리한 후, Solgent Co.에 의뢰하여 sequencing 하였다. 16S rRNA 유전자 염기서열은 NCBI GenBank network service의 BLAST program을 이용하여 data검색을 하였다 [14].
2.생리·생화학적 특징
(가)형태관찰
선별균주의 형태를 추가적으로 조사하기 위해 전계방사형 투과전자현미경 (FE-TEM ;FieldEmission Transmission Electron Microscope)으로 관찰을 하였 다.전처리 과정은 trypticsoy 고체배지에서 배양한 균주를 0.7x0.7 cm의 크기로 잘라내어 에펜도르프 튜브 (eppendorftube)에 고정액 [2% GA (Glutaraldehyde) +2% PA(Paraformaldehyde)in0.05M cacodylatebufferpH7.2]을 1ml넣어주어 실온에서 4시간동안 고정한다.고정된 샘플은 원심분리기 (Hanil.,Supra 22K, Korea)를 이용하여 15분 동안 0.4xg의 조건으로 샘플을 침전시키고 고정액의 상 등액 부분을 제거한 후 샘플이 들어있는 에펜도르프 튜브에 0.05 M cacodylate buffer로 20분 간격으로 3회 교환하여 세척하였다.그 후 1% OsO4(in 0.05 M cacodylatebufferpH 7.2)로 실온에서 1시간 고정 후 0.05M cacodylatebufferpH 7.2로 20분 간격으로 3회 세척하였다.고정액을 제거한 시료가 들어있는 에펜도르 프 튜브에 0.05M cacodylatebuffer로 20분 간격으로 3회 교환하여 세척하였다.세 척이 완료된 샘플을 30%,50%,70%,90%,95% ethylalcohol로 20분 간격으로 탈 수하였다.그 후 최종적으로 100% ethylalcohol로 20분 간격으로 2회 탈수하였다.
탈수된 균주는 0.2um membrane filter에 시료를 필터링한 후 임계점 건조하였다.
건조된 샘플은 gold coating 후 3~15kv의 가속전압 조건하에서 FE-TEM (JEOL, JSM-2100F,Japan)으로 선별된 균주의 형태를 관찰하였다.
(나)Gram staining
세포벽 염색은 Hurker등의 gram 염색법 [15]에 따라 수행하였다.Slideglass에 TSB 배 지에서 배양한 균주를 100㎕ 가한 후 alcohollamp를 이용하여 균체를 고정시켰다.고정된 균체에 2% (w/v)crystalviolet용액을 떨어뜨리고 1분 30초간 염색시킨 후 착염제로 탈 색하였다.95% Alcohol을 이용하여 탈수한 후 2.5% (w/v)safraninO 용액을 떨어뜨리고 30초간 대비염색한 후 coverglass로 덮고 광학현미경 (OLYMPUS BX40,Japan)으로 1,000배의 배율로 관찰하였다.균체가 붉은색 또는 보라색으로 염색되었는지를 관찰하였다.
(다)Motility
선별균주의 운동성 여부를 확인하기 위해 10㎖ 시험관에 agar(0.5% w/v)를 포 함한 TSA 배지를 5 ㎖ 첨가하여 반유동고체배지로 제작하였다.균체는 침 끝에 묻혀 배지에 찔러서 접종을 하였으며,균체가 자라는 동안 접종부위를 중심으로 바 깥쪽으로 퍼져 자라는지,접종부위에 국한되어 자라는지를 관찰하여 운동성 유무를 결정하였다.
(라)Sporeformation
Spore는 특정한 세균의 체내에 형성되는 원형 또는 타원형의 구조로서 고온,건 조,물리적ㆍ화학적 조건에 대해서 저항력이 강하고 오래 생존한다 [16].Spore가 생 기는 균은 Bacillus와 Clostridium 등으로 알려져 있으며,선별균주의 spore형성 유무를 확인하기 위해,TSA 배지에 30℃,48시간 배양한 균주를 slideglass에 도말 하여 고정 표본을 만든 후에 포자생성 염색법으로 포자 생성유무를 확인하였다.먼저 80℃로 끓는 물이 담긴 비이커 위에 표본을 올려놓고,5% (w/v)malachitegreen염 색액을 부어 5분간 염색시킨 후 증류수로 수세하고 20초 동안 2.5% (w/v)safranin O로 대조 염색한 후 다시 수세하여 공기 중에 건조시켜 광학현미경에서 1,000배로 관 찰하였다.녹색으로 염색된 포자가 관찰되는 균을 포자형성양성으로 판정하였다.
(마)Anaerobicfermentation
혐기성 배양은 분자상 산소가 없는 상태에서 미생물을 배양하는 것을 말한다.혐
기성균,특히 편성혐기성 균 (절대혐기성 균)의 배양에는 배지를 공기 중으로 부터 차단, 산소 제거 및 산화환원전위의 저하 등의 조작이 필요하며, anaerobic chamber 또는 고층한천배지를 사용하는 방법 등을 이용한다 [17].선별 균주는 anaerobicchamber를 이용하여 O2를 완전 제거한 상태에서 TSA 배지에서 30℃로 48시간 배양하여 생장유무를 결정하였다.
(바)Ureasehydrolysistest
Urea분해능이 있는 세균의 검정법으로,urea가 분해되어 생성되는 암모니아를 지 시약으로 검출한다.Urease는 기질에 의하여 유도되는 효소가 아니며,특히 이 방법 은 urea를 아주 빨리 분해하는 Proteus속의 동정법으로 중요하게 이용되는 방법이다.
(사)Nitratereduction
Nitrate배지 (peptone10g,potassium nitrate1g)를 testtube에 넣고 대상균 주를 접종한 후 24∼48시간 배양하였다.배양액에 detection solution (0.5%,v/v, α-naphthylamine:0.8% sulfamilicacid=1:1)을 가하여 분홍·적색을 나타내는 것을 양성반응으로 결정하였다.
(아)Oxidasetest
Gram negativebacteria 중에서 호기성 세균과 조건적 혐기성 세균을 구분하는 데 사용하는 실험으로써 환원형의 cytochrome이 전자전달계의 최종 전자수용체인 산소의 의하여 산화되는 과정을 촉매하는 요소인 cytochromeoxidase의 활성 유무 를 조사하는 방법으로 사용된다.검정 하고자 하는 균을 영양 한천 평판 배지에 접 종하고 30℃에서 2일간 배양 후 95% 에탄올에 1%로 녹인 α-naphtol과 새로 만 든 1% dimethyl-p-phenylenediamineoxalatesolution의 1:1혼합액을 평판 배지 상의 colony에 몇 방울 가한 후 10-30초 이내에 콜로니가 짙은 청색으로 나타날 때 양성으로 간주하였다.
(자)Caseinhydrolysistest
단백질 가수분해능을 조사하는 방법의 하나로써,casien이 포함 된 milkagar에 균 주를 37℃에서 2일간 배양한 후 clearzone형성 여부를 판단하였다.
(차)Gelatinliquefactiontest
균체 효소인 gelatinase가 gelatin을 액화하는 능력을 시험하는 것이다.배지는 nutrientgelatin stab배지 (pH 6.8)를 이용하였다.Gelatin 배지에서 균주를 37℃ 에 배양 후 그것을 4℃ 냉장고에 두었다가 시험관을 기울여 보아 응고 여부를 확인하였다.
(카)Starchhydrolysis
다당류의 starch를 hydrolysis 가능여부를 조사하기 위해 starch를 함유한 배지 (peptone5g,yeastextract3g,solublestarch2g,pH 7)에 선별균주를 배양 후 gram’siodine용액을 가하였을 시 투명한 환 형성 여부를 조사하였다.
(타)APIkit를 이용한 균주 동정
APIkit는 biochemicaltest,assimilation test그리고 fermentationtest를 이용하 는 동정법이다.Biochemicaltest는 saline용액에 시험균을 현탁하여 건조된 기질이 들어있는 kit의 cupules에 접종하여 배양 후 발색시약을 첨가하여 물질의 대사유무 를 색의 변화로써 판정하는 방법이다.Assimilationtest는 최소배지에 현탁한 시험 균을 탄수화물이 유일한 탄소원으로 들어있는 kit의 cupules에 접종 배양한 후 시 험균이 이들 당을 이용할 수 있는지 여부를 탁도 변화로써 판정하는 방법이다.마 지막으로 fermentationtest는 당으로부터 산을 생산하는 pH의 변화로 판정하는 방 법이다.본 연구에서는 선별된 균주를 이용하여 제조회사의 실행방법 (Biomerieux, APImanualPage90~95)에 준하여 실시하였다.API50CHB/E medium에 균을 접종하여 이 균액을 API50CHB (Biomerieux)kit에 500㎕ 분주하고,37℃,1~2 일동안 배양하였다.배양 후 관찰하면서 49종류의 당 이용도 실험 결과를 얻은 후, analyticalprofileindex의 동정용 software를 이용하여 동정하였다.
제 4절 선별된 균주를 이용한 항진균 활성 확인
1.선별된 균주를 이용한 항진균 활성 확인선별 된 균주로부터 항진균 활성을 확인하기 위하여 농업유전자원정보센터 (KACC)에서 분양 받은 5종의 식물병원성 진균인 C.gloeosporioides,P.capsici ,S.sclerotiorum,B.cinerea,F.oxysporum를 potatodextrose고체배지 (PDA)에 접종하여 25℃에서 3∼5일간 배양하였다.식물병원성 진균의 균사체가 중심부로부 터 0.5㎝정도 뻗어 나올 때 6mm paperdisc(Advantecco,Japan.)에 20㎕씩 균 배양액을 접종하여 3∼5일 후 항진균 활성을 확인하였다.접종한 균 배양액은 선별 된 균주를 Trypticsoybroth(TSB)100ml에 접종 한 후 30℃에서 2일간 배양 된 것을 사용하였다.
제 5절 선별된 균주를 이용한 물질 분리 및 항진균 활성 확인
1.Chloroform 추출법을 이용한 물질 분리선별 된 균주에서 생산하는 항진균 물질의 추출을 위해 chloroform 추출 방법을 이용하였다.선별 된 균주를 pureculture와 competitionculture를 이용하여 배양하 였다.각각 배양하여 얻은 상등액을 9.6x g,15분 동안 원심분리기 (Hanil.,Supra 22K,Korea)를 이용하여 원심분리하였다.원심분리한 후 침전물을 제거한 상등액을 47mm Ø Glassmicrofibrefilters(Whatman co.,England)를 이용하여 여과하여 제균상태로 만들어 주었다.제균된 상등액 양의 2배가 되는 chloroform을 제균된 상등액과 2시간 동안 교반시켜주었다.교반 시킨 제균된 상등액과 chloroform은 separatefunnel에 넣어준 후 overnight시켜주었다 (supernatant:chloroform = 300ml:600ml).Overnight시켜준 샘플은 세 개의 층으로 나누어지며 제균된 상등액에 남아 있는 배지 성분이 포함되어 있는 upperlayer층을 제외 한 middle layer과 lowerlayer(chloroform 층)을 회수하여 물질을 추출하였다.먼저 middle layer을 회수하여 회전 농축기 (Rotary Evaporator,BUCHIco.,Switzerland)를 이용하여 유기용매인 chloroform을 휘발시킨 후 여과된 distilled water3ml로 잔 류 물질을 용해시켜 주었다.Distilled water에 용해된 샘플을 원심분리기 (Hanil.,
Supra22K,Korea)를 이용하여 5분 동안 9.6x g의 조건으로 spindown 시킨 후 회수한 상등액을 #1,그 다음 침전물은 다시 99% MeOH 3ml로 잔류 물질을 용 해시켜 같은 원심 분리 조건으로 spindown시킨 후 회수한 상등액을 #2라고 하였 다.Separatefunnel의 lowerlayer을 회수하여 회전 농축기를 이용해 chloroform을 휘발 시켜 농축하였다.농축된 물질을 99% MeOH 3ml로 잔류 물질을 용해시켜 같은 원심 분리 조건으로 spindown 시킨 후 회수한 상등액를 # 3라고 하였다 (Fig.2).
Fig.2.Flowchartofantifungallipopeptideextraction.
2.Pureculture를 통해 분리한 물질을 이용한 항진균 활성 확인
Chloroform 추출법을 이용하여 획득한 #1,#2,#3에서의 항진균 활성을 확인하기 위 하여 5종의 식물병원성 진균들을 PDA 고체배지에 접종하여 25℃에서 3∼5일간 배양하였 다.식물병원성 진균의 균사체가 중심부로부터 0.5㎝정도 뻗어 나올 때 10mm paperdisc (Advantecco.,Japan)에 100㎕씩 접종하여 3∼5일 후 항진균 활성을 확인하였다.접종한 샘플은 순수배양을 통해 획득한 제균된 상등액을 이용하여 chloroform 추출법으로 분리한
#1,#2,#3을 사용하였다.
3.Competitionculture를 통해 분리한 물질을 이용한 항진균 활성 확인
(가)Competition culture를 통한 균주 배양
선별된 균주에서 생산되는 항진균 물질이 순수배양에서 생산되는 물질보다는 더 많은 물 질의 생산을 위해 competitionculture를 하였다.Competitionculture는 순수배양에서 생산 되는 물질보다는 많은 물질을 생산하기 위해 배양 과정에서 선별된 균주와 진균을 같은 배 지에 넣어주어 경쟁 관계를 만들어주어 배양되어진 균주와 진균간의 길항작용을 이용하여 보다 많은 물질을 생산하기 위함이다.Potatodextrose고체배지에 균핵병을 야기시키는 S.sclerotiorum을 25℃에서 5일간 배양한 후 가로x세로 1 cm의 크기로 자른 S.
sclerotiorum를 500ml의 trypticsoy 액체배지에 접종하여 30℃,120rpm의 조건 에서 24h동안 배양하였다.그 후 S.sclerotiorum이 배양되어 있는 trypticsoy액 체배지에 선별된 균주를 접종해주어 같은 조건으로 2일 간 배양하였다.
(나)Competitionculture를 통해 분리한 물질을 이용한 항진균 활성 확인
Chloroform 추출법을 이용하여 획득한 #1,#2,#3에서의 항진균 활성을 확인하기 위 하여 5종의 식물병원성 진균들을 PDA 고체배지에 접종하여 25℃에서 3∼5일간 배양하였 다.식물병원성 진균의 균사체가 중심부로부터 0.5㎝정도 뻗어 나올 때 10mm paperdisc (Advantecco.,Japan)에 100㎕씩 접종하여 3∼5일 후 항진균 활성을 확인하였다.접종한 샘플은 competitionculture를 통해 획득한 제균된 상등액을 이용하여 chloroform 추출법으 로 분리한 #1,#2,#3을 사용하였다.
제 6절 항진균 확인 물질 분석 및 항진균 활성 확인
1.HPLC를 이용한 물질 분리 및 정제Competition culture을 통해 획득한 제균된 상등액을 이용하여 chloroform 추출 법으로 분리한 #1,#2,#3중 항진균 활성이 확인된 #1의 물질을 조사하기 위해 추출법으로 획득한 sample을 회전농축기를 사용하여 농축하였다.추출한 시료를 완 전히 증발시키고 최소량의 99 % MeOH로 녹여낸 후 0.20 ㎛ non-sterile hydrophilic syringe filter(MACHEREY-NAGEL,Germany)를 이용하여 여과하였 다.여과 후 최소량의 99% MeOH로 녹여낸 후 0.1% TFA(trifluoroaceticacid)을 함유한 50% acetonitrile에 녹여 0.2mm non-sterileSartorius에 여과하였다.여과 액은 C18 column(Waters µBondapak C18 3.9 × 300 mm)을 이용한 역상 (reversed-phase)HPLC를 사용하여 분리 정제하였다.0.1% TFA를 함유한 5%
acetonitrile에 0.1% TFA를 함유한 95% acetonitrile까지 1분당 1㎖씩 50분간 농 도 구배를 주어 흘려줌으로써 분리 정제하였다.정제 결과는 230nm에서 흡광도의 변화로 시료의 용출을 확인하였다.역상(reversed-phase)HPLC를 사용하여 확인된 peak별로 fraction을 받기 위해 preparativeHPLC (WatersDeltaPrep4000,USA) 를 이용하여 각 분획별로 물질을 모아 Centrifugalvaccum concentrator(Hanil, Korea)으로 건조시킨 후 최소량의 99 % MeOH로 녹여 10배 농축하였으며 이중 100㎕를 이용하여 항진균 활성을 확인하였다.
2.분획별 항진균 활성 확인
(가)획득한 분획별 항진균 활성 확인
PreparativeHPLC를 사용하여 물질 확인 후 각 분획별로 회수한 물질을 이용하여 항진 균 활성을 확인하였다.먼저 5종의 식물병원성 진균을 PDA 고체배지에 접종하여 25℃에서 3∼5일간 배양하였다.식물병원성 진균의 균사체가 중심부로부터 0.5㎝정도 뻗어 나올 때 10mm paperdisc(Advantecco.,Japan)에 100㎕씩 접종하여 3∼5일 후 항진균 활성을 확인하였다.접종한 샘플은 분획별로 확보한 샘플을 각각 Centrifugalvaccum concentrator (Hanil,Korea)으로 건조시킨 후 최소량의 99% MeOH로 녹여 10배 농축한 것을 사용하였다.
(나)확인된 물질로 부터의 진균 생장 저해 확인
PreparativeHPLC를 사용하여 획득한 분획으로 5종의 식물병원성 진균의 항진균 활성 확인 후 항진균 활성이 확인 된 물질을 이용하여 진균의 생장 저해 정도를 확인하였다.F.
oxysporum을 200ml의 potatodextrose액체배지에 접종하여 preparativeHPLC를 사용하 여 획득한 분획 중 활성이 있는 물질을 10배 농축하여 20㎕씩 넣어주어 1일간의 격차를 주어 5일동안 샘플을 채취하였다.준비된 샘플은 SEM을 이용하여 진균의 생장 저해 정도 를 관찰하였다.준비된 샘플의 SEM 촬영을 위한 전처리 방법은 다음과 같다.일정 시간을 주어 채취한 샘플을 에펜도르프 튜브 (eppendorftube)에 1.5ml채취하여 원심분리 하여 상등액을 제거하고 진균만 남은 튜브에 고정액 [ 2% GA (Glutaraldehyde) + 2% PA(Paraformaldehyde)in0.05M cacodylatebufferpH7.2]을 1ml넣어주어 실온에서 4시 간동안 고정한다.고정된 샘플은 원심분리기 (Hanil.,Supra22K,Korea)를 이용하여 15분 동안 0.4xg의 조건으로 샘플을 침전시키고 고정액의 상등액 부분을 제거한 후 샘플이 들 어있는 에펜도르프 튜브에 0.05M cacodylatebuffer로 20분 간격으로 3회 교환하여 세척하 였다.그 후 1% OsO4(in0.05M cacodylatebufferpH 7.2)로 실온에서 1시간 고정 후 0.05 M cacodylatebufferpH 7.2로 20분 간격으로 3회 세척하였다.고정액을 제거한 시료가 들 어있는 에펜도르프 튜브에 0.05M cacodylatebuffer로 20분 간격으로 3회 교환하여 세척하 였다.세척이 완료된 샘플을 30%,50%,70%,90%,95% ethylalcohol로 20분 간격으로 탈 수하였다.그 후 최종적으로 100% ethylalcohol로 20분 간격으로 2회 탈수하였다.탈수된 진균은 0.2um membranefilter에 시료를 필터링한 후 임계점 건조하였다.건조된 샘플은 gold coating 후 15kv의 가속전압 조건하에서 SEM [JEOL,JSM-7500F+EDS(Oxford), Japan]을 이용하여 1,500배의 배율로 진균의 생장 억제 정도를 관찰하였다.
3.항진균 활성 확인 물질 분석
선별된 균주의 항진균성 활성물질의 분석은 LC/MS(AB Sciex,API2000,USA) 으로 수행하였다.
제 3장 결과 및 고찰
제 1절 항진균 활성이 있는 균주 선별
전라남도 해남군 고구마 경작지에서 채취한 황토시료로부터 항진균 활성이 나타 나는 균주를 우선 분리하기 위해 TSA 배지에 연속희석법을 이용해 희석한 황토 샘플을 도말하여 30℃에서 2일간 배양하였다.배양 후 황토 샘플로부터 고체배지에 많은 균이 형성되었으며,고체배지에 식물 병원성 진균인 F.oxysporum를 접종하 여 25℃에서 5일간 배양하였다.즉,희석하여 도말한 황토 샘플에서 분리된 균과 식물 병원성 진균을 동시에 배양하는 방법을 이용하였다.1차적으로 F.oxysporum 에 대해 항진균 활성을 보이는 균주 14종을 우선적으로 분리하였으며 분리 된 14 종의 균주들을 No.1∼ 14으로 표시하였다.14종의 균주들을 이용하여 2차적으로 F.oxysporum 한 종의 식물병원성 진균만이 아닌 다수의 식물병원성 진균에서 항 진균 활성 여부 확인하기 위하여 농업유전자원정보센터 (KACC)에서 분양 받은 5 종 중 F.oxysporum을 제외한 식물병원성 진균 C.gloeosporioides,P.capsici,S.
sclerotiorum 그리고 B.cinerea를 이용하여 항진균 활성을 확인 하였다 (Fig.4). 그 결과 최종적으로 분리된 총 14종의 균주들 중 A)B.cinerea에서는 No.2,3,4 에서 항진균 활성이 확인되었으며 B)C.gloeosporioides에서는 No.1,2,3,4,7에 서 항진균 활성이 확인되었다.C)P.capsici과 D)S.sclerotiorum에서는 No.2에 서만 항진균 활성이 확인되었다.항진균 결과에 따라 No.2의 분리된 균주에서 5종 의 식물병원성 진균 모두에서 항진균 활성을 가지고 있는 있음을 확인하였으며 최 종적으로 하나의 균주를 선별하여 본 연구를 진행하였다.
Fig.3.Antifungalactivity of14bacterialisolates(grown on theupperand lowerPDA agarplates).A)B.cinerea,B)C.gloeosporioides,C)P.capsici,D)S.
sclerotiorum
제 2절 균주 동정
1.분자생물학적 특징(가)16S rRNA sequence분석
균주의 분류는 과거 Bergey'smanual을 기초로 한 형태학적,생화학적인 특징 을 이용하여 분류ㆍ동정하였지만 분류 속(genus)내 종(species)을 결정하기 위해서 최근에는 16S rRNA 유전자 염기서열분석 방법이 활발하게 이용되어지고 있다.선 별된 균주의 정확한 분류 동정을 하기 위해서 16S rRNA 유전자 상동성을 분석하 였다.선별된 균주 내의 16S rRNA 유전자의 보존 되어 지는 부위에 해당하는 primer{27F-16S Forward (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')와 1492R-16S Reverse (5'-GTTTACCTTGTTACGACTT-3')}를 제작하여 PCR (Polymerase Chain Reaction)을 수행한 결과 1,448 bp의 DNA 중합절편을 얻었다.이 결과를 SolgentCo.,Ltd.에 의뢰하여 16S rRNA sequence 결과를 얻을 수 있었다 (Fig.
4). 얻어진 유전자 염기서열은 NCBI (National Center for Biotechnology Information)에서 제공하는 BLAST program을 이용하여 유전자 상동성 검색을 실 시하였다.그 결과 선별된 균주는 Paenibacillus kribbensis AM49 균주의 16S rRNA와 99.52%의 유사성을 나타내었다.또한 염기 상동성 검사결과를 가지고 계 통유연성 분석 (Phylogenetic Tree Analysis)프로그램인 MEGA 5.1을 이용하여 phylogenetic tree로 나타내었다 (Fig. 5). 본 연구에서는 선별된 균주를 PaenibacilluskribbensisCU01이라 하고 연구를 진행하였다.
Fig.4.16SrRNA sequenceofP.kribbensisCU01isolate.
Fig.5.Phylogenetictreeconstructedbased on the16S rRNA sequencesof P.
kribbensis CU01 isolate and genetically related Paenibacillus strains (Genbank numbers given in parenthesis and Cohnella thermotolerans as selected out group).
2.생리·생화학적 특징
(가)선별된 균주의 동정 및 특징
선별 균주의 Gram 염색을 한 결과 선별균주는 gram variable였으며,주사전자현 미경을 이용하여 미세형태를 관찰한 결과 균체의 폭과 길이는 1.2x 5.0㎛의 막대 균이었다 (Fig.6).내생포자를 형성하였다.호기 또한 혐기조건에서도 생장이 가능 한 조건부혐기성이었다. Nitrite 또는 nitrogen gas를 생성하였으며, 단백질과 starch, casein을 분해할 수 있었다. 하지만 urea는 분해할 수 없었으며, cytochrome oxidase에는 활성이 없었다. Manual of methods for general bacteriology에 준하여,생화학적 특징을 통해 API50CH Kit로 동정하였다.탄수 화물은 단당류인 L-Arabinose,D-Cellobiose,D-Glucose,Lactose,D-mannose, Melibiose, D-Raffinose, L-Rhamnose, D-xylose, D-Trehalose, D-Mannitol, Maltose 그리고 Sucrose는 분해 가능하였지만,D-sorbitol,Adonitol은 분해 하지 못하였다 (Table5).이러한 각종 생리ㆍ생화학적 특징을 통한 결과 분리균주는 P.
kribbensisAM49의 특성과 비슷한 특성을 나타내었다.
Fig.6.TEM analysisofP.kribbensisCU01isolate.Symbol:A,Bar-1㎛.
Table5.BiochemicalcharacterizationofP.kribbensisCU01isolate. +,positive;-,negative
Characteristics Isolate P.kribbensis AM49[19]
Cellshape rod rod
Cellsize(㎛) 1.2x5.0 1.3-1.8x4.0-7.0 Oxygenrequirement facultativeanaerobic facultativeanaerobic Endosporestaining + +
Gram stain +/- +/-
Nitratereduction + + Gelatinhydrolysis + + Starchhydrolysis + +
Ureahydrolysis - -
Caseinhydrolysis + +
Oxidase - -
Solecarboneandenergysoures
L-Arabinose + +
D-Cellobiose + +
D-Glucose + +
Lactose + +
D-Mannose + +
Melibiose + +
D-Raffinose + +
D-Sorbitol - -
L-Rhamnose + +
D-Xylose + +
D-Trehalose + +
D-Mannitol + +
Adonitol - -
Maltose + +
Sucrose + +
제 3절 선별된 균주를 이용한 항진균 활성 확인
1.선별된 균주를 이용한 항진균 활성 확인선별된 균주의 순수배양을 통해 균 배양액 (균체)에서의 항진균 활성 여부를 확 인하였다.항진균 활성 확인 결과 선별된 균주는 분양 받은 5종의 균주인 B.
cinerea,C.gloeosporioides,P.capsici,F.oxysporum,S.sclerotiorum 모두에서 항진균 활성이 확인되었다 (Fig.7).
Fig.7.Antifungalactivity ofP.kribbensisCU01isolateagainstfivepathogenic fungi. A) B. cinerea B) C. gloeosporioides C) P. capsici D) F.
oxysporum E) S.sclerotiorum Symbol:C,control(fresh medium);B, culturebrothofP.kribbensisCU01.
제 4절 선별된 균주를 이용한 물질 분리 및 항진균 활성 확인
1.Pureculture를 통해 분리한 물질을 이용한 항진균 활성 확인
선별된 균주인 P.kribbensis CU01을 500 ml의 tryptic soy 액체배지에 30℃, 120rpm의 조건으로 2일간 배양하였다.배양 후 15분동안 15,462xg에서 원심분리 하여 상등액을 회수하였다.상등액을 여과한 후 제균된 상등액으로부터 항진균 물 질을 분리하기 위해 chloroform 추출법을 이용하였다.Chloroform으로 추출하여 middlelayer층을 회전 농축기를 이용하여 농축시켜 distilledwater3ml로 용해시 켜 주었다.Spindown하여 회수한 상등액을 #1,남아있는 침전물을 99% MeOH 3 ml로 용해시켜 같은 원심 분리 조건으로 spindown하여 회수한 상등액을 #2그리 고 down layer에 있는 chloroform을 회전 농축기로 휘발시켜 농축하였다.농축된 물질을 99 % MeOH 3 ml로 용해시켜 회수한 후 같은 원심 분리 조건으로 spindown하여 회수한 상등액을 #3라고 하였다 (Fig.3).
Chloroform 추출법으로 추출한 물질인 #1,#2,#3을 이용하여 항진균 활성 확인 을 하였다. 항진균 활성 확인 결과 선별된 균주를 이용하여 순수배양하여 chloroform 추출법으로 획득한 물질로 부터의 항진균 활성은 확인되지 않았다 (Fig.8).
Fig.8.Antifungalactivity ofpure culture P.kribbensis chloroform extracts. Symbol: Con, control (methanol); #1, middle layer supernatant of chloroform extract;#2,middle layerpelletofchloroform extractand #3, Down layer supernatant of chloroform extract; A) B.cinerea B) C.
gloeosporioidesC)P.capsici D)F.oxysporum E)S.sclerotiorum.
2.Competitionculture를 통해 분리한 물질을 이용한 항진균 활성 확인
선별된 균주인 P.kribbensisCU01을 이용한 순수 배양하여 추출된 물질을 이용 하여 항진균 확인 결과 순수 배양을 통해 추출된 물질에서는 항진균 활성이 확인 되지 않았다.본 실험에서는 순수 배양보다 더 많은 항진균 물질을 생산하기 위해 길항작용을 이용한 경쟁관계의 환경을 만들어주었다. 균핵병을 야기하는 S.
sclerotiorum을 먼저 24시간 배양한 다음 분리균주를 접종하여 48시간 competition culture한 후 15분동안 15,462xg에서 원심분리하였다.상등액을 여과한 후 여과액 으로부터 항진균 물질을 분리하기 위해 chloroform 추출법을 이용하였다.
Chloroform으로 추출하여 middle layer층을 회전 농축기를 이용하여 농축시켜
distilledwater3ml로 용해시켜 주었다.Spindown하여 회수한 상등액을 #1,남아 있는 침전물을 99% MeOH 3ml로 용해시켜 같은 원심 분리 조건으로 spindown 하여 회수한 상등액을 #2그리고 downlayer에 있는 chloroform을 회전 농축기로 휘발시켜 농축하였다.농축된 물질을 99% MeOH 3ml로 용해시켜 회수한 후 같 은 원심 분리 조건으로 spindown하여 회수한 상등액을 #3라고 하였다 (Fig.3). Chloroform 추출법으로 추출한 물질인 #1,#2,#3을 이용하여 항진균 활성 확인 을 하였다.항진균 활성 확인 결과 chloroform 추출법으로 획득한 물질인 #1에서 5종의 식물 병원성 진균인 B. cinerea, C. gloeosporioides, P. capsici, F.
oxysporum,S.sclerotiorum 모두에서 항진균 활성이 확인되었다 (Fig.9).
Fig.9.Antifungalactivity of P.kribbensis and S.sclerotiorum competition cultured chloroform extracts.Symbol:Con,control(methanol);#1,middle layer supernatant of chloroform extract; #2, middle layer pellet of chloroform extractand#3,Down layersupernatantofchloroform extract; A)B.cinerea,B)C.gloeosporioides,C)P.capsici,D)F.oxysporum,E) S.sclerotiorum.
