담석증과 아포지단백

(1)

대한소화기학회지 1999;33:384 - 394

1)

접수: 1998년 7월 8일, 승인: 1998년 8월 28일

연락처: 심찬섭, 140-743, 서울시 용산구 한남동 657번지 순천향대학병원 소화기연구소

Tel: (02) 709-9202, Fax: (02) 749-1968

서 론

콜레스테롤 담석은 서양에서 가장 흔한 담석이며 1,2 최근에는 우리 나라를 비롯한 동양에서도 점차적 으로 증가되고 있다.3 콜레스테롤 담석은 콜레스테

담석증과 아포지단백 E 유전형과의 관련성

순천향대학교 의과대학 내과학교실, 임상병리학교실*, 소화기연구소

문종호・이유경*・조영덕・홍수진・김연수・이문성・심찬섭

Ap o l i p o p r o t e i n E P o ly m o rp h i s m i n P a t i e n t s w i t h Ga ll s t o n e s

J on g Ho Moo n , M.D., Yo u Ky o u n g Le e , M.D.*, You n g D e o k Ch o , M.D., S u J i n Ho n g , M.D., Yu n S o o Ki m , M.D., Mo on S u n g Le e , M.D.

a n d Ch an S u p S h i m , M.D.

Departments of Internal Medicine and Clinical Pathology*, Institute for Digestive Research, Soon Chun Hyang University College of Medicine, Seoul, Korea

Background/Aims: Cholesterol gallstones which are the most common gallbladder stone found in

Western countries are recently increasing in Orient including Korea. The formation of cholesterol stone is frequently associated with changes in cholesterol and bile acid metabolism. Apolipoprotein (apo) E is a genetically polymorphic protein influencing lipoprotein metabolism. The aim of this study was to evaluate whether apo E polymorphism is related to the development of gallstone or bil duct stone. Methods: Apo E phenotype was determined in 132 patients with biliary stone (95 gallstones, 37 bile duct stones) and 49 controls without stone. We determined apo E phenotype by polymerase chain reaction and line probe assay with reverse hybridization principle using allele-speci fic oligonucleotide probe. Results: The E4/3 phenotype (21.0%) and 4 allelic frequency (0.15) were significantly higher in patients with gallbladder stones than in patients with bile duct stones and controls (p<0.05). The differences in apo E phenotype and 4 allelic frequency between the patients with bile duct stones and controls were not significant. Low-density lipoprotein (LDL) cholestero level of E4/3 phenotype was significantly higher than that of other phenotypes (p<0.05). Conclusions:

The apo E4 isoform of apo E may be associated with the development of gallstones. (Kor J

Gastroenterol 1999;33:384 - 394)

Key Words: Gallstone, Apolipoprotein E, Cholesterol

(2)

문종호 외 6인. 담석증과 아포지단백 E 유전형과의 관련성 385

롤과 담즙산의 대사 장애와 관련이 있으며,4 특히 담 즙내에 콜레스테롤이 과포화되어 있는 경우 이들의 결정화로 담석이 발생되기 쉽다.5 최근에 담낭 담석 뿐만 아니라 간내 담석에서도 콜레스테롤의 함유량 이 증가되고 있다는 보고들도 있어,6 콜레스테롤 담 석의 병태생리에 대한 많은 연구가 이루어지고 있으 며 특히 콜레스테롤 담석 형성 과정에서의 유전적 요소에 대한 관심도 증가되고 있다.7

아포지단백 E (Apolipoprotein E: 이하 apo E)는 지단백 대사에 영향을 주고 지질 대사, 지질 분해 효 소의 활성 작용과 신경 조직의 재생 등에 관여하며 유전학적으로 다형성을 보이는 단백이다.8 최근 보 고에 의하면 이 중 4 대립유전자의 존재는 혈중내 저밀도 지단백 콜레스테롤의 농도를 증가시키고,9 동맥의 죽상경화증으로 인한 심혈관질환의 발생률 을 높이며,10 Alzheimer 병 등의 위험 인자로 보고되 고 있다.11 4 대립유전자의 존재는 장으로부터 콜레 스테롤을 흡수하여 간으로의 지단백 섭취를 증가시 키고 이는 담도내로의 콜레스테롤 분비를 증가시켜 담즙내 콜레스테롤 농도가 과포화될 수 있다.12 이러 한 작용으로 4 대립유전자를 가진 사람은 유전학적 으로 콜레스테롤 함유량이 높은 담석의 발생이 증가 할 수 있고 이러한 환자에 있어서는 비수술적인 답 즙산을 통한 간접적인 담석용해법 등의 치료로 담석 증이 완치가 되어도 다시 담석이 재발될 가능성이 높을 것이라는 가정을 세울 수 있다.13 이에 저자는 담석증 환자에서 apo E 유전형을 분석하여 여러 위 치의 담석과의 관련성이 있는지에 대해 알아보고자 이 연구를 시행하였다.

대상 및 방법

1. 대 상

대상은 1996년 10월부터 98년 5월까지 순천향대 학병원 소화기내과에서 담석증으로 진단된 환자 중 연구가 가능하였던 132예(평균 연령 51.2세, 남:여

=58:74)로 하였다(Table 1). 대상의 담석 위치에 따 라 담낭 담석군 95예(48.4세, 남:여=42:53)와 담관 담 석군 37예(56.2세, 남:여=16:21)로 분류하였고 대조 군은 담석이 없는 49예(48.2세, 남:여=23:26)를 대상 으로 하였다. 담관 담석군은 다시 간외 담관 담석(12 예), 간내 담관 담석(12예), 간내외 담관 담석(13예) 으로 분류하였다.

2. 방 법

1) 검체 채취와 보관

모든 대상에서 채혈은 11시간 이상의 공복 후 오 전 중에 실시하였다. 아포지단백 E 유전형 검사를 위해서는 EDTA관에 12 mL 가량 채혈하였고, 혈중 지질의 측정을 위해서는 혈중 분리를 위한 젤이 들 어 있는 관에 4 mL를 채혈하였다.

2) 혈중지질의 측정

혈중지질의 측정은 채혈 직후에 자동화학분석기 인 Hitachi 747 (Hitachi Co., Japan)을 이용하여 측정 하였다. 혈중 총콜레스테롤은 cholesterol oxidase 효 소법으로, 중성지방은 glycerol phosphate oxidase 효 소법으로, HDL 콜레스테롤은 dextran sulfate-MgCl2 침전법으로 하였으며, LDL 콜레스테롤은 Friedwald 공식에 의하여 계산하였다.

Table 1. Characteristics of the Patients

GB stones Bile duct stones Controls Number

Age (yr)†

Sex (M/F)

95 48.4±12.3

42/53

37*

56.2±10.4 16/21

49 48.2±9.2

23/26

*, Extrahepatic duct (EHD) stones 12, Intrahepatic duct (IHD) stones 12, IHD and EHD stones 13; †, Dat expressed as mean±S.D.

(3)

386 The Korean Journal of Gastroenterology : Vol. 33, No. 3, 1999

3) a po E 유전형 분석

(1) DNA 분리(Extraction of DNA)

EDTA관에 채혈한 혈액은 원침한 후 buffy coat 층을 분리하여, pellet에 cold dextrose water를 가하 여 혼합한 후 1.8% NaCl 6 mL를 가하여 다시 혼합 하였다. 1500×g에서 10분간 원침하여 백혈구만을 침전시킨 후 상층을 버리는 과정을 침전시킨 pellet 에 적혈구의 혼입이 없을 때까지 반복 시행하였다.

DNA는 salting out법으로 추출하였는데 pellet에 2.5 mL의 lysis buffer를 가하여 pellet을 균일하게 하고 20%의 sodium dodecyl sulfate 100 L와 proteinase K (0.5 mg/mL) 1 mL를 혼합하여 55℃에서 3시간 동안 항온반응을 시킨 후 5 M NaCl 1 mL를 첨가하 고 15초간 강하게 흔들고 다시 1500×g에서 15분간 원침시켰다. 상층액을 새 시험관에 옮긴 후 두 배 부 피의 100% ethanol을 가하고 가볍게 시험관을 흔들 어 준 뒤 DNA의 침전이 생기는 것을 확인하였다.

이것을 취한 후 70% ethanol로 세척하고 TE buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA)를 넣어 녹여서 보관하 였다. TE buffer의 양은 대략 DNA 농도가 0.5 g/ L 이상이 될 수 있도록 하였고 4℃에서 충분히 녹인 후 정량하였다.

(2) 중합효소연쇄반응(PCR)

Apo E amplification kit (INNO-LiPA ApoE geno- typing test, Innogenetics, Belgium)를 사용하여 아포 지단백 E의 112번째 코돈과 158번째 코돈을 포함한 Apo E 유전자의 4번째 exon의 228 base pairs를 증 폭하였다. 증폭을 위한 혼합물은 10 L의 amplification buffer, 5' 말단에 biotin이 부착된 10 L의 apo E 시발자(primer) mix, 10 L의 MgCl2, 10 L의 glycerol, 5 L의 증류수, 1 unit의 Taq DNA polymerase (바이오니아, 한국)와 검체로부터 분리한 DNA 5 L를 넣어 총 50 L가 되도록 하였다. 자동 온도조절기(GeneAmp PCR system 9600, Perkin Elmer, USA)에서 다음과 같은 조건으로 증폭시켰는 데 즉, 95℃에서 5분간 DNA를 처리시킨 후 95℃에 서 30초간 변성(denaturation), 67℃에서 20초간 보합 (annealing), 72℃에서 20초간의 확장(extension)과정

을 30회 반복하였고 마지막 단계에서는 72℃에서 10 분간 유지시킨 후 정지시켰다. 이 과정을 통해 생긴 증폭된 PCR 산물(10 L)에 loading buffer (0.25%

bromphenol blue, 0.25% xylene cyanol, 15% Ficoll type 400 in H2O) 2 L를 잘 혼합하고 2% agarose gel에 100 V로 20분간 전기영동하였다. 전기영동 시 DNA size marker로는 123 bp DNA Ladder (Gibco BRL Product, MD, USA)를 사용하였다. 전기영동이 끝나면 ethidium bromide 10 L와 0.5 x TAE buffer 200 mL 혼합액에서 15분간 DNA 염색을 시행한 후, 자외선투시기(UV transilluminator)에서 228 bp의 형 광밴드 유무를 확인하였다(Fig. 1).

(3) 역보합 결합(Reverse hybridization)

INNO-LiPA apo E kit는 역보합 결합 원리를 이용 한 line probe assay로서 nitrocellulose strip에 특정 염기 서열을 갖는 oligonucleotide probe가 각 line에 결합되어 있고 여기에 증폭된 산물이 상보적으로 결 합한다. 증폭된 PCR 산물은 5＇ 말단에 biotin이 결 합되어 있으며 alkaline phosphatase가 표지된 strepta- vidin이 결합하였다. 여기에 chromogen (5-bromo-4- chloro-3-indolyl phosphate와 nitro blue tetrazolium chloride: NBT, BCIP)를 넣으면 검은 보라색 침전이 발생하였다. 증폭된 PCR 산물 10 L와 변성 용액 (alkaline solution containing EDTA) 10 L를 2분간 혼합 후 실온에서 5분간 방치하여 DNA를 변성시킨 후, 변성된 DNA 용액에 SSOP (sequence specific oligonucleo-tide probes)가 고정되어 있는 nitrocellulose strip을 담구어 45℃로 정확히 온도가 조절된 수평진탕기(Gemini twin shaking water bath, Robbins scientific Co., USA)에서 80 rpm으로 30분간 보합반 응을 시켰다.

(4) 세척과 발색반응(Color detection)

5' prime end에 biotin이 결합되어 있는 증폭산물 을 세척 용액(phosphate buffer containing NaCl, Tri- ton and 0.5% NaN2, H20에 5배 희석) 1 mL로 1분간 2번 이상 세척한 후, conjugate solution (streptavidin labeled with alkaline phosphatase in Tris buffer containing protein stabilizers and 0.1% NaN2, conju-

(4)

Moon et al. Apolipoprotein E Polymorphism in Patients with Gallstones 387

gate diluents로 100배 희석) 1 mL를 넣은 후 실온에 서 30분간 방치하였다. 다시 세척 용액으로 2회 세 척하고 substrate buffer (Tris buffer containing NaCl and MgCl2) 1 mL로 strip을 세척하였다. 여기에 alkaline phosphatase의 기질인 chromogen을 넣어 실온 에서 검은 보라색으로 발색시켰다. 발색이 끝난 strip 은 증류수로 세척하여 건조시킨 후 판독하였다.

(5) 판독(Interpretation)

판독지를 기준으로 하여 apo E의 각 유전형을 판 독하였다. 맨 위쪽 선은 판독지의 맨 위쪽 선과 맞추 는 표시선이고, 발색반응 과정의 양성 대조(conjugate control)는 바로 밑의 선으로, 이 선이 잘 보여야 발색반응 과정이 제대로 이루어졌다고 판단할 수 있 다. 1번에서 4번까지의 선에서 1번 probe는 112번 코돈이 arginine, 2번 probe는 112번 코돈이 cysteine, 3번 probe는 158번 코돈이 arginine, 4번 probe는 158 코돈이 cysteine임을 보여주었다. 표시선과 양성 대 조의 검은 보라색 band를 확인하고 표준 판독과 비 교, strip에서의 각 선의 양성 양상으로 유전형을 분 석할 수 있었다(Fig. 2).

4) 통계 처리

Statistical Analysis System (SAS) 프로그램을 이

용하였으며 집단간의 분포의 차이를 보기 위해서는 모수적인 방법으로 analysis of variance (ANOVA) test를 이용하였고 비모수적인 방법으로는 Kruskal- Wallis test를 이용하였다.

결 과

1. 대조군의 a po E 유전형의 분포와 대립유전 자의 상대 빈도

담석이 없는 대조군 49예의 apo E 유전형은 E3/2 가 6.1%, E3/3가 79.6%, E4/2가 6.1%, E4/3가 8.2%

이었고, E2/2와 E4/4 유전형은 보이지 않았으며 각 대립유전자의 상대 빈도는 2는 0.061, 3는 0.868, 4는 0.071로 E3/3 유전형 및 3 대립유전자의 빈도 가 가장 흔하였다.

2. 담낭 담석군의 a po E 유전형의 분포와 대립유전자의 상대 빈도

담낭 담석군 95예에서의 apo E 유전형은 E3/2가 5.3%, E3/3가 64.2%, E4/2가 9.5%, E4/3가 21.0%이 었고, E2/2와 E4/4 유전형은 검출되지 않았으며 각 대립유전자의 상대 빈도는 2는 0.07, 3는 0.78, 4 는 0.15로 대조군에 비해 E4/3 유전형 및 4 대립유 전자 빈도가 각각 유의하게 높았다(p<0.05)(Table 2).

Fig. 1. Detection of amplified product of PCR for apo E typing, showing a single band with a length of 228 bp. Lane M represents size marker (123 bp DNA ladder).

The samples were obtained from both patients with biliary stones (Lanes 1-8, 10, 11) and distilled water for control (Lane 9). Amplified products from samples were observed in lanes 1-8, 10, 11.

(5)

388 대한소화기학회지 : 제 33 권 제 3 호 1999

3. 담관 담석군의 a po E 유전형의 분포와 대립유전자의 상대 빈도

담관 담석군 37예에서의 apo E 유전형은 E3/2가 13.5%, E3/3가 70.3%, E4/2가 5.4%, E4/3가 10.8%이 었고, 각 대립유전자의 상대 빈도는 2는 0.09, 3는 0.83, 4는 0.08로 apo E 유전형 및 4 대립유전자 빈 도는 대조군과 의미 있는 차이가 없었다(Table 2).

4. 담관 담석의 위치에 따른 a po E 유전형의 분포와 대립유전자의 상대 빈도

담관 담석군 37예를 담석의 위치에 따라 간외 담 관 담석(12예), 간내 담관 담석(12예), 간내외 담관 담석(13예)으로 분류하여 담석의 담관내 위치에 따 른 유전형의 분포와 대립유전자의 상대 빈도를 비교 해 보면 간내 담관 담석군에서 E4/3가 16.7%로 대

Table 2. Apo E Phenotypes and Allele Frequencies in Patients with Gallstones

GB stone patients (n=95) Bile duct stone patients (n=37) Controls (n=49) Phenotype (%)

E3/2 E3/3 E4/2 E4/3

Allele (frequency) ε2

ε3 ε4

5.3 64.2 9.5 21.0*

0.07 0.78 0.15*

13.5 70.3 5.4 10.8 0.09 0.83 0.08

6.1 79.6 6.1 8.2 0.061 0.868 0.071

*, p<0.05 vs control.

Fig. 2. Examples of results with INNO-LiPA Apo E strips. A black marker line is drawn on the top of the strip for orientation. The conjugate control line (conj. contr.) provides an internal control for the color development reaction. A combination of two, three, or four positive probes allows the differentiation of the six apo E genotypes (E2/2, E3/3, E4/4, E3/2, E4/3 or E4/2).

(6)

조군에 비해 높은 경향을 보여주었으나 4 대립유전 자의 빈도는 0.08로 대조군과 차이가 없었으며 간외 담관이나 간내외 담관 담석군에서는 유전형의 분포 와 대립유전자의 상대 빈도 모두 대조군과 차이가 없었다(Table 3).

5. A po E 유전형에 따른 혈중 지질의 농도 대조군 및 담석군 모두를 대상으로 apo E 유전형 에 따라 분류하여 혈중 총콜레스테롤, 중성지방, HDL 콜레스테롤, LDL 콜레스테롤 등 혈중 지질 농 도의 차이를 보면 각 유전형간에 혈중 지질 농도에 영향을 줄 수 있는 인자들의 차이는 없었으며 E3/2 유전형을 보이는 경우 다른 유전형에 비해 혈중 콜 레스테롤과 LDL 콜레스테롤치는 낮은 경향을 보였 고 E4/3 유전형을 보이는 경우에는 LDL 콜레스테롤 치가 다른 유전형에 비하여 의미 있게 높았다(p<

0.05). 중성지방과 HDL 콜레스테롤 농도는 각 유전

형간에 차이가 없었다(Table 4).

고 찰

담석은 발생하는 위치에 따라 담낭 담석과 담관 담석으로 나눌 수 있으며 일반적으로는 담낭 담석은 그 구성 성분으로 콜레스테롤 담석의 비율이 높고 담관 담석은 색소성 담석의 비율이 높다.14 콜레스테 롤 담석의 생성 기전에 대해서는 완전히 밝혀지지 않았지만 담즙내 콜레스테롤의 과포화나 담즙산 합 성의 저하가 주된 기전으로, 여기에 핵형성 인자와 항핵형성 인자의 상호 작용, 담낭 자체의 역할 등이 복합적으로 연관되어 있으며 특히 담즙내 콜레스테 롤의 과포화가 중요하게 작용한다.5,15 콜레스테롤 담 석의 생성 기전 중 콜레스테롤의 생성을 증가시키는 위험 인자로는 비만, 고칼로리 또는 고지방식, 고지 단백혈증, 약물과 인종 또는 유전적 소인 등이 있 Table 3. Apo E Phenotype and Allele Frequencies in Patients with Bile Duct Stones-According to Sites of Stones

EHD (n=12) IHD (n=12) IHD+EHD (n=13) Controls (n=49) Phenotype (%)

E3/2 E3/3 E4/2 E4/3

Allele (frequency) ε2

ε3 ε4

16.7 66.7 8.3 8.3 0.13 0.79 0.08

16.7 66.7 0 16.7 0.08 0.84 0.08

7.7 76.9 7.7 7.7 0.08 0.84 0.08

6.1 79.6 6.1 8.2 0.061 0.868 0.071 EHD, extrahepatic duct; IHD, intrahepatic duct.

Table 4. The Plasma Lipid Levels according to Apo E Phenotypes

E3/2 E3/3 E4/2 E4/3

Total cholesterol Triglyceride HDL cholesterol LDL cholesterol

190±26 165±95 43±13 101±26

192±31 142±75 38±9 113±27

198±42 138±31 37±12 109±40

203±38 172±86 39±7 124±45*

HDL, high-density lipoprotein; LDL, low-density lipoprotein; Data expressed as mean±S.D. (mg/dL); * P<0.05 vs other phenotypes.

(7)

다.16 아포지단백 E (apo E)는 지질 대사, 지질 분해 효소의 활성 작용, 신경 조직의 재생 등에 관여하며 유전학적으로 다형성을 보이는 단백으로 특히 콜레 스테롤의 대사와 동맥의 죽상경화에 중요한 역할을 한다. 이들은 19번 염색체 장완의 단일 유전자좌인 아포지단백 CI과 CII에 위치한 2, 3, 4 등 3가지 대립유전자의 산물이며 299개의 아미노산 중 112, 158번째 아미노산의 치환으로 전체 apo E의 99%를 차지하는 E2, E3, E4의 3가지 주요 isoform으로 구 별되는데 E3는 112번째의 아미노산이 cysteine 이고 158번째 아미노산은 arginine이나 E4는 양쪽이 arginine 이고 E2는 양쪽 모두 cysteine이다.17 사람에 서는 주로 이들의 조합으로 이루어진 6개의 유전형 과 그에 따른 6개의 표현형 즉, E4/4, E3/3, E2/2, E4/3, E3/2, E4/2를 보인다.18,19 이들의 저밀도지단백 (LDL) 수용체와의 친화력의 차이로 혈중 지질에 각 기 다른 영향을 주는데 그 빈도는 인종간에 많은 차 이를 보이나 3가 가장 흔한 것으로 되어 있고 백인 에서 각 대립유전자의 상대 빈도는 3가 0.7 (wild type), 4는 0.15, 2는 0.08로 보고되고 있다.20 일반 적으로 E4의 빈도는 남부 유럽이나 아시아 지역은 약 8-12% 정도이고 북부 유럽이나 미국에서는 13-22%로 보고되고 있는데 이와 같이 E4 빈도가 높 은 지역은 관상동맥질환의 빈도 및 사망률도 높 다.9,20,21 Apo E는 주로 간에서 생성되며 triglyceride rich lipoprotein과 간의 LDL 및 chylomicron remnant 등 LDL군 수용체 사이의 ligand 역할을 하는데 E4 가 존재 시에는 E2보다 지단백에 대한 친화력이 훨 씬 높다.22 즉, 4 대립유전자의 존재는 동형접합체 (homozygote)이든 이형접합체(heterozygote)이든 2, 3보다 장으로부터 콜레스테롤의 흡수를 증가시키 고 간으로의 지단백 섭취도 증가시킨다.23 장에서 흡 수된 콜레스테롤은 chylomicron remnants에 의해 간 으로 이동되는데23 최근의 보고에 의하면 apo E는 cholesteryl ester 가수분해를 증강시켜 세포내 콜레 스테롤 반응 과정(processing)에 영향을 주어 세포내 에 자유형의 콜레스테롤이 증가한다고 한다.24 Apo E의 다양성에 따라 세포내 콜레스테롤 대사에도 영 향을 미쳐 간 또는 담즙의 콜레스테롤 농도도 E2에 서 E4로 갈수록 증가되어 있다고 한다.13 다른 보고

에 의하면 E4/3나 E4/4 표현형을 가진 사람은 장에 서의 콜레스테롤 흡수를 높게 증가시키나 콜레스테 롤의 신생 합성(de novo cholesterol synthesis)에는 거의 영향을 주지 않고25 간내 담즙산의 합성을 감소 시킨다고 한다.26 이는 담도내로 콜레스테롤 분비를 증가시키는 작용을 하여 담즙내 콜레스테롤 농도가 과포화될 수 있다. 담즙내의 과포화된 콜레스테롤은 담석의 생성에 필요한 과정으로 사람에서 담석이 생 기기 쉬운 담즙의 가장 흔한 원인이며27 또한 콜레스 테롤 결정들의 침전은 담석의 생성에 또 다른 중요 한 인자가 된다.28 이러한 작용으로 4 대립유전자를 가진 사람은 콜레스테롤 함유량이 높은 담석의 발생 이 증가할 수 있고 담석을 제거하더라도 다시 담석 이 재발할 가능성이 높다는 가정을 할 수 있다. 본 연구에서 아포지단백 E와 관련된 지질 대사와 담석 발생과의 관련성을 좀 더 명확히 알아보기 위해서는 담석 및 담즙의 성분 분석이 병행되어야 하지만 일 반적으로 담낭 담석은 콜레스테롤 담석이, 담관 담 석은 색소성 담석의 비율이 높으므로 임상적으로 바 로 확인할 수 있는 담석의 위치에 따라 apo E 유전 형을 분석해 본 결과 비교적 콜레스테롤 함량이 높 은 담낭 담석 환자군에서 E4/3 유전형과 4 대립유 전자의 빈도가 담관 담석 환자군보다 유의하게 높아 위와 같은 가정을 뒷받침할 수 있었으며 추후 많은 환자를 대상으로 시행될 필요가 있다고 생각한다.

다른 보고에 의하면 담낭 담석 환자의 수술 시 얻은 담즙에서 콜레스테롤 결정이 보이는 군에서는 보이 지 않는 군보다 apo E4의 빈도가 높았으며 담석내의 콜레스테롤 양도 apo E2나 E3군보다 apo E4군에서 높았고 apo E4군에서는 apo E2나 E3군보다 평균 핵 형성화 시간(median nucleation time)이 짧았다고 한 다.29 또 다른 보고에서도 E4/3 유전형이 담낭 담석 환자에서 많이 관찰되었으며 4 대립유전자의 빈도 도 의미 있게 높았고 이러한 빈도는 나이가 증가함 에 따라 증가되었으며 담즙내 지방과 담석내 콜레스 테롤 양도 apo E2, apo E3, apo E4군의 순으로 증가 되어 있어 사람에서 apo E4의 존재는 담낭 담석의 발생에 유전적 위험 요소가 될 수 있다고 하였다.13 이러한 소견은 apo E4의 존재는 담즙 콜레스테롤의 결정화를 유발하고 이들의 담석으로의 축적이 담석

(8)

Moon et al. Apolipoprotein E Polymorphism in Patients with Gallstones 391

의 생성과 관련이 있다고 볼 수 있어 apo E4의 존재 는 담석의 형성을 증가시키는 역할을 한다고 볼 수 있다.

이웃하는 일본에서는 콜레스테롤 담낭 담석의 비 율이 높고 간내 담석의 비율은 4-7% 정도인데30 최 근에는 대도시를 중심으로 콜레스테롤로 구성된 간 내 담석이 보고되면서31 간내에서도 콜레스테롤 함 량이 50% 이상으로 높은 담석이 일차적으로 생길 수 있는 가능성이 제기되고 있다.32 또 간내 및 간외 담관 담석의 구성 성분을 비교하여 간내 담석 환자 는 간외 담석 환자에 비해 총담즙산의 양이 적었고 총담즙산의 양에 비해 세균에 의해 생길 수 있는 비 포합형 유리 담즙산과 이차성 담즙산, 케톤형 담즙 산 등의 비율이 유의하게 낮았음을 보고하였고 담낭 외 담석이라도 간내 담석에 있어서는 세균 감염이 간외 담관 담석에 비해 덜 중요한 역할을 한다고 제 시하였다.33 최근 들어 우리 나라에서도 콜레스테롤 이 주성분인 담낭 담석이 증가하고 있으며3 담낭 담 석뿐만 아니라 간내 담석에서도 콜레스테롤의 함유 량이 증가한다는 보고가 있다.34,35 이러한 관점에서 도 본 연구를 시행하여 간내 담석군에서 콜레스테롤 대사에 영향을 미치는 4 대립유전자의 빈도가 대조 군과 차이가 있는지를 보았으나 유의한 차이를 보이 지는 않았다. 결국 이상의 관찰에서 보면 담석은 그 형성되는 부위에 따라 구성 성분이 영향을 받고 담 석의 생성 기전도 다를 수 있다는 것을 암시하며 담 석의 생성 기전을 어느 하나로는 설명할 수 없고 여 러 가지 다른 인자들이 상호 작용하여 담석을 형성 한다고 생각된다.

담낭 담석의 일차적 치료는 증상이 있는 경우 수 술이 원칙이나 콜레스테롤 담석인 경우에는 경구적 으로 약제를 투입하여 간접적으로 용해요법을 시행 하거나 직접 담석에 접촉성 용해제를 이용하여 담석 의 용해를 시도해 볼 수 있다.36 그러나 콜레스테롤 담석이라도 대상의 apo E 유전형이 4 대립유전자 를 가지고 있다면 담석의 용해를 시도하여도 다시 재발될 가능성이 높을 수 있다. 또한 서양에서는 선 택된 담낭 담석 환자에서 체외충격파쇄석술(extracorporeal shock-wave lithotripsy: ESWL)과 담즙산제 제를 통한 간접적 담석 용해의 병합요법이 효과적인

치료로 쓰이고 있다.37 그러나 담즙산제제를 이용한 담석용해법의 가장 큰 단점 중 하나는 성공적인 첫 치료 후 재발의 위험이 있다는 것인데 1년 재발률이 약 15%, 5년 재발률이 절반 이상인 것으로 되어 있 고 처음에 다발성인 경우가 담석이 한 개인 경우보 다 재발률이 높다.38 한 보고에 의하면 경구 담즙산 용해요법을 시행한 환자를 5년간 추적하였더니 약 반수에서 다시 재발하였고 그 이후에는 재발률이 매 우 낮았다.39 Apo E4는 담즙내 콜레스테롤 과포화를 유발하므로 이러한 치료 후의 담석 재발에도 관여를 한다고 볼 수 있다. 84명의 방사선 투과성 담낭 담석 환자에게 ESWL과 담즙산제제의 병합요법을 시행 하여 담석 제거율과 재발률에 미치는 영향 인자를 연구한 결과 담석 제거율과 재발률에 미치는 독립 인자 중 apo E4가 중요한 인자 중 하나라는 주장도 있다. 즉 apo E4군에서는 담석의 제거가 빨리 되었 고 또한 재발되는 경우도 높았으며 담석이 재발한 군은 비재발군에 비해 apo E4가 높게 발현되었다.

결국 apo E4 유전형은 ESWL후 재발의 고위험 인자 로 볼 수 있다고 하였다. 이것은 또한 다른 측면에서 콜레스테롤 담석의 형성에 유전적인 요소가 영향을 줄 수 있다는 가능성을 시사한다. 그러나 담즙내로 의 콜레스테롤 분비 증가 작용 및 담석의 결정화 등 이 담석 생성에 미치는 영향의 정도와 이에 대한 기 전 및 apo E4 유전형과의 관련성 등에 대해서는 아 직 많은 연구가 필요할 것으로 생각된다.

요 약

목적: 최근에 담낭 담석뿐만 아니라 간내 담관 담 석에서도 콜레스테롤의 함유량이 증가된다는 보고 가 있다. 아포지단백 E (Apolipoprotein E)는 지질 대 사 등에 관여하며 E2, E3, E4의 3가지 주요 isoform 으로 구별되고 단일 유전자좌에 위치한 2, 3, 4 등 3가지 대립유전자의 산물이다. 이 중 4 유전자 를 가진 사람은 장으로부터 콜레스테롤의 흡수를 증 가시켜 담즙내 콜레스테롤 농도가 과포화될 수 있어 콜레스테롤 함유량이 높은 담석의 발생이 증가할 수 있다. 이에 저자들은 담석증 환자에서 apo E 유전형 분석을 통해 그 연관성을 알아보고자 하였다. 대상

(9)

392 대한소화기학회지 : 제 33 권 제 3 호 1999

및 방법: 담석증으로 진단된 환자 132예를 대상으로 담낭 담석군 95예와 담관 담석군 37예(간외 담관 담 석 12, 간내 담관 담석 12, 간내외 담관 담석 13)로 분류하였고 대조군은 담석이 없는 49예를 대상으로 하였다. Apo E 유전형 분석은 혈액에서 genomic DNA를 분리하여 PCR을 시행하고 역보합결합의 원 리를 이용하여 생성된 band를 분석하여 판독하였다.

결과: 대조군의 apo E 유전형은 E3/2가 6.1%, E3/3 가 79.6%, E4/2가 6.1%, E4/3가 8.2%이었고, 각 대 립유전자의 상대 빈도는 2는 0.061, 3는 0.868, 4 는 0.071이었다. 담낭 담석군에서는 apo E 유전형 중 E4/3가 21.0%이었고 4 대립유전자의 상대 빈도 가 0.15로 대조군에 비해 E4/3 및 4 대립유전자 빈 도가 모두 유의하게 높았다(p<0.05). 이에 비해 담관 담석군에서의 4 대립유전자 빈도는 대조군과 차이 가 없었다. E4/3 유전형은 다른 형에 비해 혈중 LDL 콜레스테롤 농도가 유의하게 높았다(p< 0.05). 결론:

담낭 담석 환자에서 대조군에 비해 4 대립유전자의 빈도가 높았으며 담관 담석 환자에서는 차이가 없어 담낭 담석의 생성에 4 대립유전자도 관여하는 것으 로 보이나 추후 담석 및 담즙의 성분 분석 등과 병행 하여 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각한다.

색인단어: 아포지단백 E, 담낭 담석, 콜레스테롤, 담석증

참 고 문 헌

1. Trotman BW, Ostrow JD, Soloway RD. Pigment vs cholesterol cholelithiasis: comparison of stone type and bile composition. Am J Dig Dis 1974;19:585 589.

2. Sutor DJ, Wooley SE. A statistical survey of the composition of gallstones in eight countries. Gu 1971;12:55-64.

3. 문영명. 한국인 담석증의 현황. 대한소화기병학회지 1987;19:1-5.

4. Sedaghat A, Grundy SM. Cholesterol crystals and the formation of cholesterol gallstones. N Engl J Med 1980;302:1274-1277.

5. Admirand WH, Small DM. The physicochemical basis of cholesterol gallstone formation in man. J Clin Invest 1968;47:1043-52.

6. Yamashita N, Yanagisawa J, Nakayama F. Com position of intrahepatic calculi-etiological signifi cance. Dig Dis Sci 1988;33:449-453.

7. Gilat T, Feldman C, Halpern Z, Dan M, Bar-Meir S An increased familial frequency of gallstones. Gas troenterology 1983;84:242-246.

8. Walden CC, Hegele RA. Apolipoprotein E in hyperlipidemia. Ann Intern Med 1994;120:1026- 1036.

9. Gerdes LU, Klausen IC, Sihm I, Faergeman O Apolipoprotein E polymorphism in Danish popula tion compared to findings in 45 other study popula tions around the world. Genet Epidemiol 1992;9 155-167.

10. Tiret L, de Knijff P, Menzel H, Ehnholm C, Nicaud V, Havekes LM. Apo E polymorphism and pre disposition to coronary heart disease in youths o different European populations. Arterioscler Thromb 1994;14:1617-1624.

11. Poirier J, Davignon J, Bouthillier D, Kogan S Bertrand P, Gauthier S. Apolipoprotein E polymor phism and Alzheimer' s disease. Lancet 1993;342:

697-699.

12. Juvonen T, Kervinen K, Kairaluoma MI, Lajunen LHJ, Kesäniemi YA. Gallstone cholesterol content is related to apolipoprotein E polymorphism. Gas troenterology 1993;104:1806-1813.

13. Bertomeu A, Ros E, Zambon D, et al. Apolipopro tein E polymorphisim and gallstones. Gastroentero logy 1996;111:1603-1610.

14. Tabata M, Nakayama F. Bacteria and gallstones etiologic significance. Dig Dis Sci 1981;26:218-224 15. Wolpers C, Hofmann AF. Solitary versus multiple

cholesterol gallbladder stones. Mechanisms of for mation and growth. Clin Invest 1993;71:423-434.

16. Thijs C, Knipschild P, Brombacher P. Serum lipid and gallstones: a case-control study. Gastroentero logy 1990;99:843-849.

17. Zannis VI, Breslow JL. Human very low density

(10)

lipoprotein apolipoprotein E isoprotein polymor phism is explained by genetic variation and post translational modification. Biochemistry 1981;20:

1033-1041.

18. Zannis VI, Breslow JL, Utermann G, Mahley RW Weisgraber KH, Havel RJ. Proposed nomenclature of apo E isoproteins, apo E genotypes, and pheno types. J Lipid Res 1982;23:911-914.

19. Zannis VI, Just PW, Breslow JL. Human apolipo protein E isoprotein subclasses are genetically deter mined. Am J Hum Genet 1981;33:11-24.

20. Davignon J, Gregg RE, Sing CF. Apolipoprotein E polymorphism and atherosclerosis. Arteriosclerosis 1988;8:1-21.

21. James RW, Boemi M, Giansanti R, Fumelli P Pometta D. Underexpression of the apolipoprotein E4 isoform in an Italian population. Arterioscler Thromb 1993;13:1456-1459.

22. Mahley RW. Apolipoprotein E: cholesterol transport protein with expanding role in cell biology. Science 1988;240:622-630.

23. Weintraub MS, Eisenberg S, Breslow JL. Dietary fa clearance in normal subjects is regulated by genetic variation in apolipoprotein E. J Clin Invest 1987 80:1571-1577.

24. Schwiegelshohn B, Presley JF, Gorecki M, et al Effects of apoprotein E on intracellular metabolism of model triglyceride-rich particles are distinct from effects on cell particle uptake. J Biol Chem 1995 270:1761-1769.

25. Kesäniemi YA, Ehnholm C, Miettinen TA. Intestina cholesterol absorption efficiency in man is related to apoprotein E phenotype. J Clin Invest 1987;80 578-581.

26. Angelin B, Holmqvist L, Leijd B, Einarsson K. Bile acid metabolism in familial dysbetalipoproteinemia:

studies in subjects with the apolipoprotein E2/2 phenotype. Eur J Clin Invest 1990;20:143-149.

27. Cooper AD. Metabolic basis of cholesterol gallstone disease. Gastroenterol Clin North Am 1991;20:21- 46.

28. Holan KR. Holzbach RT, Hermann RE, Cooperman

AM, Claffey WJ. Nucleation time: a key factor in the pathogenesis of cholesterol gallstone disease Gastroenterology 1979;77:611-617.

29. Juvonen T, Kervinen K, Kairaluoma MI, Lajunen LH, Kesäniemi YA. Gallstone cholesterol content is related to apolipoprotein E polymorphism. Gastroen terology 1993;104:1806-1813.

30. Nakayama F, Furusawa T, Kakama T. Hepatoli thiasis in Japan: present status. Am J Surg 1980 140:216-220.

31. Saito K, Nakanuma Y, Otha T. Morphological study of cholesterol hepatolithiasis. J Clin Gastroenterol 1990;12:585-590.

32. Shoda J, He B-F, Tanaka N, Matsuzaki Y, Yama mori S, Osuga T. Primary dual defect of cholestero and bile acid metabolism in liver of patients with intrahepatic calculi. Gastroenterology 1995;108:1534- 1546.

33. Shoda J, Tanaka N, Matsuzaki Y. Microanalysis o bile acid composition in intrahepatic calculi, and its etiological significance. Gastroenterology 1991;101:

821-830.

34. 서경석, 노우철, 최재운, 박용현. Cholesterol 함량에 따른 간내 담석의 monooctanoin에 의한 in-vitro 용해 대한소화기병학회지 1990;22:918-923.

35. 김명환, 최호순, 이성구 등. 한국인의 원발성 간내 담 석의 성분은 변하고 있는가? 대한소화기학회지 1996;

28:85-91.

36. Allen MJ, Borody TJ, Thistle JL, May GR, La Russo NF. Cholelithiasis using methyl tertiary buty ether. Gastroenterology 1985;88:122-125.

37. Sackmann M, Delius M, Sauerbruch T, et al. Shock wave lithotripsy of gallbladder stones. the first 175 patients. N Engl J Med 1988;318:393-397.

38. Hood KA, Gleeson D, Ruppin DC, Dowling RH British-Belgian Gall Stone Study Group. Gallstone recurrence and its prevention: the British/Belgian gallstone study group' s post-dissolution trial. Gut 1993;34:1277-1288.

39. Villanova N, Bazzoli F, Taroni F, et al. Gallstone recurrence after successful oral bile acid treatment: a 12 year follow-up study and evaluation of long term

(11)

postdissolution treatment. Gastroenterology 1989;97:

726-731.

40. Portincasa P, Erpecum KJ, Meeberg PC, Dallinga- Thie GM, Bruin TWA, Berge-Henegouwen GP

Apolipoprotein E4 genotype and gallbladder motility influence speed of gallstone clearance and risk o recurrence after extracorporeal shock-wave litho tripsy. Hepatology 1996;24:580-587.