방사수용체 측정법에 의한 아세틸콜런 수용체 항체 (Ach R Ab) 의 측정 실험

(1)

대한임상병리사회지

:

제 23권 1호

1991

방사수용체 측정법에 의한 아세틸콜런 수용체 항체 (Ach R Ab) 의 측정 실험

서울대학교병원 핵의학파

류만길·김현주·서일택

Key words : Acethylcholine receptor antibody in the myasthenia gravis

1 .

서 론

아세틸콜런 수용체는

coline

작동성 신경섬유의 전달물질인 아세틸콜런에 대한 신경근 접합부의 수 용체 로 중증근무력 증

(myasthenia gravis)

에 서 는 이 수용체에 대한 자가항체인 아세틸콜런 수용체 항체

(acetylcholine receptor antibody : Ach R Ab)

가

생산되어 수용체 단백과의 사이에 항원항체 결합체 를 형성하기 때문에 신경흥분의 전달장애 탈력증상 을 가져 오는 것 으로 알려 져 있 어 Ach-R-Ab의 측정 은 중증근무력증의 진단에 중요하다. 아세틸콜런 수 용체 항체검사는 후천적 중증근무력증 확진에 있어 가장 널리 쓰이는 면역학적 검사이다. 신경근육의 전달에 이상이 생기면 두개골의 자극을 받은 다른 근육의 그룹뿐만 아니라 얼굴이나 입술， 혀， 목， 목 구명과 같은 근육에 영향을 줄 수 있다. 정상적인 근 육의 수축에서는 신경의 말단부분의 끝에서 분비되 고 근육의 끝 표면에 있는 아세틸콜런 수용체 위치 에 결합한다. 그러나 중증근무력증 환자에서는 항체 가 아세틸콜런 수용체 위치를 막거나 파괴시켜 전신 의 근육을 약화시키거나 눈의 근육을 약화시킨다.

검 사방법 은

binding

계 측과

blocking

계 측이 었 다

.

근무력증 증후가 있는 환자에서 아세털콜런

binding

계측이 음성이었다면 이 환자는 다시 아세틸콜런

blocking

계측올 실시하는 것이 좋다. 여기서

blocking

계 측은 검 체 를 alfa-bungarotoxin이 표지 된 방사성동위원소를 넣기 전에 정제된 아세틸콜런 과 반응시켜 항원의 위치를 막는 항체를 검출해 낸 다.

II.

실험 재료 및 방법

1.

대상검체

서울대학교 병원에 근무 중인 건강한 직원 17명과 신경정신파에 근무력증 환자로 진단받고 치료를 계 속하고 있는 환자 20명을 대상으로 하여 아세털콜런 수용체 항체를 측정하였다.

2.

측정방법

영 국의 RSR사에 서 제 조 공급하는 방사수용체 측 정 키트로 다음과 같이 측정하였다.

1)

원리

측정원리는 방사수용체 측정법의 기본원리인 표 지수용체가 비표지수용체 항체의 비율에 의하여 경 합적으로 수용체 단백질에 결합하는 방법으로 결합 한 후에 유리형을 세척하여 버리고 남는 결합형만을 계측하여 알고 있는 표준곡선에 의해 미지의 검체값 을 찾는 방법으로 다음과 같다.

* AchR + AchRAb •

* AchR, AchRAb + anti-human IgG ---,

* AchR, AchRAb, Anti-human IgG

~

2)

시약

@

방사성동위원소가 표지된 아세틸콜런 수용체

(2)

@

음성대조혈청

@

양성대조혈청

@ Anti-human IgG

@

정상인 혈청 (높은 검체 희석용)

@세척 용액

@

표지수용체 복원 완충액

3)

기구， 기기

@

미 량 피 렛 (5， 10， 50， 100， 1000μ 1)

@

원심분리기

(1500g)

@흡입기

@혼합기

@

감마선계측기

4)

조작방법

@

깨끗한 검체혈청을 5-10μl씩 시험관에 넣는 다.

@

방사성동위원소가 표지된 아세틸콜런 수용체 를 100μl씩 넣고 잘 혼합한 다음 실온에서 2시간 반 응시킨다.

@ Anti-human

IgG를 50μl씩 넣 고

2-8

⁰

C

에 서

2

시간 반응시킨다.

@

세척용액을 1ml씩 넣고 잘 혼합 후 2-8⁰C 에서 20분 동안 1500g로 원섬분러한다.

@

조심스럽게 상층액을 흡입한다.

@

세척액을 1ml썩 넣고 반복하여 흔들지 말고 원 섬분리한다.

@

감마선계측기에서 침전물의 방사선량을 계측 한다.

5)

계산방법

측정 결과는

nmole/liter toxin

bound로 나타내 며 계산식은 다음과 같다.

(검체 cpm- 음성

cpm)

X 붕괴인자 (A) 검체의 량×비방사능×계측기 효율×초당 계수율

nmole/l

예) 검체 계측값

: 1500cpm

음성 계 측값

100cpm

붕피 인자

: 1. 2

(제조 후 2주) 검체량

:

10μl

초당 계수율

: 2.22

계측기 효율

: 70%

비 방사능

: 216 C i/ mmole ( 1500 -100) X 1.2 1680 10 X 216 X 0 . 7 X 2.22 3356

= O. 500nmole/l

III .

실험성적

1)

정상장

다음은 정상인과 근무력증 환자에서의

AchRAb

의 수치를 비교하기 위해 다음과 같이 실험해 보았 다.

정상인 17명을 대상으로 AchRAb를 측정한 결과 표 1파 같은 결파를 얻었으며 16명이 정상범위인

O. 000 - 0 . 040nmole/l

안에 들어있고 1명이 정상범위 를 벗어난 0.08nmole/l의 결파를 나타냈다.

표

1.

정 상인

AchRAb

측정 값 (단위

: nmole/ 1) No. AchRAb No. AchRAb No. AchRAb

0.000 7 0.000 13 0.000 2 0.080 8 0.013 14 0.034 3 0.021 9 0.001 15 0.000 4 0.000 10 0.021 16 0.001 5 0.000 11 0.004 17 0.000 6 0.002 12 0.001

2)

근무혁중 환자의 값

근무력증 환자 20명을 대상으로 AchRAb를 측정 한 결과 20명 모두 정상범위를 벗어난

o . 053 - 3 . 921

까지 높은 수치를 보임을 알 수 있었으며 결파는 다 음 표 2와 같다.

표

2.

근무력 증 환자

AchRAb

(단위

: nmole/ l) No. AchRAb No. AchRAb No. AchRAb

1 0.364 8 0.087 15 2.809 2 0.651 9 2.521 16 3.278 3 1.265 10 3.710 17 0.345 4 0.574 11 3.912 18 1. 442 5 0.356 12 0.053 19 2.842 6 3.921 13 0.550 20 1.645 7 0.526 14 0.632

정상인파 중증근무력증 환자의 결과는 그림 1과 같이 나타났다.

(nmole/ l)

(3)

3)

정도판리

@

실험내 정밀도

정밀도 측정을 위해서 낮은 값과 중간 값， 높은 값 의 세 개의 정도관리혈청을 만들어 같은 실험에서 측정한 결과는 낮은 값에서 평균이

o . 12nmole/l.

표 준펀차가

0.019nmole/l ,

변이계수가 15.4% 였고，

중간 값은 평 균이

1.58nmole/l ,

표준펀차가

0.12 nmole/l ,

변이계수가 7.6% 였으며， 높은 값은 평균 이

4.88nmole/l ,

표준편차가

o .28nmole/l.

변이계 수가 5.9% 의 결과를 보였고 값은 다음 표 3과 같다

@

실험간 정밀도

실험일자간 정밀도를 알아보기 위해 3종류의 대조 혈청을 같은 키트로 감죄지수가 일주마다 변하는 정 도와 측정간 정밀도률 알아보았다.

결파는 양성대조혈청에서 평균값이

2.76nmole/l.

표준현차가

o . 14nmole/l ,

낮은 값에서의 펑균값은

o . 12nmole/l ,

표준편차가 가

o . 02nmole/l ,

변이계수가 16% 였다. 또한 중간 값에서의 평균값은 1.53nmole/l이고 표준펀차가

O. 22nmole/l ,

변이 계 수가

14%

이 고 높은 값에 서 평 균 값이 4.97nmole/l이고 표준편차가

o .53nmole/l.

변

표

4.

아세틸콜런 수용체 항체 정밀도 측정

이계수가 11% 를 나타냈으며 측정결과는 표 4와 같 다

표

3.

실험내 정밀도 측정결파 (단위

: nmole/ l)

검체번호 낮τ 。: 님A 중간값 ^{iiII; 1}^。:r ⁷^HA1-

0.13 1. 78 5.14

2 0.14 1. 72 5.37

3 0.09 1. 65 4.25

4 0.15 1. 44 4.72

5 0.14 1. 53 4.96

6 0.13 1. 62 4.85

7 0.12 1. 49 5.01

8 0.13 1. 72 5.03

9 0.09 1. 50 4.81

10 0.11 1. 42 4.68

평 균

0.12 1. 58 4.88

표준펀차

0.019 0.12 0.28

변이계수

15.4% 7.6% 5.9%

」

검사일자 음성 대조혈청 양성 대조혈청 낮은 대조혈청 중간 대조혈청 높은 대조혈청 (지수)

cpm

지수

cpm

지수

cpm

지수

cpm

지수

cpm

지수

1. 2 152 0.00 5206 2.79 403 0.14 3400 1. 80 9520 5.16

(8.6) 146 5190 2.78 387 0.09 3157 1. 67 9991 5.48

1. 3 227 0.00 4935 2.81 418 0.12 4274 1. 70 9762 5.78 (8.13) 212

1. 4 197 0.00 4002 2.45 371 0.11 1968 1. 12 6284 3.91

(8.20) 197

1. 5 217 0.00 4310 2.82 398 0.12 2393 1. 50 7487 5.01

(8.27)

1. 6 93 0.00 4078 2.92 323 0.16 2018 1. 41 6705 4.85

(9.3) 111 6514 4.71

평 균

2.76 0.12 1. 53 4.97

표준펀차

0.14 0.02 0.22 0.53

변이계수

5.0% 16% 14% 11%

*

^비^방사능

^: 140Ci/mmole

계측효율

: 70%

제조일자

:

제조부터 1주 1-2주 2-3주 3-4주 4-5주 5-6주 6-7주 7-8주 감죄지수:

1. 0 1. 1 1. 2 1. 3 1. 4 1. 5 1. 6 1. 75

(4)

4)

셰척희수에 의한 철과

세척 횟수가 측정 결과에 어떻게 영향을 미치는지 를 알아보기 위하여. 10⁷>> 의 검체를 각각 3등분하여 3개 의 그룹으로 나누고 1그룹은 1회 2그룹은 2회

3

그룹은 3회 세척하여 AchRAb를 측정하여 보았다.

세척효과는 2회 세척에서 안정된 값을 얻었고. 1회 세척은 불안정하고. 3회 세척은 너무 낮은 결과를 얻었으며， 결과는 표 5와 같다.

표

5.

셰척회수에 의한 결과의 변화 시험 (단위

: nmole/ l}

켜口 체 1회 세척 2회 세척 3회 세척

1 1.005 0.883 0.767

2 0.644 0.585 0.499

3 0.402 0.364 0.323

4 0.191 0.167 0.125

5 1.326 1.265 1.108

6 0.710 0.651 0.503

7 1.241 1.166 0.985

8 0.010 0.000 0.015

9 0.659 0.574 0.486

10 0.331 0.034 0.004

i쟁 균

0.652 0.568 0.481

5)

회씩 찍션성 시협

높은 수치를 보이는 검체 3개를 골라 희석시험을 해보았다.

혈청 내의 농도가

1.0nmole

이하인 검체 1파 2에 서는 거의 칙선상을 보임을 알 수 있고.

2.0nmole

이상인 3은 희석배수가 거의 맞지 않음올 알 수 있 었으며， 결과는 표

6

그립 2와 같다.

표

6. AchRAb

희석시험

(

단위

: nmole/D

희석비 검체

1

^검체

2

^검체

3 1 1.005 1.645 2.842

1/2 0.585 0.946 2.853

1/4 0.304 0.474 2.745

1/8 0.167 0.233 2.452

1/16 0.129 1.767

1/32 1.099

1. 5 (nmole/ l)

1. 0

0.5 1/2 1

그림

2. AchRAb

희석시험

IV.

고안 및 고찮

중증근무력 증

(myasthenia gravis)

에 서 는 자가항 체 인 아세 틸 콜련 수용체 항체

(acetylcholine recep- tor antibody : Ach R Ab)

를 측정 하므로서 정 확한 진단과 치료경파 판찰에 결정적인 지표가 되고 있 다. 이의 측정법으로 쉽고 간펀하게 측정할 수 있는 방사수용체 측정법이 개밸된어 이것을 사용하여 록 정하였다.

정밀도 측정을 위해서 낮은 값과 중간 값 높은 값 의 세 개의 정도관리혈청올 만들어 같은 젤험에서 측정한 결파는 낮은 값에서 평균이

O. 12nmole/l.

표 준펀차가

O.019nmole/l.

중간 값은 평균이

1.58nmole/l.

표준펀차가

0.12 nmole/l.

변이계수가 7.6% 였으며 높은 값은 평균 이

4 .88nmole/l.

표준펀차가

O. 28nmole/l ,

변 이 계 수가 5.9% 의 결과률 보였다.

실험일자간의 정밀도 측정올 위해서 낮은 값과 중 간 값 높은 값의 세 개의 정도관리혈청율 만률어 같 은 실험에서 측정한 결과는 낮은 값에서 평균이

o . 12nmole/l.

표준펀차가

o . 020nmole/l.

변이계수 가 16.0% 였고， 중간 값은 평균이

1.53nmole/l.

표 준펀차가

o . 22nmole/l.

변이 계 수가

14%

였으며

,

높

(5)

i?:-

~.g. ~ifo1

4.97nmole/l,

.H.;I-~~}7}

0.53 nmole/1, lt! 01

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4.

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Assay Report of Acetylcholine Receptor Antibody by Radioreceptorassay

Ryu, M.K., Kim, H.J., Seo, I.T.

Dept. of Nuclear Medicine, Seoul National University Hospital Seoul, Korea

ABSTRACT

Assay of acetylcholine receptor antibody by radioreceptorassay is

n~essory

test to diagnostic of mysthe11ia gravis.

1. In the normal serum samples of 17 display 0.

000-0. 040nmol/l.

2. In the myastheniagravis patient serum samp- les display 0. 053- 3. 921nmol/l.

3. Dilution test is almost a straight line less than 1. OOnmol.

4. Washing test is stabilized to wash 2nd. in result.

5. By testing for both binding and blocking AchR antibodies, a positive result is found in about 90% of patients with generalized MG and in about 80% of those with ocular MG.