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(1)자원환경지질, 제43권, 제2호, 109-121, 2010 Econ. Environ. Geol., 43(2), 109-121, 2010. 42℃에서 토착호산성박테리아의 황철석 표면에 대한 선택적 부착과 용출 특성 박천영1*·김순오2·김봉주1 1. 조선대학교 에너지자원공학과, 2경상대학교 지구환경과학과. The Characteristic of Selective Attachment and Bioleaching for Pyrite Using Indigenous Acidophilic Bacteria at 42oC Cheon-Young Park1*, Soon-Oh Kim2 and Bong-Ju Kim1 1. Department of Energy and Resource Engineering, Chosun University Department of Earth and Enviromental Sciences and Research Institute of Natural Science, Gyeongsang National University. 2. The bioleaching experiment under 42oC was effectively carried out to leach the more valuable element ions from the pyrite in the Gangyang mine waste. Bacteria can survive at this temperature, as indigenous acidophilic bacteria were collected in the Hatchobaru acidic hot spring, in Japan. To enhance the bacterial activity, yeast extract was added to the pyrite-leaching medium. The indigenous acidophilic bacteria appeared to be rod-shaped in the growthmedium which contained elemental sulfur and yeast extract. The rod-shaped bacteria (0.7×2.6 µm, 0.6×7 µm, 0.8×5 µm and 0.7×8.4 µm) were attached to the pyrite surface. The colonies of the rod-shaped bacteria were selectively attached to the surroundings of a hexagonal cavity and the inner wall of the hexagonal cavity, which developed on a pyrite surface. Filament-shaped bacteria ranging from 4.92 µm to 10.0 µm in length were subsequently attached to the surrounding cracks and inner wall of the cracks on the pyrite surface. In the XRD analysis, the intensity of (111), (311), (222) and (320) plane on the bacteria pyrite sample relatively decreased in plane on the control pyrite sample, whereas the intensity of (200), (210) and (211) increased in these samples. The microbiological leaching content of Fe ions was found to be 3.4 times higher than that of the chemical leaching content. As for the Zn, microbiological leaching content, it was 2 times higher than the chemical leaching content. The results of XRD analysis for the bioleaching of pyrite indicated that the indigenous acidophilic bacteria are selectively attacked on the pyrite specific plane. It is expected that the more valuable element ions can be leached out from the mine waste, if the temperature is increased in future bioleaching experiments. Key words : indegenous acidophilic bacteria, pyrite, bioleaching, selective attachment 광양 광산 폐석더미에 많은 양으로 방치되어 있는 황철석으로부터 유용금속을 보다 효과적으로 용출시켜내기 위해 서 42oC에서 미생물 용출실험을 실시하였다. 42oC의 미생물 용출 실험에서 생존할 수 있는 토착 호산성박테리아를 일 본 하쵸바루 산성 온천수에서 채취하였고, 박테리아의 용출능력을 향상시켜 주기 위하여 황철석-용출 배양액에 yeast extract를 첨가하였다. 원소황과 yeast extract가 포함된 성장-배양액에서 성장한 토착박테리아들은 막대 모양으로 나 타났다. 크기가 약 0.7×2.6 µm, 0.6×7 µm, 0.8×5 µm 및 0.7×8.4 µm인 박테리아들이 황철석 표면에 부착하였다. 막대 모양의 박테리아들은 황철석 표면에 발달한 육각형 공동 주변과 공동 안쪽 벽면에 집중적으로 군집을 형성하여 부착 하였다. 길이가 약 4.92 µm에서 약 10.0 µm인 filament-shaped 박테리아들이 황철석 표면의 크랙 주변과 크랙 안쪽 벽면에 부착하였다. 황철석에 대한 XRD분석에서, 박테리아에 반응시킨 시료가 비교시료에 비하여 상대적으로 (111), (311), (222) 및 (320) 결정면들의 강도는 감소하였고, (200), (210) 및 (211)의 결정면들의 강도는 증가하였다. Fe 이 온은 미생물학적 용출량이 화학적 용출량에 비하여 3.4배 이상 높게 용출되었고, Zn 이온은 화학적 용출량보다 미생 물학적 용출량이 2배 이상 높게 용출되었다. 토착호산성박테리아가 황철석의 특정 표면을 선택적으로 공격하는 것을. *Corresponding author: [email protected]. 109.

(2) 110. 박천영·김순오·김봉주. SEM 및 XRD분석에서 확인하였다. 앞으로 보다 더 높은 온도로 미생물 용출실험을 실시한다면 보다 많은 유용금속 이온이 용출될 것으로 기대된다. 주요어 : 토착호산성박테리아, 황철석, 생물학적 용출, 선택적 부착. 1. 서. 론. 생물학적 용출(bacterial leaching)은 불용성의 황화 광물에 포함되어 있는 유용금속을 미생물체를 이용하 여 용해성 이온으로 변환시키는 과정이다. 황화광물에 포함되어 있는 유용금속을 용해성 이온으로 변환시키 기 위해서는 미생물체가 황화광물을 산화시켜야 한다. 이때 황화광물이 산화될 때 발생하는 에너지를 미생물 체가 활용한다. 물론 미생물체가 황화광물로부터 발생 하는 에너지를 활용하는 과정에서 황화광물을 산화시 키게 되고, 동시에 황화광물과 결합되어 있던 금속이 산화작용과 함께 용액 속으로 방출된다. 따라서 용액 속에 방출된 금속이온을 회수하는 것이 생물학적 용출 이다. 황화광물이 산화되면서 발생하는 에너지와 대기 중 의 CO2로부터 탄소를 그리고 배양액에 포함된 영양분 을 활용하여 생존하는 미생물체를 화학자가무기영양체 (chemoautolithotrophic microbe)라 한다. 이때 유기물의 탄소를 이용하는 미생물체를 종속영양체(heterotrophic bacteria)라 한다. 대기 중의 CO2를 활용하는 화학자가 무기영양체들은 성장 속도가 너무 느리지만 유기물에 포함된 탄소를 활용하는 종속영양체는 성장 속도가 매 우 빠르다. 미생물체에 의하여 황화광물이 산화되는 방법은 직접 접촉산화방법(direct contact oxidation method)과 간 접접촉산화방법(indirect contact oxidation method)이 연구되어 왔다(Sand et al., 2001). 직접접촉산화방법은 미생물체가 황화광물 표면에 직접 접촉하여 효소물질 을 분비하여 산화시키는 방법이다. 간접접촉산화방법은 ferric iron과 같은 산화제가 황화광물을 산화시켜서 Fe2+와 S를 유리시키고 이때 미생물체가 Fe2+와 S를 활용하는 과정이다. Schippers와 Sand(1999)는 미생물 체가 황화광물로부터 직접접촉으로 S를 활용하는 과정 을 thiosulfate mechanism과 polysulfide mechanism으로 구분하였다, 황화광물의 S로부터 생성된 S2 O32- 를 박테 리아가 활용하여 SnO62- 을 생성하고 다시 박테리아가 활용하여 최종적으로 SO42- 를 생성하는 과정 그리고 황화광물로부터 형성된 H2 S+를 박테리아가 활용하여 H2 Sn를 생성하고 이를 다시 박테리아가 활용하여 최종. 적인 SO42- 을 형성하는 것으로 해석하였다(Sand et al., 2001; Rohwerder et al., 2003). 그러나 직접접촉산화 방법과 간접접촉산화방법을 완전하게 규명되지 못하고 또한 이들 방법을 명확히 구분하여 설명하기 어렵다. Silverman과 Ehrlich(1964)는 박테리아에 의하여 황 화광물이 산화작용이 일어날 때 결정화가 잘 이루어진 것 보다 결함(imperfection)이 있는 황화광물이 더 잘 일어난다는 것을 발견하였다. 그리고 미생물체는 에너 지를 쉽게 얻을 수 있는 황화광물 표면을 선택하여 물 리적으로 직접 접촉하여 부착하게 된다는 가설을 처음 으로 Silverman(1967)이 제안하였다. 이는 미생물체가 산화작용이 잘 일어나는 황화광물 표면을 선택하여 물 리적으로 접촉하여 산화작용을 촉진시킨다는 직접접촉 산화방법인 메카니즘으로 발전하였다. 따라서 황화광물 이 산화되면서 발생하는 에너지를 미생물체가 활용할 때, 에너지를 쉽게 얻을 수 있는 장소를 미생물체들이 선택한다는 연구들이 이루어져 왔다(Murr and Berry, 1976; Shrihari et al., 1991; Ohmura et al., 1993). 그리고 미생물체가 에너지를 쉽게 얻을 수 있는 장소 는 황화광물 표면이 기계적 혹은 화학적으로 약하게 결정화가 이루어진 전위선(dislocation), 부식장소(pits) 및 표면단층(surface fault) 등이라는 것이 규명되었다 (Berry and Murr, 1978; Bennett and Tributsch, 1978; Edwards et al., 2001). 따라서 위와 같은 장소 에 미생물체가 물리적으로 직접 접촉하게 되면 일정한 부착 pattern이 나타나게 되었다(Edwards et al., 2000; Sanhueza et al., 1999; Dziurla et al., 1998). 한국에 서 호산성박테리아가 황화광물 표면의 특정 장소를 선 택하여 군집을 형성하여 부착한다는 연구는 Park et al.(2009)이 제시했을 뿐이다. 한편, 황화광물로부터 금속이온을 효율적으로 용출 시 킬 수 있고, 고 농도의 중금속 이온에도 저항력이 있는 박테리아가 산성 온천수의 고 온도에서 생존하는 것을 발견하였다(Brock et al., 1972; Weiss, 1973; Brierley and Murr, 1973). 이들 고온성 박테리아의 변 종인 TH1, TH2, TH3 및 ALV 등(Marsh and Norris, 1983; Norris and Parrott, 1986; Norris et al., 1986) 을 황화광물에 접종한 결과 유용금속 용출이 뛰어나고 중금속에도 내성이 있음이 밝혀졌다. 40oC 이상의 높.

(3) 42℃에서 토착호산성박테리아의 황철석 표면에 대한 선택적 부착과 용출 특성. 은 온도로 황화광물에 박테리아를 접종하여 미생물학 적 용출을 수행하면 높은 온도로 인하여 수용액의 점 성이 감소되어 이온 확산율이 증가되고 황화광물의 용 해도가 증가되어 용출 효율이 증가된다. 10oC 온도가 증가되면 황화광물의 용해는 대략 2배로 증가된다. 높 은 온도로 황화광물을 산화시키면 황화광물 표면에 2 차 생성물이 덜 생성된다. 또한 높은 온도에서 고온성 박테리아를 배양하기 때문에 전염성 박테리아가 살수 없는 환경이 조성된다(Norris and Barr, 1985; Norris et al., 1986; Brierley and Murr, 1973). Park et al.(2009)에 의하여 화순 광산배수에 서식했던 토착박 테리아를 32oC의 황철석에 접종한 결과 Fe 및 Zn 이 온이 비교시료에 비하여 박테리아 시료에서 각각 1.3 배와 1.4배로 용출되었다. 따라서 광산폐석에 많은 양 으로 포함되어 있는 황철석으로부터 Fe 및 Zn과 같은 유용금속 이온을 좀 더 많이 용출시켜내기 위하여 높 은 온도의 산성 온천수에 생존했던 토착고온성박테리 아를 이용하게 되었다. 본 연구에서는 일본 토착호산성박테리아를 yeast extract가 포함된 성장-배양액에서 42oC로 성장시켜 종 속영양체의 특성을 조사하였고, yeast extract가 포함 된 황철석-용출 배양액에서 토착박테리아들이 황철석 표면의 특정 장소를 선택적으로 군집을 형성하여 부착 하는 특성, 42oC의 황철석으로부터 용출되는 Fe와 Zn 이온 함량 그리고 2차 생성물에 대하여 고찰하고자 하 였다.. 2. 시료채취 및 분석방법 2.1. 토착호산성박테리아 토착호산성 박테리아는 일본, 하쵸바루 지열발전소 부근의 산성 온천수에서 채취하였고 한국의 실험실에 서 배양하였다. 한국의 실험실로 운반된 온천수의 pH 는 3.03이고 Eh는 406 mV이였다. 실험실로 운반된 산 성 온천수 10 ml를 미리 준비된 ATCC125 배양액(이하 성장-배양액) 150 ml에 접종시키고 42oC 배양기(HB201SFO)로 성장시켰다. 2.2. 성장-배양액 조성 성장-배양액(150 ml)은 무기성분과 에너지 원으로 구 성하였다. 성장-배양액(125 Thiobacillus medium)의 무기성분은 (NH4)2SO4 0.2 g/L, MgSO4·7H2O 0.5 g/L, CaCl2 0.25 g/L, KH2PO4 3.0 g/ 및 FeSO4 5.0 mg/L을 증류수 1.0 L에 용해시켜 제조하였다. 에너지 원으로 황. 111. 분말 1.0 g/L과 yeast extract 0.03g/L(0.02%, w/v)을 무기성분에 첨가하였다. 성장-배양액에서 28일 동안 배양된 토착호산성박테 리아는 황철석 입자가 들어 있는 배양액(이하 황철석용출 배양액)에 옮겼다. 2.3. 황철석-용출 배양액 황철석-용출 배양액(150 ml)의 조성은 성장-배양액에 사용하였던 무기성분 구성 비율과 동일하게 하였고 원 소 황 대신 황철석 입자(20 mesh=0.85 mm) 1.5 g을 에너지원으로 사용하였으며, 0.03 g/L(0.02%,w/v) yeast extract를 첨가하였다. 대조시료(control sample)도 황철 석-용출 배양액(150 ml)에 사용하였던 무기성분 구성 비 율과 동일하게 하였고 황철석 입자(20 mesh=0.85 mm) 1.5 g/L과 0.03 g/L(0.02%, w/v) yeast extract을 첨가 하였다. 토착박테리아가 포함된 황철석-용출 배양액과 대조시료를 42oC 배양기(HB-201SFO)에 각각 반응시 켰다. 성장-배양액, 황철석-용출 배양액, 500 ml 삼각플 라스크, 실리스토퍼, 황철석 입자 및 스파쿨라 등은 멸 균기(SW-90AV100)에서 121oC에서 1기압으로 15분간 멸균하여 사용하였다. 황철석 입자는 증류수가 들어 있 는 초음파세척기(ultrasonic, Power Sonic 510)에서 15분간 3번 세척하고 멸균기에서 멸균하였다. 2.4. 황철석 입자 황철석은 전남 광양읍 본정광산 폐석더미에서 채취 하였다. 황철석은 죠 크랴샤에서 파쇄한 후 체분석을 실시하였다. -20 mesh의 황철석 입자를 황철석-용출 배 양액에 사용하였다. 2.5. 분석 토착박테리아에 의해서 황철석으로부터 용출되는 금 속 이온함량을 측정하기 위하여 황철석-용출 배양액과 대조시료에서 시간별로 배양액을 10 ml 씩 채취하였다. 채취된 10 ml 배양액은 pH와 Eh를 측정하고 0.45 µm 여과지로 여과하였다. 여과 된 황철석-용출 배양액에 진한 질산을 가해 산 처리를 실시하였다. 산 처리된 황철석-용출 배양액은 ICP-AES(Perkin-Elmer, Optima 5300 DV)로 Fe와 Zn 이온 농도를 측정하였다. 성장-배 양액과 황철석-용출 배양액에서 일어나는 pH 및 Eh 변 화를 알아보기 위하여 pH 메타(Eijelkam, 18.28, multiparameter analyser, Beigium)로 pH와 Eh를 반응시간 별로 측정하였다. 황철석 표면에 부착된 토착호산성 박 테리아들의 특성을 알아보기 위하여 황철석-용출 배양.

(4) 112. 박천영·김순오·김봉주. 액에서 황철석 입자를 채취하였다. 채취된 황철석 입 자에 2.5%의 글루타르알데히드(glutaraldehyde)를 첨가 하고 75%, 85%, 95% 및 100%의 에틸 알콜로 탈수시 켰다. 탈수된 황철석 입자는 양면 테이프에 고정한 후 gold 및 Pt 코팅하여 SEM(Japan, Hitachi, S4800)분 석을 실시하였다. 황철석-용출 배양액에 넣기 전의 황 철석 입자를 연마편으로 제작하여 편광현미경(Leitz, OTHPLANPOL)에서 감정하였고 EPMA(EPMA-1600, Shinadzwand Genesis XM2 EDX(EDAX)분석으로 황철석 표면을 정량분석 하였다. 용출 실험에 사용 전 의 황철석, 용출 실험에 사용한 비교시료의 황철석 그 리고 박테리아에 반응시킨 황철석 시료를 미분쇄하여 XRD(Rigaku, Geigerflex D/max rA)분석과 IR(Thermo 기기, Nicolet 6700)분석을 실시하였다. XRD분석 조건은 Cu-Kα 선을 이용하여 가속전압 40 kV, 전류 30 mA, 주사속도 2o/min.으로 3o~70o의 2θ 구간을 분석하였다. IR분석은 자연 건조된 황철석 시료를 KBr 분말과 혼합 후 압축하여 디스크를 만들어 4,000 cm-1~400 cm-1의 파장을 분석하였으며, 해상도는 4 cm-1이고 주사수는 32이였다.. 3. 결과 및 고찰 3.1. 성장-배양액의 pH 및 Eh 변화와 토착박테리아 의 크기 변화 Yeast extract(0.02%)와 원소 황이 포함된 성장-배양 액에 토착박테리아를 42oC로 성장시켰다.. Fig. 1. SEM images of indigenous acidophilic bacteria in growth-medium. after 12 days(A, pH=2.65) and 18 days(B, pH=2.27) of growth with supplement yeast extract(0.02%) at 42oC. Scale bar is 5.0 µm.. 성장-배양액에서 성장한 토착호산성박테리아의 모양을 SEM으로 관찰한 결과 막대모양으로 나타냈다(Fig. 1). 성장-배양액에서 12일 동안 성장한 토착박테리아들은 막대모양으로 나타나며 크기는 약 0.7×2.6 µm에서 0.6×7 µm 범위이지만 주로 0.7×2.6 µm 크기의 박테리 아들이 우세하게 많았다(Fig. 1A). 18일 동안 성장한 박테리아들은 크기가 약 0.8×5 µm에서 0.7×8.4 µm 범 위인 박테리아들이 관찰되었고 주로 0.8×5 µm 크기의 박테리아들이 우세하게 나타났다. 토착호산성 박테리아가 yeast extract가 포함된 성장 -배양액에서 성장함에 따라 변화하는 pH와 Eh 변화를 나타냈다. 토착박테리아를 성장-배양액에 접종 후 3시간 (Fig. 2에서 0 시간(일))에 측정한 pH는 3.53이였고 Eh 는 351 mV이였다. 토착박테리아가 성장함에 따라 성장 -배양액의 pH는 감소하고 Eh는 증가하였다. 30일이 경과 한 후 성장-배양액의 pH는 1.88이였고 Eh는 465 mV 로 나타났다. 이와 같이 토착박테리아가 성장함에 따. Fig. 2. The variation of pH and Eh vs. time in the growthmedium with containing elemental sulfur and yeast extract at 42oC(bacteria)( ● ; pH, ○ ; Eh).. 라 성장-배양액의 pH가 감소하고 Eh가 증가한 원인은 성장-배양액에 첨가된 S와 yeast extract가 활용되었음 을 지시해주고 있다. 성장-배양액에서 토착박테리아가 배양됨에 따라 성 장-배양액의 pH가 감소하고 Eh가 증가한 원인은 에너.

(5) 42℃에서 토착호산성박테리아의 황철석 표면에 대한 선택적 부착과 용출 특성. 113. 지원으로 첨가한 원소 황이 (1)식과 (2)식과 같이 생물 학적으로 산화되었기 때문이다. S0+1.5O2+H2O→bacteria reaction→SO42-+2H+ (1) 2S0+3O2+H2O→bacteria reaction→2H2SO4. (2). 또한 원소 황이 토착박테리아에 의해 산화되어 sulfite (SO3, S4+), thiosulfate(S2O3, S2+), 혹은 tetrathionate (S4O6, S2.5+)와 같은 황의 중간산물이 형성되고, 중간 산물의 황은 또 토착박테리아에 의해 산화되어 (3)식과 같이 최종 산물인 H2SO4을 생성하였기 때문으로 생각 한다(Leduc and Ferroni, 1994; Das and Mishra, 1996). 이때 원소 황은 (4)식과 같이 중간 산물이 만들 어지고 최종적으로 황산염이 형성된다. S0+O2+H2O→bacteria reaction→H2SO3+0.5O2→ bacteria reaction→H2SO4 (3) S0+S2O32-→S4O62-→SO32-→SO42-(4) 실제로 원소 황 분말을 150 ml 성장-배양액에 첨가 했을 때, 배양액 표면에 부유되어 있던 황 분말이 5일 후부터 부분적으로 침전되기 시작하다가 배양 13일 후 에는 완전히 배양액 바닥에 침전되었다. 박테리아가 배 양됨에 따라 성장-배양액의 Eh가 증가한 것은 에너지 원으로 첨가한 황이 (5)식과 같이 전자공여체로 작용 하여 전자를 발생하여 전자수용체인 산소로 이동되기 때문이다. S0+4H2O→SO42-+8H++6e-. (5). 이 반응에서 ∆GR0=+48.998 kcal 이므로 E0= +0.354 V 이다. 0.05916 Eh(V) = 0.354 + -------------------log[ SO ][ H ] 6 2–. +. 8. 에 의하여 성장-배양액의 pH와 Eh가 변화하는 것을 Fig. 3의 비교시료에서 확인되었다. 즉 성장-배양액에 첨가된 원소 황이 Fig. 2에서와 같이 토착박테리아에 의하여 pH가 감소되기도 하지만 Fig. 3에서와 같이 무 기적 산화작용에 의해서도 pH 감소되었다. 따라서 성 장-배양액에 박테리아의 에너지원으로 첨가하는 원소 황은 미생물학적 산화작용과 무기적 산화작용이 동시 에 일어난 것을 확인하였다. 대기 중의 CO2를 활용하는 화학자가무기영양체인 호 산성박테리아를 생물학적 용출 실험에 yeast extract를 첨가하면 황화광물에 대한 용출효과가 뛰어난 것으로 알려져 있다(Brock et al., 1972; Weiss, 1973; Mehta and Murr, 1982). Norris와 Barr(1985)에 의하면 토착 -호산성박테리아의 변종 BC1, ALV, LM2 및 TH3에 여러 가지 첨가물(yeast extract, tetrathionate와 yeast extract, glucose, glucose와 yeast extract, without supplements)을 첨가하여 성장시킨 결과 100 mg/l의 yeast extract에서 가장 성장률이 뛰어났음을 확인하였 다. Brierley와 Brierley(1973)는 yeast extract와 S를 혼합하여 미생물체를 성장시킨 결과 산도 생성량(acid production)이 증진된 것을 확인하였다.. 4. 배양용액에서 [SO42-]=10-1 mol/l이 생성되었다면 Eh=0.344-0.0789pH. Fig. 3. The variation of pH and Eh vs. time in the ATCC medium with supplement elemental sulfur at 42oC(control) ( ● ; pH, ○ ; Eh).. (6). 토착박테리아에 의하여 배양용액의 원소 황이 산화 되어 (5)식과 같이 수소이온 함량이 증가되면 (6)식의 pH 항이 감소되고 그리고 동시에 황산염이 생성되어 함량이 증가하게 되면 (6)식의 Eh 값이 증가하게 된다 (Faure, 1991; Langmuir, 1997). 성장-배양액에서 첨가된 원소 황이 무기적 산화작용. 3.2. 부유성 토착박테리아 특성 성장-배양액에서 42oC로 28일 동안 배양된 토착박테 리아를 황철석-용출 배양액에 접종하여 42oC로 황철석 용출 실험을 실시하였다. 황철석-용출 배양액에 성장하 고 있는 부유성 박테리아의 형태를 반응시간별로 SEM 에 나타냈다. 토착박테리아들이 황철석-용출 배양액에 접종된 후 2일 경과 되었을 때, 크기가 약 0.5×1.7 µm 에서 0.6×3.0 µm 범위인 막대모양의 박테리아들이 관 찰되었으며 주로 0.5×1.7 µm 크기의 박테리아들이 우.

(6) 114. 박천영·김순오·김봉주. Fig. 4. SEM images of planktonic bacteria in pyrite-leaching-medium. After 2 days(A, pH=3.34), 3 days(B, pH=3.15), 4 days(C, pH=3.28) and 5 days(D, pH=3.36) of growth with supplement yeast extract(0.02%) at 42oC. Scale bar is 5.0 µm.. 세하였다(Fig. 4A). 3일 경과 되었을 때, 크기가 약 0.2×1.3 µm에서 0.7×3.0 µm 범위의 박테리아들이 관찰되 었다. 3일 경과되었을 때, 종(species)이 다른 것으로 생 각되는 박테리아 즉, 크기가 1.1×2.3 µm에서 0.7×3.0 µm 인 박테리아들이 나타나기 시작하였다. 4일 경과 되었 을 때, 크기가 약 0.6×1.6 µm에서 1.1×4.3 µm 범위의 박테리아들이 관찰되었다. 4일이 경과되면서, 크기가 약 0.6×1.6 µm인 박테리아들은 극소수로 관찰되고 대 부분 크기가 0.8×3.9 µm에서 1.1×4.3 µm인 박테리아들 이 관찰되었다. 5일 경과된 황철석-용출 배양액에는 대 부분 0.6×4.6 µm 크기의 박테리아들이 관찰되었다. 4 일이 경과되면서, 황철석-용출 배양액에서 부유성으로 존재하는 박테리아들의 길이와 직경이 증가되고 개체 수가 증가된 원인은 yeast extract의 영향으로 생각된 다. 황철석-용출 배양액에 포함된 황철석과 yeast extract에 의해 박테리아들의 길이와 직경이 증가하고 그리고 개체수가 증가 했다는 것은 황철석-용출 배양 액에서 성장하고 있는 박테리아들이 화학자가영양체. (chemolithotrophic)와 종속영양체(heterotrophic bacteria) 의 기능을 동시에 갖고 있는 종(species)이 생존하고 있을 가능성과, 혹은 화학자가영양체와 종속영양체가 혼합되어 생존하고 있을 가능성이 있다. 이들 부유성 박테리아들의 크기와 황철석 표면에 부착한 박테리아 들과의 크기를 서로 비교해 보면 부유성 박테리아들의 크기가 황철석 표면에 부착한 박테리아들 보다 훨씬 크다. 따라서 황철석-용출 배양액에 생존하고 있는 박 테리아들은 화학자가영영양체와 종속영양체가 혼합되 어 생존하고 있을 가능성이 있는 것으로 판단된다. 즉 부유성 박테리아는 yeast extract를 활용하는 종속영양 체 그리고 황철석 표면에 부착하여 성장하는 박테리아 는 화학자가영양체일 가능성이 높다. 산성 온천수에서 채취된 이들 박테리아는 화학자가영양체 뿐만 아니라 종속영양체들도 생존할 수 있는 환경이다. 왜냐하면 광 산산성배수에는 37종의 절대 호산성 종속영양체들이 생존하고 있으며 특히 구연산(citric acid)과 같은 유기 물에 박테리아가 1~4.2 µm 크기로 성장했다는 연구.

(7) 42℃에서 토착호산성박테리아의 황철석 표면에 대한 선택적 부착과 용출 특성. (Wichlacz and Unz, 1981)들, 크기 2~2.5 µm인 막대 모양의 고온성 박테리아들을 yeast extract에서 배양했 다는 연구들로 봤을 때, 본 실험에서 황철석-용출 배양 액에 생존하고 있는 박테리아들은 화학자가영양체와 종 속영양체가 혼합되어 생존하고 있을 가능성이 매우 높 다. Yeast extract 첨가에 의해 토착박테리아들의 직경 과 길이가 증가되고 개체수가 증가된 것은 yeast extract가 탄소 원으로 작용한 것이 확실한 것으로 판 단된다(Shivvers and Brock, 1973; Norris and Barr, 1985). 3.3. 토착박테리아의 선택적 표면 부착 토착박테리아가 황철석-용출 배양액에서 황철석 표 면에 부착할 때 특정장소를 선택하여 군집을 형성하는 것으로 나타났다. Fig. 5A에서 막대 모양의 토착 박테 리아들이 황철석 표면에 발달한 육각형 공동 주변에. 115. 군집을 형성한 것이 관찰되었다. Fig. 5A에서 육각형 공동이 토착 박테리아들의 군집 형성으로 인하여 보이 지 않게 되었다. Fig. 5B는 황철석 표면에 자연적으로 길게 발달한 육각형 공동 주변과 안쪽으로 토착박테리 아들이 군집을 형성하였다. Fig. 5C는 육각형 공동 주 변과 공동 안쪽에 토착박테리아들이 군집을 형성하였 다. Fig. 5D는 확장된 육각형 공동 바닥에, 그리고 공 동 주변에 토착박테리아들이 군집을 형성하여 부착하 였다. 이와 같이 토착 박테리아들이 황철석 표면의 특 정 장소를 선택하여 군집을 형성하여 부착하는 원인은 이들 장소가 결정학적으로 결함(imperfection)이 있기 때문이다(Bennett and Tributsch, 1978; Edwards et al., 2001). 이들 장소는 Fe와 S의 화학적 결합이 약하 게 되어 있어 산화될 때 쉽게 Fe2+ 이온이나 S를 방 출하기 때문에 박테리아들이 이들 장소를 선호하는 것 으로 해석된다(Rojas-Chapana and Tributsch, 2004).. Fig. 5. SEM images of indigenous acidophilic bacteria attached to pyrite surface. After 8 days(pH=3.46) of bioleaching with supplement yeast extract(0.02%) at 42oC. Selective attachment and concentrated colony of indigenous acidophilic bacteria on the cavity(A), inner wall of the long hexagonal cavity(B), surround and inner wall of hexagonal cavity(C) and corroded cavity(D) in pyrite surface. The distortion results by drying in air vacuum collapse of the cell wall. Scale bar is 10.0 µm(A and C) and 5.0 µm(B and D)..

(8) 116. 박천영·김순오·김봉주. 또한 박테리아들이 선택적으로 부착하는 이들 장소는 Fe2+와 thiosulfate(S2O22-)가 적게 방출되는 국지적 양 극(anode)으로 그리고 철수산화물이 침전되는 장소는 국지적 음극(cathode)으로 작용하였기 때문일 수도 있 다(Rohwerder et al., 2003). 황철석은 결정구조가 NaCl과 유사하여 Fe 원자 하나에 2개의 S가 서로 공 유결합(covalent bond)으로 결합되어 있다(Martello et al., 1994). S-Fe-S로 결합된 결정면, 즉 Fe와 2개의 S가 서로 공유결합을 형성한 (111)결정면은 매우 강한 황철석을 형성한다. 그러나 Fe가 결여되어 S-S로 결합 된 상태를 stacking fault라 하며 황철석 표면에 얇은 평행 결함선(thin planar defect)으로 나타난다. 황철석 에 발달한 stacking fault 및 전위선(dislocation)의 밀 도, 충식(etch pit) 빈도는 황철석의 반응성(산화율)과 상관성이 매우 높은 것이 실험으로 밝혀졌다(Martello et al., 1994). Fig. 5에서 관찰되는 육각형의 공동들은 Keller와 Murr(1982)가 주장한바와 같이 토착박테리아 들의 산화작용으로 형성된 것이 아니고, 자연적으로 발 달된 육각형 공동 주변에 토착박테리아들이 군집으로 부 착하여 산화시켜 공동의 크기가 확장되는 것으로 해석된 다. 토착박테리아들의 선택적 산화작용에 의해 육각형 공 동이 확장되면 결국 Rojas-Chapana와 Tributsch(2004) 가 Leptospirium ferrooxidans으로 실험한 것과 같은 부식 공동(corrosion cavity)들이 형성될 것이다. 3.4. Filament-shaped 박테리아의 황철석 표면 부착 황철석 표면에 filament-shaped 박테리아들이 육각형 공동 주변과 공동 안쪽의 벽면에 부착된 것이 SEM분 석에서 관찰되었다(Fig. 6). Fig. 6A에서 육각형 공동 주변의 황철석 표면에 막대모양과 filament-shaped 박 테리아들이 부착하였고, Fig. 6B에서 크랙(crack) 안쪽 벽면과 크랙 주변에 filament-shaped 박테리아들이 부 착하였다. filament-shaped 박테리아들의 크기는 약 4.92 µm에서 약 10.0 µm로 나타났다. 크기가 약 4.92 µm 에서 10.0 µm의 박테리아들이 황철석 표면에 부착하여 관찰되는 원인은 이들 박테리아들이 산성 온천수에서 생존하였기 때문이다(Norris and Barr, 1985; Norris et al., 1989). 황철석 표면에 부착한 filament-shaped 박테리아들의 길이는 Norris와 Marsh(1986)가 copper leach dump에서 분리배양한 호산성박테리아의 변종 TH3와 같이 그리고 coal spoil heap에서 분리 배양한 변종 박테리아인 ALV의 길이와 같이 매우 길다. 이들 변종 박테리아들은 yeast extract 첨가에 의해 황철석,. Fig. 6. SEM images of indigenous acidophilic bacteria attached to pyrite surface. After 22 days(pH=4.88) of bioleaching with supplement yeast extract(0.02%) at 42oC. A; the rod-shaped and the filament-shaped indigenous bacteria attached to the around of hexagonal cavity hole, B; the filament-shaped indigenous bacteria attached to the inner wall of the cracks. Scale bar is 5.0 µm.. 자류철석 및 nickel 등으로부터 Cu, Fe 및 Ni 이온을 용출시키는 능력이 뛰어난 것으로 밝혀졌다(Norris and Parrott, 1986). 3.5. 황철석 용출 특성 토착박테리아를 42oC로 배양시킨 이유는 황화광물 로부터 유용금속을 효과적으로 더 많이 용출시켜 내기 위해서이다. 화순 광산배수에 서식하는 토착박테리아를 32oC 온도에서 황철석에 접종시켜 본 결과 Fe 및 Zn 의 이온 함량이 낮게 용출되었다(Park et al., 2009). 광산폐석이나 저 품위 황화광물로부터 많은 양의 유용 금속이온을 빠르게 용출시켜 내기 위해서 산성 온천수 와 같은 극한 환경에서 생존했던 고온성박테리아 (thermophile)를 황화광물에 접종하였다. 고온성 박테리 아는 중온성 박테리아에 비하여 유용금속 용출 능력이.

(9) 42℃에서 토착호산성박테리아의 황철석 표면에 대한 선택적 부착과 용출 특성. 뛰어나고 중금속이온 농도에 독성 효과가 적게 나타난 다(Brierley and Murr, 1973; Brierley and Brierley, 1973; Hendy, 1987). 토착박테리아에 접종하기 전 황철석 표면에 대한 구성 성분을 EPMA(EDX)로 분석한 결과 Fe가 45.64 wt.%, S가 50.34 wt.%, Zn이 0.03 w.t% 및 Cu가 0.01 wt.% 로 나타났다. Resin에 molding된 황철석 입자 표면을 5개 선정하여 한 입자에 대하여 각각 5 지점을 분석하 고 이들을 평균치로 나타낸 것이다. Fig. 7는 토착박테 리아에 의해 황철석으로부터 용출된 Fe 이온과 Zn 이 온 함량을 반응시간별로 나타낸 것이다. 황철석-용출 배양액에 토착박테리아를 접종하고 초기 pH를 황산으 로 조정하지 않았다. 따라서 황철석으로부터 용출되는 Fe 이온과 Zn 이온 함량을 박테리아에 의한 생물학적 용출량과 비교시료에서 용출되는 화학적 용출량으로 비 교할 수 있었다. 반응 19일까지 토착박테리아에 의한 Fe 이온의 미생물학적 용출량이 화학적 용출량에 비하 여 3.4배 이상 높게 용출되었다. Zn 이온도 화학적 용 출량보다 미생물학적 용출량에서 2배 이상 높게 용출 되었다. 화순 광산배수에 서식했던 토착박테리아를 32 ℃의 황철석에 접종한 결과 Fe 및 Zn 이온이 비교시. 117. 료에 비하여 박테리아 시료에서 각각 1.3배와 1.4배로 용출되었다(Park et al. 2009). Park et al.(2009)이 32oC에서 실험한 배양용액과 황철석은 본 42oC에서 실 험한 것과 동일하였다. 하지만 용출 온도를 10oC 증가 시키고 산성 온천수와 같이 고 온도에 생존했던 박테 리아를 접종한 결과 용출되는 이온 농도가 훨씬 증가 하였다. 이와 같이 Fe 이온과 Zn 이온의 미생물학적 용출량이 높은 원인은 첨가한 yeast extract의 영향과 산성 온천수와 같은 극한 환경에 생존했던 박테리아의 능력에 의한 결과로 생각된다. Brierley(1974)에 의하면 미생물을 이용한 휘수연광 용출 실험에서 yeast extract 를 첨가한 시료에서 산출량(yield %)이 8.3%(control= 0.1%)을 얻었고, 그리고 yeast extract와 iron(Ⅱ)를 첨 가한 시료에서 산출량은 13.3%(control=0.1%)을 얻었 다고 주장하였다. 이와 같이 yeast extract를 첨가한 시료에서 산출량이 뛰어난 것은 박테리아의 세포분열 에 yeast extract가 영향을 주었기 때문으로 해석하였다. 3.6. XRD 및 IR분석과 2차 용출 생성물 황철석-용출 배양액에 사용하기 전의 황철석(Fig. 8A), 42oC로 20일 동안 무기적 산화작용을 유도한 비교시료 (Fig. 8B) 그리고 42oC에서 20일 동안 토착박테리아 용출 실험에 이용한 황철석 시료(Fig. 8C)에 대하여 XRD분석 결과를 나타냈다. 사용 전의 황철석에 비하 여 비교시료에 사용한 황철석의 X-선 회절선의 강도 (intensity)가 대부분 감소하였다. 이는 화학적 산화작 용에 의하여 황철석이 용해되고 있음을 지시해주고 있 다. 박테리아에 반응시켰던 황철석 시료의 X-선 회절선 들은 비교시료에 비하여 상대적으로 (111), (311), (222) 및 (320) 결정면들의 강도는 감소하였고, (200), (210) 및 (211)의 결정면들의 강도는 증가하였다. 특히 박테 리아에 반응시켰던 황철석에서 4.27Å의 X-선 회절선이 나타나고 있는데 이는 석고에 해당되는 회절선으로 추 정된다(Shi and Fang, 2004). 황철석-용출 배양액에 사용하기 전의 황철석(Fig. 9A), 42oC로 20일 동안 무기적 산화작용을 유도한 비교시료 (Fig. 9B) 그리고 42oC에서 20일 동안 토착박테리아 용출 실험에 이용한 황철석 시료(Fig. 9C)에 대하여 IR분석 결과를 나타냈다(Fig. 9). 비교시료로 사용했던 황철석 시료(Fig. 9B)에서 OH stretch 밴드에 해당되 는 3432.9 cm-1 흡수밴드 강도가 사용 전(Fig. 9A)의. Fig. 7. Variation of amounts of iron and zinc vs. time(days) in pyrite-leaching medium with supplement yeast extract at 42oC( ● ; bacteria, ○ ; control).. 3425.4 cm-1 흡수밴드 강도 보다 증가하였다. 그리고 박테리아에 반응시켰던 시료(Fig. 9C)의 3436.7 cm-1 흡수밴드는 비교시료의 흡수밴드 보다 증가하였다. 이.

(10) 118. 박천영·김순오·김봉주. Fig. 8. X-ray diffraction patterns of pyrite: A; pyrite(raw sample), B; after 20 days of control sample, C; after 20 days of bioleaching sample(P; pyrite. Q; quartz).. Fig. 10. SEM images of the pyrite surface. After 10 days(A, pH=3.94) and 22 days(B, pH=4.88) of bioleaching with supplement yeast extract(0.02%) at 42oC. R; rodshaped indigenous bacteria, Fs; filament-shaped indigenous bacreria, G; gypsum crystal, S; sulfur crystal, F; Fehydroxide, Fy; framboidal Fe-hydroxide, Scale bar is 20.0 µm.(A) and 5.0 µm(B).. Fig. 9. Infrared spectra of pyrite: A; pyrite(raw sample), B; after 20 days of control sample, C; after 20 days of bioleaching sample.. 와 같이 OH에 해당되는 진동흡수 밴드가 사용 전 보 다 비교시료에서 그리고 비교시료보다 박테리아 시료 에서 증가한 결과는 OH를 포함하는 수산화물의 생성 이 증가되었음을 지시해준다. H2O의 deformation 흡 수밴드에 해당되는 1627.6 cm-1(A), 1631.3 cm-1(B) 및 1631.5 cm-1(C) 흡수밴드 강도들은 사용 전, 비교시료 그리고 박테리아 시료에서 차이가 나타나지 않았다.. SO4의 흡수밴드에 해당되는 흡수밴드는 사용 전(A, 1079.7 cm-1) 보다 비교시료(B, 1082.3 cm-1)에서 그리 고 박테리아 시료(C, 1082.8 cm-1)에서 감소하였다. 이 와 같이 사용 전 보다 비교시료에서 그리고 박테리아 시료에서 SO4의 흡수밴드가 감소한 원인은 무기적 산 화에 의해서 그리고 박테리아의 산화작용에 의하여 SO4가 제거되었기 때문이다. 그리고 SO4의 흡수밴드에 해당되는 흡수밴드는 비교시료 보다 박테리아 시료에 서 강도가 증가하였다. 이는 비교시료에 비하여 박테 리아 시료의 황철석 표면에 SO4를 함유하는 석고와 같 은 결정들(Fig. 10)이 생성되었기 때문이다(Lazaroff et al., 1982, 1985). Fig. 10은 20일 동안 토착박테리아에 반응시켰던 황 철석 표면에 대한 SEM 사진이다. 황철석 표면에 막대 모양의 토착박테리아, 양 끝이 뾰족한 모양의 원소 황.

(11) 42℃에서 토착호산성박테리아의 황철석 표면에 대한 선택적 부착과 용출 특성. 결정(Mehta and Murr, 1983), 장미꽃 모양의 석고 결정, 포도송이구조의 철수산화물 그리고 석고결정과 철수산화물이 혼합된 혼합물들이 관찰되었다(Fig. 10A). SEM분석에서 관찰되었던 원소 황 및 석고 등의 결정 들은 XRD분석에서 검출되지 않았다. SEM분석에서 관 찰되었던 원소 황과 석고결정들이 XRD분석에서 검출 되지 않은 원인은 황철석 입자(20 mesh=0.85 mm)를 XRD분석하기 위하여 200 mesh 이하로 미분쇄하였기 때문이다. 그리고 SEM분석에서 황철석 표면에 형성된 포도송이구조의 철수산화물들이 XRD분석에서 검출되 지 않는 이유는 이들 철수산화물들이 XRD의 검출한 계(Lottermoser, 2007)인 3 wt.% 내지 5 wt.% 이상으 로 형성되지 않았기 때문으로 생각한다. Acidithiobacillus ferrooxidans에 15일 동안 반응시킨 marmatite에서 원 소 황과 jarosite와 같은 2차광물이 XRD분석에서 확인 된 연구가 있었다(Shi and Fang, 2004). 대부분의 생 물학적 용출 실험에서 철수산화물의 생성을 억제하기 위하여 박테리아를 접종한 배양액에 황산을 첨가하여 pH를 조정한다. 그러나 Shi와 Fang(2004)이 실험한 것 과 같이 marmatite가 포함된 배양액에 박테리아를 접 종하고 pH를 조정하였지만 원소 황과 jarosite가 XRD 분석에서 검출되었다. Fig. 10B는 황철석 표면에 부착 한 포도송이구조의 철수산화물, rod-shaped bacteria, filament-shaped bacteria들이 관찰되었다. 포도송이구 조의 철수산화물들이 박테리아 위에 침전되어 쌓인 것 이 관찰되었다. 생물학적 용출 실험에서 용출 효율을 감소시키는 가 장 큰 원인은 2차 생성물의 형성에 의해 박테리아의 산화율 감소이다(Pogliani and Donati, 2000). 2차 생성 물은 황화광물로부터 용출된 Fe와 S 이온 그리고 배양 액으로부터 공급된 K와 Ca 이온 등이 서로 결합하여 amorphous의 Fe-hydroxide(Fe(OH)3), sulfur crystal(S0), gypsum(CaSO4·2H2O), jarosite(KFe3(SO4)2(OH)6) 등이 형성된다. 이들 2차 생성물들은 Fig. 10에서와 같이 황 철석 표면에 침전되어 박테리아의 부착을 방해하여 금 속이온의 용출 효율을 감소시킨다.. 4. 결. 론. Yeast extract가 포함된 성장-배양액에서 토착박테리 아들 42oC로 배양시킨 결과 막대모양의 박테리아들이 나타났다. 크기가 약 0.7×2.6 µm에서 0.6×7 µm 범위 그리고 약 0.8×5 µm에서 0.7×8.4 µm 범위인 박테리아 들이 관찰되었다. 토착박테리아가 성장함에 따라 성장. 119. -배양액의 pH가 감소하고 Eh가 증가하여 에너지원으 로 첨가한 원소 황이 미생물학적으로 산화되는 것을 확인하였다. 황철석-용출 배양액에서 부유성으로 존재 하는 박테리아들이 길이와 직경이 증가되고 개체수가 증가되었다. 황철석-용출 배양액에 포함된 황철석과 yeast extract에 의해 토착박테리아들의 길이와 직경이 증가하고 그리고 개체수가 증가 했다는 것은 토착박테 리아들이 화학자가영양체와 종속영양체의 기능을 동시 에 갖고 있는 종(species)이 생존하고 있을 가능성과, 혹은 화학자가영영양체와 종속영양체가 혼합되어 생존 하고 있을 가능성이 있는 것으로 해석된다. 토착박테리아가 황철석 표면에 발달한 육각형 공동, 표면 단층, 파쇄대 등에 집중적으로 군집을 형성하여 부착하는 것은 이들 구조들이 에너지를 더 많이 발생 하여 토착박테리아들이 이들 장소를 선택하는 것으로 해석된다. 황철석 표면의 crack 주변과 crack 안쪽의 벽면에 부착된 filament-shaped 박테리아들의 길이는 약 4.92 µm에서 약 10.0 µm로 나타났다. 본 실험에서 황철석-용출 배양액에 토착박테리아를 접종하고 초기 pH를 황산으로 조정하지 않았기 때문에 황철석으로부 터 용출되는 Fe와 Zn 이온의 생물학적 용출과 화학적 용출을 서로 비교할 수 있었다. Fe 이온은 미생물학적 용출량이 화학적 용출량에 비하여 3.4배 이상 높게 용 출되었고 Zn 이온은 화학적 용출량보다 토착박테리아 에 의한 미생물학적 용출량이 2배 이상 높았다. 황철 석 표면에 2차 생성물인 원소 황 결정, 석고 결정, 포 도송이구조의 철수산화물 그리고 석고결정과 철수산화 물이 혼합된 결정들이 형성된 것이 관찰되었다. 미생 물학적 용출 실험에서 2차 생성물들은 황화광물의 생 물학적 용출 효율을 감소시키는 인자들이다. 앞으로 철 수산화물과 같은 2차 생성물의 생성이 억제되도록 토 착박테리아 접종 초기에 황산으로 조정하여 용출실험 을 실시하고, 42oC 보다 높은 온도에서 용출실험을 수 행한다면 그리고 column leaching로 2차 생성물이 생 성되지 않는 조건으로 용출 배양액을 연속적으로 배수 하는 방법으로 생물학적 용출실험을 병행한다면 황화 광물로부터 금속이온 용출 효과를 향상시킬 수 있을 것이다.. 참고문헌 Bennett, J.C. and Tributsch, H. (1978) Bacterial leaching patterns on pyrite crystal surfaces. Journal of Bacteriology. v.134, p.310-317. Berry, V.K. and Murr, L.E. (1978) Direct observations of.

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