대한수부외과 학회지 제4권 2호 Vo l. 4 , No 2 , Nove m be r 199 9 .
TGF-β 유전자를 포함하는 세포를 이용한 가토 골-인대 연결부 치료
인하대학교 의과대학 부속병원 정형외과학교실, *병리학교실
이정윤・이관희・오인석・황태숙*・이준규・고석면
=A b s t ra c t =
P o s s i bili ty o f B on e - T e n don Ju n c ti on Re g e n e rati on w i th T GF - β T ran s f e c t e d F ibrobl a s t s in R ab bi t M o de l
J oun g Yoon Lee, M.D., Kw an Hee Lee, M.D., In Suk Oh , M.D.
T ae S ook Hw an g , M.D.*, Jun Kyu Lee, M.D. and Suk Myun Ko, M.D.
D ep artm ent of Orthop edic S urg ery , *Pathology, Colleg e of M edicine, I nha Univers ity, I nchon, K orea
Transforming growth factor - β(T GF - β) has been considered as one of the possible gene therapy candidates for orthopedic diseases. In previous study, we demonstrated that the T GF- β gene therapy can be applicable to orthopedic patients. After transfection of T GF- β cDNA sequence to fibroblasts (NIH 3T3), stably transfected cells were injected into rabbit Achilles tendon. At 6 weeks after injection, these cells survived and stimulated the matrix formation in rabbit Achilles tendon. T o evaluate the possibility of lateral epicondylitis treatment, these cells were injected into artificially made bone- tendon junction defect area. The injected cells formed a cartilage mass and compressed the tendinous portion but bony area was not stimulated. These findings suggested that the cells stimulated the surrounding cartilage forming cells but they could not stimulate osteoblast s which was surrounded by lamella bone. We think that DNA transfected cells can stimulate the surrounding cells in vivo and ex vivo gene therapy can be applicable for the regeneration of damaged tissues in orthopedic field.
Key Words : Lateral epicondylitis, Gene Therapy, T GF - β, Fibroblasts.
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※ 통신저자 : 이 관 희
인천광역시 중구 신흥동 인하대 부속병원 정형외과 본 논문은 1997년도 인하대학교 교내연구비의 지원을 받아 이루어졌음.
서 론
T GF - β19 )는 다기능의 성장촉진 인자로 세포의 성장, 분화 및 세포간질 단백질의 형성에 관여하는 것으로 밝혀지고 있다2 , 3 ). 체외 실험에서는 상피세 포와 파골 세포의 성장을 억제하는 것으로 알려져8 ) 있으나, 체내 환경에서는 연골골화를 촉진시켜 골 형성을 이루는 것으로 보고되었다10 , 15 , 16 )
. 특히, T GF - β에 의한 연골 골화 형성은 골막 하부의 다 기능 세포(stem cell)를 분화하도록 자극하여 일어 나는 것으로13 , 18 ), 정형외과 영역의 손상 치료제로서 가능성이 있어 TGF - β를 치료에 응용하려는 노력 이 계속되고 있다.
최근 선천성 기형의 치료와 종양 치료제로서의 가능성 때문에 주목을 받고있는 유전자 요법은 아 직도 그 실현을 위해서는 많은 연구가 필요한 상태 이다. 낭포성 섬유종(cystic fibrosis) 환자에서 효과 가 증명된 후 많은 연구가 폭발적으로 증가하였으 나9 ), 종양의 치료에 응용하려는 노력은 어려움에 부 딪혀 있는 것이 사실이다14 ). 그 방법은 여러 가지가 있으나 임상적으로 사용가능한 방법들은 in vivo, ex vivo 등으로 알려져있다(Fig. 1). 정형외과 영역 에서는 단일 성장인자를 이용하여 골의 불유합, 인 대의 재생, 연골의 재생들에 사용되어 질 가능성이 있기 때문에 저자들은 특정 단백질을 특정 지역에
장기간 노출할 수 있는 유전자 치료법을 이용하여, 특정 부위에 고농도의 성장인자를 유지하고, 손상된 조직의 재생에 유전자 치료법을 사용할 수 있는지의 여부를 관찰하기 위하여 본 실험을 시행하였다.
상완골 외과염의 원인은 분명하지 않으나, 저자 들은 반복 손상에의한 상완골 외과의 골- 인대 연결 부위의 손상이라는 가정을 주장하여 왔다1, 4 ). 그 치 료 방법을 개발하기 위하여, 골과 인대로 연결되고 중간에 연골 조직이 분포한 조직학적으로 특수한 골인대 연결 부위에서, 다기능의 성장촉진 인자로 알려져 있는 T GF - β 단백질이 손상 치료에 응용될 수 있는 여부를 확인하고자 하였다. 따라서, 본 실 험의 목적은 정형외과 영역에서 치료제로서 사용되 어질 가능성이 높은 T GF - β를 지속적으로 분비하 는 안정세포군(stable cell line)을 만들어 이들 세포 가 생체 내에서 골-인대 연결부의 치료제로 사용될 가능성을 확인하기 위함이다.
연구 대상 및 방법 1. 세포생산
NIH 3T 3 섬유아세포를 사용하여 이들 세포에 T GF - β 유전자(cDNA)를 삽입하였다11). 세포를 분 화되기 이전 상태에서 DMEM (Gibco BRL, Rockville, MD) 배양액에 우배아 혈장 10%를 첨가 한 후, 이산화탄소 5%의 37℃ 배양기에서 배양하고 이 세포들에 pPK 9a 매개체(vector )를 사용하여 calcium phosphate 방법으로 유전자를 삽입 (transfection ) 하였다. T GF - β 유전자는 metallo- thionein 촉진자에 네오마이신 저항성을 갖는 유전 자를 포함하여 세포 내에 삽입한 후, 안정되게 삽입 된 세포들을 가려내기 위하여 배양액에 네오마이신 을 동시에 투여하였다. 촉진자는 아연의 농도가 증 가할 때 발현되므로, 얻어진 세포가 성장인자를 분 비하는 것을 확인하기 위하여 아연(zinc sulfate)을 배양액에 첨가하고, 배양된 세포들에서 RNA를 분 리하였다. 이 RNA를 Northern을 시행하여 T GF - β가 분비되는 여부를 확인하였다(Fig 2).
RNA는 guanidium isothiocyanate/ phenol/ chloro- form 방법을 사용하여 추출하였다. 추출된 10μg의 Fig . 1. Schematic drawing of cell and gene therapy
methods. Gene therapy in vivo means direct injection of specific gene to the lesion site. Cell therapy ex vivo means injection of specific cells to the lesion sites. Gene therapy ex vivo means injecton of cells which contains specific gene to the lesion site.
RNA를 1.0% 아가로즈 젤에 전기영동하고, 이를 Duralon- UV 막에 옮기고, 자외선 stratalinker로 crosslink를 시행하였다. 이를 1% 우혈청 알부민, 7% SDS, 0.5 M sodium phosphate, 1 mM EDT A 와 65℃ 에서 혼합(hybridization)시킨 후,32P- labelled T GF - β cDNA에 반응시켰다.
2. 가토내 투여
성장인자의 발현이 확인된 세포들을 가토 슬관절 인대와 골 연결부에 사각형으로 절제한 손상부위에
주사하여 그 생존 여부를 관찰하였다. 가토는 럼푼 과 케타민으로 마취하였으며, 주사 2일 후부터 가토 의 식수에 아연을 첨가하여 성장인자가 분비되도록 유도하였다. 세포 내 투여 농도는 106 세포/ ml로, 0.1 ml 정도 양의 세포를 투여하였다. 5마리의 가토 에서 투여 6주 후에 슬관절 골 인대 연결부를 채취 하여 그 변화를 육안 및 H- E 염색을 이용하여 관찰 하였다.
3. Immunohistoche mia l 염색
염색에 쓰인 항체는 다형(polyclonal) 항체로 T GF - β 단백질의 1번에서 30번 까지의 아미노산 에 대한 항체를 토끼에서 생산하여 사용하였다. 염 색 방법은 hyaluronidase를 이용하여 흡수시킨 후, 일차 항체로 T GF - β를 사용하여 밤새 반응 시키 고, IgG에 대한 2차 항체를 작용시켰다. 이렇게 하 여 만들어진 절편의 현미경 관찰은 한 저자에 의하 여 판단되었다.
결 과
1. 세포생산
네오마이신을 사용하여 배양한 후 세포군 (colony )을 분리하였다. 이 분리된 세포에 아연을 첨가하고 Northern을 시행한 결과 T GF - β의 F ig . 2 . Northern result of NIH 3T3 cell lines
after transfection of pPK 9a vector with T GF - β sequence.. T hey expressed the T GF - β transgene mRNA in 100 μ M/ 24 hr concentration of zinc sulphate.
F ig . 3 . A, B. Expression of TGF-β in vivo by transfected cells. (A) In low power field with hemmatoxilin- eosin staining (X 40), the cells(arrow) were scattered throughout the lesion. (B) When the cells were stained immunohistochemically with T GF - β antibdy (X 100), they stained yellow(arrow) which indicates production of T GF - β protein by the cells.
mRNA가 분비되는 것을 확인하였다(Fig. 2). 이 세 포들은 확인된 직후에 영하 70도에서 냉동 보관하 였으며, 사용하기 1주일 전에 재배양을 시행하고 세 포가 증식된 상태에서 트립신을 이용하여 세포를 채취하였다. 채취된 세포의 농도를 측정한 후 배양 액으로 희석하여 원하는 농도로 만들었다. 이 농도 의 세포는 배양액과 함께 운반되어 가토를 수술적 으로 절개한 후 주사기로 투여하였다.
2. 가토내 투여
NIH 3T3 섬유아세포를 투여한 4주 후 가토의 인 대 부위에서 T GF - β 염색을 시행한 결과 체내에서 도 단백질을 분비하는 것으로 확인되었다.(Fig 3) 6 주에 골 인대 연결부위를 육안적으로 확인한 결과 정상 부위에 비교하여 특별한 변화를 관찰하지 못 하였다. H- E 염색을 시행한 후 관찰한 결과 투여된 섬유아세포가 연골 조직을 형성한 것이 관찰 되었 다(Fig 4). 이는 투여된 세포가 주위조직 세포들의 분화를 촉진하여 일어난 것으로 판단된다. 그러나,
새로이 생성된 연골체가 정상 골- 인대 연결 부위와 정확하게 조직학적으로 일치한다고 볼 수는 없었다.
즉, 세포의 농도에 따라 연골체가 더 생성되거나 덜 생성될 수 있기 때문에 실제 치료에 적용에는 더 많 은 연구가 필요하다고 판단된다.
이상의 결과는 이러한 세포들이 다른 매개체의 필요가 없이 치료에 사용될 수 있다는 가능성을 보 여주는 것으로 생각된다. 즉, 안정세포는 장시간 동 안 단백질을 생성하는 일종의 공장 역할을 수행할 수 있을 것으로 사료되어, 체내에서 고농도의 T GF - β를 유지하는 방법이라고 판단된다. 따라서 성장인자 유전자를 포함하는 세포의 투여는 다른 매개체의 도움 없이, 인체 내에 성장인자를 분비하 는 방법으로 인정되며, 이를 치료에 이용하기 위한 방법의 연구가 필요하다고 사료된다.
고 찰
1975년 연골세포를 배양하여 정형외과 영역의 치 료에 응용하려던 시도에서 시작한 정형외과 영역의 생체치료(biotherapy)는 1990년대 초반까지 암흑기
F ig . 4 . A, B. Histologic findings of normal(A) and injected(B) bone- tendon junction.
(A) In normal bone tendon junction (X 150), the tendon and cartilage junction (arrow) is visible without any disrup- tion. (B) When the site was injected with T GF - β transfected fibroblasts, newly formed cartilage mass(arrow ) was visible. T his finding indicates that the transfected cells stimulated the surrounding cartilage forming cells.
에 있었던 것이 사실이다. 그 이유는 배양된 세포를 아무런 조작이 없이 사용하는 경우 치료제로서의 사용에 한계가 있었던 까닭이다. 그러나, 분자 생물 학의 발전으로 배양세포를 여러 가지 조작으로 치 료제로 사용할 수 있다는 것이 확인된 이후에는 이 러한 방법들을 치료법의 한가지로 인정하기 시작하 였다. 특히 유전자 조작을 이용하여 낭포성 섬유종 의 치료에 유전자 치료가 도입된 이후 폭발적으로 증가하였다9 , 14 ).
이와같은 연구의 증가에도 불구하고 가능성에 비 하여 실제 환자의 치료와 연결된 경우가 많지 않은 것이 현실이다. 그 원인은 안정된 유전자 전달 방법 개발의 어려움과 여러 유전자를 한꺼번에 투여하는 방법의 부재 등을 생각할 수 있다. 또한, 암 정복이 라는 단번에 넘기는 어려운 과제 앞에 직면해 있기 때문이라고 생각된다. 암의 분화는 단순히 한가지 유전자의 이상으로 인한 결과가 아니고, 여러 가지 유전자가 복합적으로 이상을 가져온 것이기 때문에 현재의 기술로는 결코 쉽게 해결할 수 있는 과제가 아니기 때문이다. 이러한 이유로 몇몇 학자들은 심 지어 유전자 치료가 불가능한 꿈에 불과하다고 이 야기하고 있다. 그러나, 정형외과 영역에서는 단일 한 유전자로 치료효과를 기대할 수 있기 때문에 암 의 정복보다는 쉽게 유전자 치료의 결과를 판정할 수 있어서 치료법 개발의 징검다리 역할을 할 수 있 을 것으로 생각한다. 저자들은 실제적으로 정형외 과 영역에 유전자 치료의 가능성이 있음을 본 실험 을 통하여 확인하였다.
T GF - β의 정형외과 영역에서의 효과는 이미 잘 알려져 있다. 현재까지 알려진 바로 TGF -β는 태 아의 발생, 골 및 연골의 분화, 피부 반흔 조직의 생 성, 암의 발생 등에 관여하는 것으로 알려져 있으며, 골 및 연골 분화 과정에서 T GF - β의 기능은 골아 세포의 이동을 조절하고, 증식을 조절하며, 세포 간 질 단백질의 생산과 분해를 조절하는 것으로 요약 할 수 있다 2, 3, 5 ,- 7 , 10, 12 , 18 )
. 섬유아세포에 대한 T GF - β의 기능은 양면적으로 알려져 있다. 즉, 낮은 농 도에서는 섬유아세포의 이동을 촉진시키는 반면에, 높은 농도에서는 세포의 전사를 촉진시키는 것으로 알려져 있다. 또한, 피부의 기저막의 존재여부도 분
비여부에 영향을 주는 것으로 알려져 있다. 즉, 기 저막이 파괴된 경우에는 T GF - β의 분비가 촉진되 지만, 기저막이 다시 생기긴 경우에는 분비가 감소 된다는 것이다. 그러나 이러한 다기능의 성장인자 라는 점은 골에서 인대로 연결되어 가는 특수한 조 직에서의 치료제로서의 가능성을 내포한다고 생각 된다.
T GF - β를생체 내로 투여하여 효과를 판정하게 된 것은 미국 국립보건원에서 일하고 있었던 Bolander 등15 )에 의해서였다. 그들은 정제된 T GF - β를 쥐의 골막 밑에 투여하였는데 놀랍게도 투여 부위에 연골내 골화가 시작되어 연골 생성이 일어 나는 것을 관찰하게 되었다. 투여를 중지한 후에는 막내 골화가 일어나서 이 연골조직이 골조직으로 변하게 되었다. 그들은 T GF - β1과 2의 효과를 비 교하여 β2가 β1 보다 더 강한 효과를 나타내는 것 으로 보고하였다. 그들은 또 새로 형성되는 조직이 투여 된 T GF - β의 양과 관련이 있다는 사실도 보 고하였다. 즉, 투여 된 T GF - β의 양이 적은 경우에 골조직이 연골보다 더 많이 생성된다는 것이다. 매 일 투여량이 200 ng 농도에서 20 ng으로 줄을 때, 연골/ 골의 비율이 3.57에서 0으로 감소하는 것이 관 찰되었다. 이러한 투여량에 따른 연골/ 골 비율의 변 화는 그 자체는 흥미로울지 모르나 인체 투여 시에 어려움을 예견케 하는 요소이다. 흥미 있는 사실은 체외 실험에서 농도에 따라 때로는 촉진, 때로는 억 제효과를 나타냈던 것과는 다르게 본 실험에서는 연골조직 생성을 촉진하는 것으로 관찰되었다. 이 는 치료제로서의 가능성을 높여주는 또 한가지의 현상으로 생각된다.
정형외과 영역에서 T GF - β 유전자를 이용하여 치료에 성공한 예는 아직까지 없는 실정이다. 이러 한 시점에서 저자들의 결과는 앞으로 연구의 성과 를 환자의 치료에 이용하기 위한 기초 자료로 생각 된다. 특히, 세포치료가 이종 동물에서도 가능한 여 부를 알기 위하여 쥐의 세포를 가토에 투여하여 섬 유아세포들이 연골조직의 생성을 촉진하는 것을 확 인하였다. 이는 안정세포를 만드는데 약3개월이 소 요되는 현재의 기술에도 불구하고, 유전자가 투입 된 인체 안정 세포들이 치료제로 사용될 가능성을
보여준다는 점에서 매우 고무적인 발견이라고 생각 된다.
본 연구가 시행한 유전자 치료법의 생체 내 적용 의 경험은 이를 통하여 T GF - β뿐 이니라 다른 성 장인자들의 생체 내 적용 방법의 개발과 연결될 가 능성이 크다. 유전자 치료법은 최근에 여러 분야에 서 사용 가능성에 대한 연구가 진행되고 있다. 특별 히 정형외과 영역에서는 단일한 유전자에 의하여 치료 효과를 기대할 수 있기 때문에 현재의 기술로 도 생체에 사용 가능성이 높다고 판단된다. 따라서 새로운 치료법의 개발 뿐 아니라 새로운 분야의 개 척이라는 점에서 향후 연구의 필요성이 강조된다.
요약 및 결론
저자들은 정형외과 영역에 유전자 치료의 가능성 을 확인하기 위하여, 섬유아세포에 T GF - β 유전자 를 삽입한 안정 세포군을 만들고, 이러한 세포가 적 당한 치료 방법이 발견되지 않은 상완골 외과염의 치료에 사용될 가능성을 확인하기 위하여, 골-인대 손상부를 만들고 이곳에 T GF - β 유전자가 포함된 섬유아 세포를 투여하였다. 투여 6주 후의 소견에서 세포들은 골인대 연결부의 연골 조직 세포의 성장 을 촉진하였으며, 생성된 연골 조직은 섬유조직을 누르고 있었다. 따라서 이러한 세포를 이용한 유전 자 치료는 목표세포와 삽입 유전자의 변화에 따라 정형외과 영역의 손상 치료에 이용될 수 있다고 판 단되어 문헌고찰과 함께 보고하는 바이다.
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