대한소화기학회지 2000;35:629 - 637
No. 99-216
췌장암과 만성 췌장염에서 p53 단백질 발현 및 K - ras 점돌연변이 유전자의 검출과 임상적 의미
단국대학교 의과대학 내과학교실, 외과학교실*, 해부병리학교실†및 소화기연구소
노임환・남승우・이명인・황영준・이병석・박현종・김병하・김정택*・조정희†
Cli n i c a l S i g n i fi c a n c e o f p 5 3 P r o t e i n E x p r e s s i o n a n d K-r a s P o i n t Mu t a t i o n i n P a n c r e a t i c Ca n c e r a n d Ch r o n i c P a n c r e a t i t i s
Im H w a n R o e , M .D ., S e u n g Wo o N a m , M .D ., M y u n g I n L e e , M .D ., Youn g J oon Hw ang, M.D., Byoung Su k Le e , M.D., Hyu n J on g P ark, M.D.,
Byung Ha Kim , M.D., J ung Taik Kim, M.D.* a nd Che ong-He e Ch o, M.D.†
Departments of Internal Medicine, Surgery* and Pathology†, Research Institute for Gastroenterology, Dankook University College of Medicine, Cheonan, Korea
Backgroud/Aims: The aims of this study were to evaluate the expression rate of p53 protein and K-ras mutation in pancreatic carcinogenesis, and to determine their clinical significance. Methods:
Specimens were obtained from 26 pancreatitic ductal adenocarcinoma, 12 chronic pancreatitis, and 5 normal pancreas. For the specimens, overexpression of p53 protein was evaluated by immunohisto- chemical assay, and K-ras mutation was analyzed by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism. Results: Immunohistochemical staining for p53 protein was positive in 0% of normal ducts, 25% of chronic pancreatitis, and 61.5% of pancreatic carcinoma. K-ras mutation was positive in 0% of normal ducts, 16.7% of chronic pancreatitis, 76.9% of pancreatic carcinoma. There were no significant correlations between p53 immunoreactivity or K-ras mutation and age, gender, tumor size, histopathological grade, and stage of pancreatic cancer. However, the p53-positive pan- creatic cancers showed significantly lower survival rate than a p53-negative tumors (p<0.05). There was no correlation between K-ras multation and survival rates. Conclusions: The mutations of p53 tumor suppressor gene and K-ras might have important roles in the pancreatic carcinogenesis. The detection of p53 alterations might be useful in the prediction of the patient' s prognosis. The genetic alterations of p53 and K-ras are likely to begin in the stage of chronic pancreatitis. (Kor J Gastroenterol 2000;35:629 - 637)
Key Words: Pancreatic cancer, Pancreatitis, p53, K-ras
접수: 1999년 10월 9일, 승인: 2000년 2월 9일
연락처: 노임환, 330-714, 천안시 안서동 산 29번지, 단국대학교 의과대학 내과학교실 Tel: (0417) 550-3917, Fax: (0417) 554-1438, E-mail: [email protected]
630 대한소화기학회지 : 제 35 권 제 5 호 2000
서 론
췌장암의 발암 과정에서 암유전자와 암억제유전 자에 대한 접근은 발암기전의 이해는 물론, 미래에 는 췌장암의 조기 진단, 예방, 치료 등의 임상적 응 용 가능성을 제시할 수 있어1-3 큰 흥미를 끌고 있다.
췌장암의 발생에 가장 많이 알려진 암유전자는 K-ras 유전자 돌연변이로서 췌장암의 70-95%에서 돌연변이성 K-ras 유전자가 관여하고 있음이 보고 되고4-6 있다. 이런 K-ras 돌연변이는 codon 12에 주 로 국한되어 점돌연변이가 발생하는데, 췌장암의 초 기에 작용하며 세포의 성장과 분화 등 세포주기에 영향을 주어 암을 유발한다고 추측하고 있다.7,8 이 런 점돌연변이를 검출하는 것은 암세포를 직접 동 정하는 것으로 조기 췌장암의 진단율을 높이고 만 성 췌장염과의 감별 진단에도 도움이 된다고 기대 되었었으나9-11 최근, 만성 췌장염의 과형성, 이형성 된 췌관 상피세포에서도 K-ras 유전자 돌연변이가 적지않은 빈도로 발견된다는 것이 보고되면서12-14 K-ras 유전자 검출에 의한 조기 췌장암 진단적 효과 는 기대만큼 큰 의미를 주지 않는다고 생각하고 있 다. 한편, p53은 종양억제유전자로서 정상적으로는 손상된 DNA를 수리하고 능동적 세포사(apoptosis) 를 유도하여 세포주기 중 G1 시기에 정지를 일으켜 세포 증식을 막는 역할을 하지만, 유전자에 돌연변 이가 생기는 경우에는 종양 억제 기능이 상실되어 발암 과정에 기여한다고 추측되고 있다.15-17 p53 유 전자 변이는 인체 종양에서 약 50-60%의 고빈도로 발견되는데,18 췌장암에서의 p53 유전자 변이율은 약 40-80%까지 보고19-21하고 있고, 국내에서는 췌장 암 조직에서 p53 돌연변이율은 44.6%로 보고하였 다.22 최근에는 췌장암에서 p53 변이단백과 K-ras 돌연변이를 연구하여 췌장암 발암 과정에서의 유전 자적 이해와 더불어 진단, 임상적 예후와 관련지어 보고자 하는 연구들23-26이 시행되고 있다. 본 연구의 목적은 췌장암이나 만성 췌장염에서 p53 단백 발현 과 K-ras 유전자 점돌연변이의 유전자 검출 양상을 조사하였고 임상적 특성과 비교하여 임상적 의의를 규명하고자 하였다.
대상 및 방법
1. 대 상
1994년 5월부터 1999년 5월까지 단국대학교 의 과대학 부속병원에서 췌장절제 수술을 받았던 43예 를 대상으로 하였다. 대상 질환으로는 26예의 췌관 선암, 12예의 만성 췌장염이었으며 5예의 정상 췌장 조직은 유두부암으로 수술을 받았던 환자들 중 조 직학적으로 정상적인 췌장을 보였던 경우로 하였다.
췌장암군의 평균 연령은 61.4±10.5세, 남녀 비는 17:9, 만성 췌장염군의 평균 연령은 48.6±12.1세, 남녀 비는 9:3이었다. 정상 췌장군의 평균 연령은 65.6±9.8세, 남녀 비는 3:2였다. 대상 환자의 의무 기록을 조사하여 임상 소견의 분석 외에 조직학적 분화도, 병기(1989년 UICC 기준27)를 조사하였으며 생존율은 의무기록의 열람 외에 전화 문의를 통하 여 확인하였다.
2. 방 법
1) p53 면역조직학적 염색
파라핀 포매 조직을 4 μm 두께로 절편하여 xylene에 담그어 파라핀을 제거한 후 알코올로 탈수 하고 조직 내의 비특이적 peroxidase의 작용을 차단 하기 위해 30분간 0.3% H2O2가 섞인 메탄올에 처리 하였다. 상온에서 30분간 10% 정상 염소혈청 (normal gout serum)으로 처리한 후에 일차항체를 4℃에서 PBS buffer로 희석하면서 반응시켰다. p53 단백에 대한 일차 단클론성 항체로는 DO7 (Novo- Castra, Manhasset, NY, USA)을 사용하였다. 이 후 Avidine-Biotin이 부착된 이차항체를 조직 위에 도 포하고 37℃에서 30분간 방치한 후 avidine peroxi- dase로 반응시켰으며 diaminobenzidine으로 발색시 켰다. 발색된 조직은 hemotoxylin으로 대조염색하여 현미경으로 관찰하였다. 100배 시야하에서 염색의 경중에 관계없이 10% 이상인 경우에 양성으로 판정 하였다. p53에 대한 면역조직학적 염색 결과의 판정 으로 양성 대조군은 강양성을 보이는 대장암을, 음 성대조군은 일차항체 처리를 하지 않은 조직으로 하였다.
노임환 외 8인. 췌장암과 만성췌장염에서 p53과 K-ras 돌연변이 631
2) 췌장조직에서의 DN A 추출
절편된 파라핀 포매 조직에서 면역조직화학 염색 에서의 xylene과 알코올 처리로 파라핀을 제거한 후 30분간 0.3% H2O2에 침수시켰다. 조직 1 mg을 14,000 rpm에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 버 리고 lysis buffer 200 μl와 proteinase K (10 mg/ml) 10 μl를 첨가한 후 55℃에서 4시간 반응시켰다. 단 백질 및 기타 불순물의 제거는 phenol-chloroform법 을 이용하였고 DNA의 침전은 3 M sodium acetate (pH 5.2)와 100% 에탄올을 첨가한 후 -20℃에서 밤 동안 저장하였다. 14,000 rpm에서 10분간 다시 원심 분리한 후 상층액을 버리고 70% 에탄올로 세척하고 나서 진공농축기로 20분간 말린 후 멸균된 3차 증 류수 100 μl를 첨가하였다. 분리된 DNA 용액은 사 용할 때까지 -20℃에서 보관하였다.
3) K- ras 유전자의 연쇄중합반응 및 제한효소반응 (P oly m e r a s e ch a in r ea ct ion - r es t r ict ion
f r a g m en t len g t h poly m or phis m ; P CR- RF LP )
K-ras codon 12의 돌연변이를 조사하기 위한 PCR 반응 용액의 조성으로는 10X PCR buffer 5 μl, 25 mM MgCl2 3 μl, 10 mM dNTP 혼합액 1 μl, 100 μM primer 각각 2.5 μl, Taq polymerase (Promega, USA) 2.5 unit와 멸균된 3차 증류수를 40 μl가 되도록 첨가하였다. 여기에 template DNA를 10 μl 추가하여 총 50 μl 반응 용액이 되도록 하였 다. 반응에 사용된 primers의 종류와 염기서열은 다 음과 같다. Sense primer로 A-ACTGAATATAAA- CTTGTGGTAGTTGGACCT를 두 번의 PCR 반응에 사용하였으며 첫 번째 반응의 antisense primer로 B-TCAAAGAATGGTCCTGGACC를, 두 번째 반응 의 antisense primer로 C-TAATATGTCGACTAAA- ACAAGATTTACCTC를 사용하였다. 첫 번째 PCR 반응 조건은 94℃에서 5분, 94℃에서 1분, 55℃ 1분, 73℃ 30초씩 30회 반응 후 73℃에서 7분간 반응시 켰다. K-ras primer의 첫 PCR 산물은 157 bp였으며 첫 PCR 산물 10 μl를 제한효소 Mval (Boeringer- Manheim, Germany) 20 unit를 첨가하여 37℃에서 6
시간 동안 반응시켰다. Mval 제한효소는 정상적인 ras의 codon 12 염기인 GGT를 인지하여 잘라지게 되며 정상형 ras가 제한효소의 처리로 114 bp로 나 타나고 변이형 ras는 codon 12의 돌연변이가 존재하 므로 제한효소의 작용을 받지 못하여 143 bp로 나 타난다. 첫 번째의 Mval 반응 후의 산물 10 μl를 두 번째 PCR의 template DNA로 이용하였다. 두 번째 PCR 반응 조건은 40회 반응시킨 것을 제외하고는 첫 번째 PCR과 동일하게 하였다. 이후 다시 Mval 20 unit를 첨가하여 37℃에서 6시간 반응시켜 10%
agarose gel에서 전기영동하여 밴드를 확인하였다.
두 번째 Mval 제한효소 처리로 정상형 ras는 codon 12에서 잘려져서 106 bp로, 변이형 ras는 Mval의 작 용을 받지 않아 135 bp로 확인되었다. K-ras 점돌연 변이 유전자 검출을 위한 PCR-RFLP법에서 돌연변 이 유전자 양성 대조군으로는 대장암세포주 SW 480을, 음성 대조군으로는 대장암세포주 HT 29를 사용하였다.
4) 통 계
p53 단백 면역조직화학염색과 K-ras 돌연변이 유 전자 검출 성적의 비교는 chi-square test를 사용하였 으며 생존율의 비교는 Kaplan-Meier 방법을 이용하 여 도식화한 후 Log-Rank test로 통계적 의의를 검정 하였다. 통계적 유의성은 p<0.05인 경우로 하였다.
결 과
1. 췌장암의 임상적 특성
26예의 췌장암군의 임상적 특성을 조사한 결과 종양의 위치는 췌장두부가 21예(80.8%), 체부 및 미 부가 5예(19.2%)였으며, 종양의 크기는 4 cm 이상 인 경우 13예(50.0%), 4 cm 미만인 경우가 13예 (50.0%)였다. 종양의 세포 분화도는 분화도가 좋은 경우 3예(11.5%), 중등도인 경우가 13예(50.0%), 나 쁜 경우가 10예(38.5%)였다. 림프절 전이가 있었던 경우는 15예(57.7%), 없었던 경우가 11예(42.3%)였 다. 원격전이는 전 예에서 없었다. 1989년 UICC의 기준에 의한 병기로는 제1병기 11예(42.3%), 제3병 기 13예(50.1%), 제4병기 2예(7.7%)였다(Table 1).
632 The Korean Journal of Gastroenterology : Vol. 35, No. 5, 2000
2. p53 단백 발현율 및 K- ras 돌연변이 유전자 검출률
정상 췌장조직에서 p53 단백 발현은 관찰되지 않 았다. 26예의 췌장암 조직에서 p53 단백 발현율은 16예로서 61.5%였고(Fig. 1) 만성 췌장염에서는 12 예 중 3예인 25.0%에서 p53 단백 발현이 관찰되었 다(Table 2). K-ras 돌연변이 유전자는 정상 췌장조 직에서는 관찰되지 않았고 췌장암조직에서는 76.9%
(20/26예), 만성 췌장염에서는 16.7% (2/12예)에서 검출되었다(Table 2, Fig. 2). p53 단백과 K-ras 돌연 변이 유전자가 동시에 발현된 경우는 췌장암에서는 50.0% (13/26예), 만성 췌장염 16.7% (2/12예)였다.
또한 두 가지 유전자 중 한 가지만이라도 양성인 경 우는 96.1% (25/26예)였다.
3. p53 단백 발현 및 K - ras 돌연변이 검출과 임상적 특성과의 관계
p53 단백 발현은 남자 9예(52.9%), 여자 6예 (66.7%)로 성별에 따른 차이는 없었다. 종양의 크기 는 4.0 cm 이상인 경우 p53 단백 발현은 8예 (61.5%), 4.0 cm 미만인 경우 7예(53.8%)에서 양성 Table 1. Clinical Characteristics of the Patients with
Pancreatic Cancer (n=26)
Parameters Number (%) Sex
Male Female
Location of tumor Head
Body/tail Size of tumor
≥ 4.0 cm
<4.0 cm
Cellular differenciation of tumor Well
Moderate Poor
Lymph node metastasis Without
With Tumor stage
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
Ⅳ
17 (65.4) 9 (34.6) 21 (80.8) 5 (19.2) 13 (50.0) 13 (50.0) 3 (11.5) 13 (50.0) 10 (38.5) 11 (42.3) 15 (57.7) 11 (42.3) 0 ( 0.0) 13 (50.1) 2 ( 7.7)
Fig. 1. Immunostaining of p53 protein by DO7 monoclonal antibody. p53 protein is strongly expressed in the pancreatic ductal adenocarcinoma cell(A). However, in the ductal epithelial cell of chronic pancreatitis, p53 protein is not expressed(B)(ABC stain, ×100).
Roe, et al. p53, K-ras Rutation in Pancreatic Cancer and Chronic Pancreatitis 633
으로 크기에 따른 차이도 관찰되지 않았다. 세포 분 화도에서도 분화도가 좋은 경우 2예(66.7%), 중등도 인 경우 8예(61.5%), 미분화인 경우 6예(60.0%)에서 p53 단백이 양성으로 조사되어 분화도에 따른 차이 도 보이지 않았다. 세포 병기에서도 Ⅰ기는 7예 (63.6%), Ⅲ+Ⅳ기는 9예(60.0%)에서 양성으로 병기 와 p53 단백 발현은 큰 관계를 보이지 않았다.
K-ras 돌연변이에서도 성별에서 남자 13예(76.4%), 여자 7예(77.8%)로 통계적 차이는 나타나지 않았다.
종양의 크기에서도 4 cm 이상 경우와 4 cm 미만인 경우에서 모두 각각 10예(76.9%)씩 돌연변이 K-ras 가 검출되어 크기에 따른 차이도 보이지 않았다. 세 포 분화도에서도 분화가 좋거나 중등도이거나 미분 화인 경우에서 K-ras 돌연변이 유전자의 검출은 통 계적으로 유의한 차이가 관찰되지 않았다. 또한 병 기에서도Ⅰ기에서 K-ras 돌연변이는 8예(72.7%)에 서 관찰되었고 Ⅲ+Ⅳ기에서는 11예(73.3%)에서 관 찰되어 병기에 따른 차이도 보이지 않았다(Table 3).
4. p53 단백 발현 및 K - ras 돌연변이 검출과 생존율과의 관계
p53 단백이 발현된 췌장암은 16예로 평균 생존기 간이 13.5±3.4개월이었고 발현되지 않은 췌장암 10 예의 평균 생존기간은 19.8±8.1개월로 p53 단백 발 현이 된 경우 유의하게 생존기간이 짧았다(p=0.035).
그러나 K-ras 돌연변이 유전자는 검출된 췌장암과 비검출 췌장암 간에 생존율의 차이는 관찰되지 않 았다(Table 3).
고 찰
정상적인 p53 단백질은 세포의 증식을 조절하는 가장 강력한 전사인자(transcription factor)로 p53 종 양억제유전자의 돌연변이가 발생되면 손상된 DNA 수복을 위한 세포주기의 G1 정지가 일어나지 않고 손상된 DNA를 가진 상태로 DNA 복제가 일어나게 되어 유전 정보의 변이(mutation)와 재배열(rearran Table 2. p53 Protein Expression and K-ras Mutation in Pancreatic Cancer and Chronic Pancreatitis
Positive p53 immunoreactivity (%) K-ras mutation rate (%) Pancreatic cancer (n=26)
Chronic pancreatitis (n=12) Normal pancreas (n=5)
16/26 (61.5) 3/12 (25.0) 0/5 (0)
20/26 (76.9) 2/12 (16.7) 0/5 (0)
Fig. 2. Detection of codon 12 K-ras point mutation by PCR-RFLP. K-ras mutation is very commonly observed in the pancreatic ductal adenocarcinoma tissue, but in low frequency in chronic pancreatitis tissue. M, 20 bp ladder; P, mutant control (SW 480); N, wild type control (HT 29); lane 1-3, wild type K-ras at 106 bp in chronic pancreatitis; lane 4-6, mutant K-ras at 135 bp in pancreatic cancer.
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gement)에 의해 유전적 불안정성(genomic instabi- lity)이 증폭된다. 이런 변이의 축적에 의하여 세포 는 암세포로의 변환 혹은 암으로 발전할 가능성이 매우 높은 전암단계 상태로 계속 발전한다.17 변이된 p53 단백질은 정상형 단백질보다 더 안정된 형태를 지니고 있어 종양세포에서 고빈도로 존재하게되고 이러한 원리로 면역조직화학염색으로 관찰되는 핵 내 p53 단백질의 축적은 p53 유전자의 돌연변이로 생각될 수 있다.28 또한 p53 유전자 변이율을 알아보 기 위한 연구로 면역조직화학 염색과 염기서열확인 법 혹은 PCR-SSCP (polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism)법 같은 분자학적 분석 방법은 결과가 매우 밀접하게 일치되고 있어29 비교적 용이하게 검색할 수 있는 면역조직화학염색 방법이 흔하게 이용된다. p53 돌연변이가 관찰되는 것은 인체 악성종양의 50-60%에서 관여한다고18 하 며 췌장암에서는 25%에서 88% 정도까지 보고19-21 되는데 이는 사용된 면역조직화학염색에 대한 일차 항체의 종류와 염색된 조직이 파라핀 조직인지 혹 은 신선 조직인지에 따라서도 차이가 있는 것으로 생각되고 있다. 본 연구에서는 췌장암조직에서 61.5%라는 높은 빈도에서 p53 단백 발현을 관찰할
수 있었으며 이는 국내 보고22에 비해 더 높게 조사 되었으나 외국에서의 연구 보고20,26와는 유사하였다.
최근 중국인의 췌장암과 일본인의 췌장암에서 p53 단백 발현율을 조사한 보고30에서 중국인에서는 췌 장암의 71.8%가, 일본인에서는 췌장암의 48.9%가 p53 단백 발현을 보이고 있어 같은 아시아 지역에 서도 차이가 있었고 p53 단백 발현이 중국인의 췌 장암에서는 생존율에 차이가 없었으나 일본인에서 는 생존율에 차이가 있어 p53 단백 발현이 되지 않 은 경우에 생존율이 더 길다고 보고하였다. 본 연구 에서 췌장암의 임상적 특성과 p53 단백 발현을 조 사한 결과 성별, 나이, 종양의 위치, 크기, 세포 분화 도 등에 관계없이 p53 단백이 발현되었다. 그러나 p53 단백 발현이 있는 경우 생존율은 13.5±3.4개월 이었고 발현이 없는 췌장암에서는 19.8±8.1개월로 p53 단백 발현이 된 경우가 생존율이 유의하게 낮 게 조사되었다. 임상적 특성과 p53 단백 발현과는 보고자마다 생존율과 관계 있거나,31,32 세포 분화도 와 관련 있거나,25 림프절 전이와 관계 있다는 보고 가32 있는 한편 림프절 전이, 병기, 분화도, 생존율 등에 전혀 관계없다고 보고하기도33,34 하였다. 그러 므로 변이된 p53 단백과 예후인자와의 관련성은 아 Table 3. Relation between the Expression of p53, K-ras Mutation and Clinical Characteristics in Pancreatic Cancer (n=26)
Parameters
p53 protein
p
K-ras mutation
p value Positive Negative Positive Negative
Sex
Male (n=17) Female (n=9) Size
≥4.0 cm (n=13)
<4.0 cm (n=13) Differenciation
Well (n=3) Moderate (n=13) Poor (n=10) Tumor stage
Ⅰ (n=11)
Ⅲ＋Ⅳ (n=15) Mean survival (months)
9 (52.9%) 6 (66.7%) 8 (61.5%) 7 (53.8%) 2 (66.7%) 8 (61.5%) 6 (60.0%) 7 (63.6%) 9 (60.0%) 13.5±3.4
8 (47.1%) 3 (33.3%) 5 (38.5%) 6 (46.1%) 1 (23.3%) 5 (38.5%) 4 (40.0%) 4 (36.4%) 6 (40.0%) 19.8±8.1
0.95
0.88
0.77
0.83 0.035
13 (76.4%) 7 (77.8%) 10 (76.9%) 10 (76.9%) 1 (23.3%) 11 (84.5%) 8 (80.0%) 8 (72.7%) 11 (73.3%) 15.9±5.5
4 (23.5%) 2 (22.2%) 3 (23.1%) 3 (29.1%) 2 (66.7%) 2 (15.4%) 2 (20.0%) 3 (27.3%) 4 (26.7%) 17.4±6.7
0.94
0.95
0.85
0.87 0.55
노임환 외 8인. 췌장암과 만성췌장염에서 p53과 K-ras 돌연변이 635
직까지는 확실히 정립되지 못하였고 보고자 또는 암의 종류마다 많은 차이가 있다고 하겠다. 국내 보 고22에서는 p53 단백 발현이 생존율과 관계없다고 보고하였으나, 본 연구에서는 p53 단백 발현이 의미 있는 예후인자로 조사되었다. 이 차이는 연구에 사 용된 췌장암의 병기가 국내의 다른 보고22에서는 Ⅲ -Ⅳ기의 매우 진행된 병기가 전체 대상 췌장암의 70% 이상을 차지하고 있는 반면 본 연구에서는Ⅰ기 와 Ⅲ기가 거의 같은 수를 차지하고 Ⅳ기는 2예로 매우 적었기 때문에 대상 환자 선택에 따른 결과의 차이가 있을 것으로 판단되었다.
한편 K-ras 돌연변이 유전자는 췌장암에서 70- 95%의 매우 고빈도로 발견되는 유전자4-6로 거의 codon 12에 국한되어 점돌연변이가 발생하고 췌장 암 중에서도 대부분 선관암종의 발암에 관여하고 다른 조직형의 췌장암에서는 거의 검출되지 않는다.
K-ras 돌연변이 출현빈도는 췌장암의 병기, 림프절 전이, 예후와 관계없다는 보고들35,36이 있으며 예후 인자로서의 K-ras 돌연변이 유전자는 인정되지 않 는 것이 일반적 견해이다. 본 연구에서도 K-ras 돌 연변이 유전자는 췌장암에서 76.9%로 높은 빈도로 발견되었지만 림프절 전이, 병기, 생존율과는 관계 없었다. 과거, K-ras 돌연변이는 췌장암의 초기 발 암 과정에 관여하는 것이 알려지면서 조기 췌장암 의 진단 방법으로 기대를 모았었다. 이는 만성 췌장 염에서는 K-ras 돌연변이가 관찰되지 않고 췌장암 에서만 검출된다는 보고9-11에 근거하였지만 K-ras 돌연변이 유전자를 검출해내는 분자생물학적 방법 이 크게 발전하면서 최근에는 만성 췌장염에서도 적지않게 발견된다는 것이 알려지면서12-14 췌장암의 조기 진단을 목적으로 사용되는 것은 현재 권장되 지 않고 있다. 본 연구 결과에서 만성 췌장염에서 p53과 K-ras 돌연변이는 각각 25.0%, 16.7%에서 관 찰되었다. 그리고 p53 단백과 K-ras 변이가 동시에 발현된 것은 2예인 16.7%에서 있었고 2예 모두 췌 관상피세포가 과형성을 보인 경우였다. 췌장암의 전 암성 병변으로 췌관 상피세포의 과형성, 이형성증에 서 p53 단백과 K-ras 돌연변이를 관찰한 결과26 췌 장암의 발암 단계에도 대장암과 유사한 과형성-이 형성-암의 단계를 거치고 이 과정에서 p53 유전자
변이, K-ras 유전자 변이 같은 유전자 변화가 축적 되어 암이 발생하는 것으로 추측하기도 하였다. 진 단적인 면에서 p53 유전자 변이와 K-ras 유전자 변 이를 순수 췌액에서 조사한 결과,23 췌장암에서는 각 각 42.3%, 84.0%를 보였지만 두 가지 중의 한 가지 만이라도 양성인 경우는 92%로 두 가지 검사를 시 행하여 췌장암의 진단을 더 높일 수 있다고 제시하 였는데, 본 연구 결과에서도 두 가지 검사 중 한 가 지만으로 양성인 경우는 96%로 높지만 만성 췌장염 에서도 25%가 두 가지 중 최소 한 가지 유전자에서 양성이므로 특이도가 낮아 외국의 보고23와는 달리 진단으로 사용되기는 미흡하다고 생각하였다.
결론적으로 췌장암의 발암 과정에는 K-ras 돌연 변이는 물론 p53 유전자 변이도 중요하게 관여되며 만성췌장염에서 K-ras와 p53 단백이 발현되는 것은 과형성 혹은 이형성 등의 병변의 존재와 관련있는 것으로 생각된다. 또한 p53 단백 발현은 생존율 등 의 예후를 예측하는 데 도움을 줄 것으로 생각된다.
요 약
목적: 췌장암의 발생에 가장 많이 관여하는 것으 로 알려진 암유전자는 K-ras 돌연변이 유전자로서 췌장암에서 70-95%의 고빈도로 검출되고있고 상피 세포 과형성이나 이형성 등 전구성 암병변에서도 K-ras 돌연변이가 관계한다고 알려지고 있다. 췌장 암에서 p53 유전자 변이는 예후와 관련 있는 보고 들이 있지만 아직도 논란의 여지가 있다. 본 연구에 서는 췌장암과 만성 췌장염에서 p53 단백 발현과 K-ras 점돌연변이 유전자 검출 양상을 관찰하였으 며 임상적 응용이 될 수 있는지 조사하였다. 대상 및 방법: 대상 검체로는 수술로써 절제된 26예의 췌장암조직과 12예의 만성 췌장염 조직, 5예의 정상 췌장조직이었다. 췌장암은 수술 전 항암치료나 방사 선치료를 시행받은 경우는 없었으며 평균 환자 연 령은 61.4±10.5세, 남녀 비는 17:9, 병기로 Ⅰ기 11 예, Ⅲ기 13예, Ⅳ기 2예이었다. 만성 췌장염의 평균 환자연령은 48.6±12.1세였고 남녀 비는 9:3이었다.
p53 단백질 검출은 탈파라핀 처리된 췌장조직에 D07 monoclonal Ab을 이용하여 면역조직화학염색
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을 하였다. K-ras 점돌연변이 유전자 검출은 조직에 서 DNA를 추출한 후 condon 12 K-ras 돌연변이 유 전자 primer을 이용, PCR-RFLP법에 의해 검출하였 다. 결과: 정상 췌장조직에서 p53과 K-ras 유전자 변 이는 관찰되지 않았다. p53 단백 발현율은 췌장암조 직에서 61.5% (16/26예), 만성 췌장염에서 25.0%
(3/12예)였고 K-ras 유전자 변이율은 췌장암 76.9%
(20/26), 만성 췌장염 16.7% (2/12예)였다. p53과 K-ras가 동시에 발현된 경우는 췌장암에서 50.0%
(13/26예), 만성 췌장염 16.7% (2/12예)였다. K-ras 돌연변이는 췌장암의 연령, 성별, 종양의 크기, 세포 분화도, 병기, 생존기간과 관련이 없었다. p53은 췌 장암의 연령, 성별, 종양 크기, 세포 분화도, 병기와 는 관련이 없었으나 생존기간과는 관련성이 있어 p53 양성인 췌장암 환자군의 생존기간은 13.5±3.4 개월, p53 음성인 환자군에서는 19.8±8.1개월로 p53 양성인 경우 유의하게 생존기간이 짧았다 (P=0.035). 결론: 췌장암의 발암 과정에는 K-ras 유 전자 돌연변이는 물론 p53 유전자 변이도 중요하게 관여되며 만성 췌장염에서 K-ras와 p53 단백이 발 현되는 것은 과형성 혹은 이형성 등의 전암병변의 존재와 관련 있는 것으로 생각된다. 또한 p53 검출 은 예후를 예측하는 데 도움을 줄 것으로 생각된다.
색인단어: 췌장암, 만성 췌장염, p53 면역조직화학 염색, K-ras 돌연변이, 예후
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