Purification of Fructooligosaccharides Using Simulated Moving Bed Chromatography
Nan-Suk Oh, Chong-Ho Lee* and Yoon-Mo Koo†
Department of Biological Engineering, *ERC for Advanced Bioseparation Technology, Inha University, 253, Yonghyun-dong, Nam-gu, Incheon 402-701, Korea
(Received 30 September 2005; accepted 24 November 2005)
요 약
SMB
크로마토그래피 기술을 포도당
,수크로즈
,프럭토 올리고당
(케스토즈
,니스토즈
)의 혼합물 중 프럭토 올리고당을 고순도로 얻기 위해 사용하였다
. SMB운전 조건은 일반적으로 실험 중 칼럼 내에서 발생하는 반응을 고려하지 않는 삼 각형 이론
(triangle theory)이나 정지파
(standing wave)디자인을 따른다
.그러나 칼럼 내에서 반응은 실험 결과에 크게 영 향을 미칠 수 있다
.프럭토 올리고당은 운전 중 가수분해되어 포도당과 과당으로 분해된다
.반응을 바로잡기 위해 가수 분해 후 정상상태에서 각 성분의 농도를 역 추정하였고 이를 모사에 적용하였다
.수크로즈를 제외한 포도당과 케스토즈
,니스토즈의 농도 곡선은 거의 일치했으나 수크로즈는 중간물질이며 가수분해 속도가 프럭토 올리고당에 비해 느리기 때 문에 농축되어 모사 결과와 일치하지 않았다
.프럭토 올리고당은 산성이고 높은 온도 조건에서 더 쉽게 가수분해가 일 어난다
.분리수지에 전 처리를 하여
pH를 조정해 더 낮은 온도에서 실험을 수행하면 가수분해 정도를 감소시킬 수 있다
.Abstract −
The SMB chromatography is used to obtain high purification of fructooligosaccharides (FOS), the mixture of kestose and nystose. SMB operation condition is usually determined by triangle theory or standing wave design when reactions do not occur within columns during experiment. Some of the reactions in columns may considerably affect experimental results. FOS can be hydrolyzed and converted into glucose and fructose during operation. To include the effect of reaction, the concentrations of each component at steady state after hydrolysis were used in simulation. The obtained simulation values are well matched with experimental results except sucrose. For sucrose, the experimental results were different from expected one due to the existence of an intermediate component. FOS is easily hydrolyzed and converted into glucose and fructose in more acidic condition and at higher temperature. Hydrolysis reaction can be prevented by the pretreatment of separation resin with NaOH as well as operation under lower temperature.Key words: Simulated Moving Bed, Fructooligosaccharides, Sucrose, Glucose, Hydrolysis
1. 서 론
올리고당은구성분자 2~10개의당류혼합물로서, 일반적으로저 감미, 보습성이있으며, 난충치성, 저칼로리, 정장작용등과같은생 리적기능성이있다. 올리고당은일본을중심으로 1970년대부터연 구가 진행되었고, 1980년대에 프럭토 올리고당(fructooligosa- ccharides)의상용화를시작하였다. 프럭토올리고당은바나나, 양파,
아스파라거스, 우엉, 마늘, 벌꿀, 치커리뿌리등과같은야채나 버섯, 과일류등식품에다량함유하고있는천연물질이지만그양 이미미하다. 그러므로대량생산을위해Aureobasidium sp[1, 2]나
Aspergillus niger[3]를이용하여수크로즈와과당을결합시키는효 소반응을통해상업적으로생산되고있다. 프럭토올리고당이란수 크로즈의 β(2→1)의위치에과당이결합하여있는모든물질의총 칭을말하며케스토즈(β-D-Fru((2→1)2-α-D-glucopyranoside, GF2)),
니스토즈(β-D-Fru((2→1)3-α-D-glucopyranoside, GF3)), 프럭토퓨란
노실-니스토즈(β-D-Fru((2→1)3-α-D-glucopyranoside, GF4))가있으 며포도당에결합하여있는과당의수에따라 GFn으로나타낸다[4].
Fig. 1에서 GFn의화학적구조식을나타내었다. 프럭토올리고당은
최근건강에유익하고칼로리가적은음식의요구에부응하는식품 첨가제로써각광받고있다. 프럭토올리고당은위에서언급한대 로수크로즈와효소반응을통해생성되므로순수한물질을얻기 위해서는정제과정을반드시거쳐야한다. 그러므로프럭토올리고
†To whom correspondence should be addressed.
E-mail: [email protected]
당의분리공정이매우중요하다. 일반적으로분리정제과정에서쓰 이는방법은크로마토그래피기술로써당분리에널리사용되고있 는 Na+나 Ca2+가첨가된강한산성의양이온교환수지를적용하고 있으며이동상으로는식품에첨가하는물질이므로물을사용하고 있다. 그러나프럭토올리고당은낮은 pH와높은온도에서빠르게 가수분해가일어난다[5, 6]. 물은상온에오랫동안보관할경우 CO2
와반응하여약산성이되고강산성의수지를사용하므로분리공정 중칼럼내의조건이산성이된다. 또한, 당분리공정은높은농도 의당이적용되므로점도때문에높은온도에서운전된다. 그러므 로올리고당이쉽게가수분해되는조건에서이루어진다. 이를개선 하기위해분리수지의전처리공정을거치거나낮은온도에서공 정이이루어져야프럭토올리고당의손실을줄일수있다.
SMB 기술은 1960년초기 UOP사에의해특허를받았고[7, 8], 그 이후응용범위는 p-xylene에서제약분야의이성질체분리[22]와정 밀화학산업[9, 10, 21] 아미노산과단백질[11, 12], 단백질염투석
[13, 23] 등다양한분야의분리까지확대되었다. SMB의기본원리
는칼럼사이의위치를일정시간간격으로움직임으로써고정상과 이동상의향류의흐름을모사하고연속적인분리를가능하게하는
것이다[14~16]. 흡착제와친화력이약해서빨리움직이는물질은액
상의흐름방향으로움직여서 extract로모이고흡착제와친화력이
강해서느리게움직이는물질은고정상의흐름방향으로움직여서
raffinate로모인다. 칼럼은연속적으로연결되어있으며입구는혼
합물과이동상, 출구는 extract, raffinate로구성된다[17, 18]. SMB는 보통 4개의구역으로구성되며입구와출구의위치에따라구분되
고각구역은중요한역할을한다[19]. 기본적인 4개의구역으로구
성되어있는 SMB 단면도는 Fig. 2에나타내었다. SMB 기술은연
속적인분리가가능하며회분식분리공정에비해고농도, 고수율
의생산물을얻을수있다. SMB 실험은분리하고자하는각물질
의흡착도, 확산및분산등의기본적인인자를구한후모사기로 실험을미리예상하고최종적으로 SMB 실험을수행한다. 그러나 모사기는반응을포함하고있지않기때문에실험가동중반응이
일어난다면그결과를예상하기어렵다.
본실험에서는 SMB를이용하여연속적으로프럭토올리고당을 분리하고자하였다. 이번실험에서는분리공정이가동되는동안위 에서언급한대로분리수지의특성으로인해산성이며고온의조건 이므로프럭토올리고당이가수분해가일어나물질의조성이바뀌 게되고실제예상했던실험결과와차이를보였다. 이를바로잡기 위해 SMB 실험종료후 extract와 raffinate에서얻은시료에서가 수분해후정상상태에서각물질의양을역추정하여그농도에서 모사하여실험결과와맞춰보았다.
또한, SMB 실험종료후가수분해반응을감소시키기위해분리
수지를전처리하여 pH를중성에가깝게조정하고온도를낮추었 다. 이때각성분의변화를관찰하고그전과비교함으로써반응이 감소하였음을확인하였다.
2. 실험 방법 및 시약
올리고당은시판되고있는식품첨가제를이용하였고포도당, 수 크로즈, 케스토즈, 니스토즈를포함하고있으며총농도는 45 Brix
이다. 올리고당의전처리과정으로써음이온교환수지와양이온교 환수지를통과시켜착색물질과미량의불순물을제거하였다. 이동 상으로는 3차증류수를사용하였고분리수지는 Finex사에서구입 했으며구조는폴리스타이렌에다이비닐벤젠이가교결합하였으며 황산이온(SO3−)을포함하고있는강산양이온수지로써 Na+가첨가
된형태이다. SMB 실험은구역마다 2개씩, 총 8개의같은칼럼
(21.5 × 2.5 cm)을사용하였으며 Omni사에서구입하였다. 이동상과 혼합물을공급하기위해그리고 extract와 raffinate를수집하기위해 총 4개의펌프가사용되었으며 FPLC 펌프 2개(amersham phamacia biotech), HPLC 펌프 2개(young lin instrument)를이용하여유속을 조정하였다. 이동상은식품으로사용되기위한목적이므로 3차증 류수를사용하였다.
분리수지를전처리한전후의현상비교를위해 4％NaOH를
3.5 ml/min(2 bed/hour)의속력으로충분히포화시킨후 3차증류 수로중성의 pH가 될때까지씻어주었다. 또한, 65oC와 50oC
를비교하여온도가가수분해에미치는영향을관찰하였다. 각조
Fig. 1. Chemical structure of fructooligosaccharides.
n=1: 1-kestose, n=2: nystose, n=3: fructofuranosylnystose
Fig. 2. Schematic explanation of simulated moving bed.
HPLC 시스템이다.
3. 실험결과 3-1. 등온 흡착식의결정
혼합물에포함된주요물질은포도당, 수크로즈, 케스토즈, 니스 토즈로써각각전체의 21％, 24％, 36％, 16％를포함하고있다. 이 네물질의흡착의정도를알아보기위해전단분석의방법을이용하 였다. 혼합물에포함된각양의 20％, 40％, 60％, 80％, 100％총 5단 계로실험하였으며 Fig. 3에나타내었다. 실험을통해얻은값을 (1)
식을적용하여이동상에있는양과고정상에흡착된양의관계를 계산하였으며이를 (2)식을이용하여흡착상수를구하였다[20]. 그 결과는 Table 1에나타내었다.
3-2. 모사와실험결과
실제실험을운전하기전미리실험을예상하는모사과정을거 친다. 운전의최적조건을구하기위해정지파이론을이용하였다.
정지파이론은 SMB 공정디자인을위해 Ma and Wang[15]이개발
하였고앞서당분리와아미노산분리에실험에적용된바있다. 이 론의기본원리는빨리움직이는물질의흡착곡선은구역 IV에, 탈 착곡선은구역 II에서있고또한이와비슷하게느리게움직이는
Fig. 3. Determination of isotherm by frontal test. (a) glucose, (b) sucrose, (c) kestose, (d) nystose.
Table 1. Linear isotherm parameters of glucose, sucrose, kestose and nystose
Glucose Sucrose Kestose Nystose
a 0.4005 0.2372 0.1563 0.0848
R2 0.9999 0.9979 0.9957 0.9881
물질의흡착곡선은구역, 탈착곡선은구역 III에서있어야함에기 초한다. 보통구역 II와 III는물질들의부분적인분리가이루어지 고구역 I과 IV는물질들의오염을방지하기위해깨끗한이동상 이공급될수있도록도와준다. 농도곡선이유지되기위해서각 구역의유량과포트가움직이는속도가중요하며이는물질전달 의영향을받지않는평형디자인과물질전달의영향에의존하는 비평형디자인에서구할수있다. 이실험에서는물질전달의영 향을고려한비평형디자인을적용하였다. 실험에사용된혼합물 은포도당, 수크로즈, 케스토즈, 니스토즈의순서로흡착친화도를 가진다. 프럭토올리고당은 raffinate 위치에서, 포도당, 수크로즈
는 extract 위치에서얻기위해구역1은포도당의탈착곡선, 구역
2는케스토즈의탈착곡선, 구역3은수크로즈의흡착곡선, 구역4는 니스토즈의흡착곡선이각각서있도록디자인하였다. 각성분의
흡탈착곡선은 Fig. 4에나타내었다. 또한, 이이론으로부터구해
얻어진운전조건은 Table 2에표시했으며구한조건으로부터실 험을수행하였다.
위에서언급한대로산성과고온의조건이므로가수분해가 일 어났다. 그러나모사기는반응을반영하지않으므로이를바로잡 기위해실험종료후 각성분의농도를역추정하여그농도로 모사하였다. 역추정한식은 (3)식, 구한농도는 Table 3 그리고
모사와실험을맞춘결과는 Fig. 6에나타내었다. 과당은생성된
물질로실험전에미리예상할수없었기때문에제외하여나타 내었다.
(3)
위식에서는 C는농도를, v는유량을나타낸다.
Fig. 5에서볼수있듯이, 가수분해를고려하지않은농도곡선
은포도당은예상보다높은농도의실험값을, 수크로즈와프럭토 올리고당은가수분해되어예상보다낮은농도실험값을얻었다.
반응을고려하지않을경우농도에서매우큰차이를보인반면
Fig. 6과같이가수분해를고려한농도를적용한모사에서는포도
당과케스토즈, 니스토즈의농도곡선은예상한것과거의일치 하였으며수크로즈의농도곡선은차이를보였다. 그이유는수크 로즈가 프럭토올리고당보다 가수분해되는속도가느리기 때문 에수크로즈의농도가농축되고최종물질인포도당과과당으로 분해되기전의중간물질이기때문에실험결과와일치하지않았다.
3-3. 프럭토올리고당의가수분해
3-3-1. pH의영향
프럭토올리고당가수분해에크게영향을인자중하나는 pH이
CFeed*vFeed C= Extract*vExtract +CRaffinate*vRaffinate
Fig. 4. Design for four zone SMB process : standing wave design.
--- : nystose, -.-.-: kestose, ---: sucrose, ...: glucose Table 2. Operation condition of SMB
Feed 0.30 ml/min
Extract 1.68 ml/min
Raffinate 1.20 ml/min
Eluent 2.59ml/min
Recycle 5.65 ml/min
Switching time 8.52 min
Table 3. Concentration of component in feed before and after Hydrolysis Before(mg/ml)) After(mg/ml)
Glucose & fructose 128.97 345.57
Sucrose 120.39 78.15
FOS 300.6 126.22
Fig. 5. Comparison of experimental and theoretical concentration pro- files: without reaction at the end of a switch time.
(a) --- : simulation of sucrose, ---: simulation of glucose
△
: experiment of sucrose,◆
: experiment of glucose (b) --- : simulation of kestose, ---: simulation of nystose●
: experiment of kestose,□
: experiment of nystose다[5, 6]. 분리수지전처리후칼럼내에서의 pH의변화와 pH의 변화에따른가수분해정도를비교하기위한실험을수행하였다. 실
험은 65oC로온도를고정하고분리수지를 40％ NaOH를처리한
전후의조건에서올리고당혼합물을 12시간동안재순환시키면서
2시간간격으로시료를수집하였다. 이때각시료의 pH를측정하고
HPLC 분석하여성분의변화율을측정하였다. pH의변화량과전처
리전후각성분의변환율은 Fig. 8(a), (b)에나타내었다. pH는전 처리전이후보다더산성을띠었고프럭토올리고당의가수분해 속도가빨랐다. 반응 12시간후전처리전후각각니스토즈는초 기의 5.3％, 33％, 케스토즈는 2.2％, 12.4％, 수크로즈는 42.1％, 67.6％ 로감소하였으며포도당과과당은 347％, 245％증가하였다. 전처 리를함으로써칼럼내의 pH를중성에가깝게유지할수있었고그 결과가수분해반응정도를감소시킬수있었다.
3-3-2. 온도의영향
프럭토올리고당의가수분해에영향을미치는다른요인의하나는 온도이다[5, 6].
위에서언급했듯이당분리공정은약 50 Brix의고농도에서이 루어지기때문에높은점도를지닌다. 그러므로되도록점도를낮 추기위해보통 50oC~65oC의높은온도에서분리가수행된다.
온도의 효과를알아보기위해모두전 처리한수지를이용하여
50oC와 65oC에서각각올리고당혼합물을 12시간동안재순환
시키면서 2시간간격으로시료를수집하여분석하였다. 12시간후
65oC와 50oC의니스토즈는초기의 33％, 88％, 케스토즈는 12％, 78％로감소하였다. 그러나수크로즈는 65oC에서는초기의 67％ 로감소하였지만 50oC에서반대로초기양의 114％로증가하였다.
수크로즈가증가한이유는프럭토올리고당의가수분해반응속도 가 수크로즈보다훨씬빠르고수크로즈의반응속도가 많이감소 하였기때문에역으로양이약간증가한것이다. 또한, 포도당과 과당은 65oC, 50oC에서각각초기양의 245％, 133％로증가하 였다. 온도에따른성분의변화량은 Fig. 8의 (b), (c)를통해비교 할수있다.
3-4.정반응과 역반응에대한실험
프럭토올리고당과수크로즈의양이감소하였고포도당과과당의 양이증가하였으므로가수분해가일어나는것은명확한사실이다.
그러나수크로즈와과당이반응하여프럭토올리고당이생성되거나 포도당과과당이반응하여수크로즈가형성될수있을가능성을확 인하고비가역반응을정확히알아보기위해실험을수행하였다. 실
험결과, Fig. 9와 10에서볼수있듯이수크로즈가생성되거나프럭
토올리고당이생성되지않았다. 그러므로가수분해반응은역반
응이일어나지않는연속적인비가역반응으로 (4~6)식으로나타
낼수있다.
k3
GF3→GF2+ F (4)
k2
GF2→GF + F (5)
Fig. 6. Comparison of experimental and theoretical concentration pro- files: with reaction at the end of a switch time.
(a) --- :simulation of sucrose, ---: simulation of glucose
△
: experiment of sucrose,◆
: experiment of glucose (b) --- : simulation of kestose, ---: simulation of nystose●
: experiment of kestose,□
: experiment of nystoseFig. 7. The pH change in column.
■
: without NaOH 65oC,○
:with NaOH, 65oC,▲
:with NaOH, 50oC.k1
GF→G + F (6)
G: 포도당, F: 과당, GF: 수크로즈, GF2: 케스토즈, GF3: 니스토즈
4. 결 론
프럭토올리고당과같이유용한물질이혼합물에섞여있다면이 를정제하는분리공정이매우중요하다. 현재프럭토올리고당의분 리정제는크로마토그래피기술을널리이용하고있으며이번실험 에서는연속적인분리공정인 SMB를적용하였다.
분리수지로써단당분리공정에도널리사용되고있는염이첨가 된강산의양이온교환수지와이동상으로물을사용하므로산성의 상태에서그리고점도의문제때문에고온에서운전된다. 이조건 에서는가수분해가일어나물질조성의변화를가져온다. 그러나
SMB의최적운전조건을결정하기위한디자인이나모사기는반응 을포함하고있지않아반응이일어나면그결과를예측하기어렵다. SMB는새로운물질이연속적으로혼합물위치로도입되므로반 응의초기나말기상태가아닌반응의중간상태에서분리가이루 어지며프럭토올리고당과같은물질은연속적인반응이므로매우
Fig. 8. Hydrolysis of fructooligosaccharides in columns as a function time.
□
: glucose and fructose,●
:sucrose,▽
:kestose,▲
: nystose (a): with NaOH, 65oC(b): without NaOH, 65oC (c): with NaOH, 50oC
Fig. 9. Hydrolysis of sucrose in columns as a function time.
□
: glucose,●
: fructose,▽
: sucrose,▲
: total concentrationFig. 10. Changes of concentrations in columns as a function time.
□
: glucose,●
: fructose감 사
본연구는한국과학재단의인하대학교초정밀생물분리기술연구 센터(ERC)의지원과 CJ(주)의협조를받아수행하였습니다.
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