The Effects of Bee Venom on Tumor Necrosis Factor (TNF)-${\alpha}$ Induced Inflammatory Human HaCaT Keratinocytes

45(3) : 256∼ 261 (2014)

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Tumor Necrosis Factor (TNF)-α로 유도된 피부각질형성세포의 염증성 반응에서 봉독의 효과

이우람¹·김경현¹·안현진¹·김정연¹·한상미²·이광길²·박관규^1*

1대구가톨릭대학교 의과대학 병리학교실, ²농촌진흥청 국립농업과학원

The Effects of Bee Venom on Tumor Necrosis Factor (TNF)-α Induced Inflammatory Human HaCaT Keratinocytes

Woo-Ram Lee¹, Kyung-Hyun Kim¹, Hyun-Jin An¹, Jung-Yeon Kim, Sang-Mi Han², Kwang-Gill Lee², and Kwan-Kyu Park¹*

1Department of Pathology, Catholic University of Daegu, College of Medicine

2Department of Agricultural Biology, National Institute of Agricultural Science and Technology

Abstract − Bee venom (BV) therapy has been used as a traditional medicine to treat a variety of conditions, such as arthritis, back pain, cancerous tumors, and skin diseases. However, regulatory effects of BV on tumor necrosis factor (TNF)-α-induced HaCaT cell migration or anti-inflammatory have not been explored. In the present study, we investigated the effects of BV on HaCaT cell migration and anti-inflammation. HaCaT cell migration was evaluated by wound-healing assay. The pro-inflam- matory cytokines such as TNF-α, interleukin (IL)-1β, and IL-8 were examined by ELISA or Western blotting. BV treatment led to an increase in migration of HaCaT cells for 24 and 48 h. Especially, 10 ng/ml of BV were significantly increased HaCaT cell migration. Also, BV suppressed the secretion of TNF-α, IL-1β, and IL-8 in culture medium with HaCaT cells. In addition, Western blot results demonstrate that BV suppressed the expression of TNF-α and IL-1β‚ in HaCaT cells. Especially, 1 or 10 ng/ml of BV markedly decreased the expression of pro-inflammatory cytokines. These results demonstrate the potential of BV for the prevention of skin inflammation induced by TNF-α.

Key words − Bee venom, TNF-α, Migration, Inflammation, Cytokines

피부는 다양한 환경적인 요인에 대해 신체를 보호하는 물 리적 장벽으로서 자외선 등의 물리적 자극, 혹은 화학적 자 극으로부터 내부 장기를 보호하며 항상성을 유지하는데 중 요한 역할을 담당 한다.¹⁾ 피부는 표피, 진피, 피하지방으로 구성되어 있으며, 피부각질형성세포는 표피세포의 대부분을 구성하는 성분으로서 각질을 형성하고 여러 cytokine을 생 산하여 다양한 염증반응과 면역반응에 관여한다.^2,3) 피부각 질형성세포가 환경적, 생리적 스트레스에 노출되면 염증반 응이 일어나고, 이로 인해 tumor necrosis factor(TNF)-α와 interleukin(IL)-1β 같은 여러 종류의 염증성 cytokine 등을 분비하게 된다.^4,5) 이러한 cytokine들은 피부각질형성세포의 증식 속도를 감소시키고, 진피 층의 기질형성을 방해 함으 로서 손상된 피부의 치유 속도를 저하시키게 된다.^6,7) 따라

서, 염증성 피부질환에 피부각질형성세포의 증식은 중요한 역할을 수행하며, 피부의 노화, 아토피성 피부염, 건선 등과 같은 피부질환과 밀접한 관련이 있다.⁸⁾ 이와 같은 피부염증 질환은 많은 사람들을 의학적, 심미적 관점에서 고통을 받 게 한다.⁹⁾현재까지 이들 피부 질환의 치료로서 피부의 수 분 유지, 면역계 염증반응 조절을 위한 스테로이드 등이 흔 히 사용되어 왔으나, 이러한 치료방법은 일시적으로 증상을 완화시키는 역할을 할 뿐이거나 또는 과량 사용 시 부작용 을 초래하는 단점을 지니고 있다.^10,11) 따라서 이러한 문제 를 보완할 수 있는 천연물 유래의 약리효과가 높고 부작용 이 낮은 피부 염증질환 치료제 개발에 대한 연구가 필요한 실정이다.

순수 천연물질이면서 강력한 항균, 항염증 효과를 갖는 봉독은 오래 전부터 관절염, 통풍 등의 질환에 사용되어 오 고 있다.¹²⁾ 봉독의 주요 성분은 약 40여 가지가 밝혀져 있

*교신저자(E-mail):[email protected] (Tel): +82-53-650-4149

고, 비중은 1.1313, ph는 5.2~5.5이며 성분은 크게 peptide components, non peptide components, enzyme등으로 구성 되어 있다.¹³⁾ 건조봉독의 약 50%를 차지하는 peptide component는 melittin, apamin, mast cell degranulating peptide등이며 이들 성분은 일반적으로 진통, 소염, 뇌하수 체 호르몬 분비 촉진과 함께 혈액순환 촉진 등의 작용을 하 는 것으로 알려져 있다.¹⁴⁾ 이 등의¹⁵⁾ 연구에서는 여드름 균 으로 유도된 염증성 피부질환 동물모델에서 봉독의 피부염 증 억제효과에 대한 가능성을 제시한 바 있으며, 한 등의¹⁶⁾ 연구에서는 국내산 정제봉독이 여드름 피부상태를 지닌 10, 20, 30대 남녀 12명을 대상으로 에센스 타입 봉독화장품의 여드름 피부 개선 효과에 관하여 보고한 바 있다. 또한, 봉 독은 암과 후천성 면역 결핍증, 면역관련 질환치료제에 이 르기까지 다양한 연구가 이루어지고 있다.^17,18) 이 외에도 다 양한 질환에서 봉독의 항염증 및 항균 효과에 관한 연구가 이루어지고 있으나, TNF-α로 유도된 피부각질형성세포의 증식과 염증억제에 관한 연구는 미비한 실정이다.

이에 본 연구에서는 국내산 서양종 꿀벌에서 분리, 정제 한 봉독이 TNF-α로 유도된 피부각질형성세포의 염증반응 에서 다양한 농도를 처리하였을 때, 피부각질형성세포의 증 식과 염증관련 cytokines의 활성에 미치는 영향에 대하여 알 아보고자 한다.

재료 및 방법

시험 물질 − 본 실험에 사용한 봉독은 농촌진흥청의 국립 농업과학원에서 사육 중인 서양종 꿀벌(Apis mellifera)로부 터 봉독채집장치(청진테크, 안산, 한국)를 이용하여 봉독을 분리하였고, 불순물을 제거하여 순수 정제 봉독(purified bee venom)을 취하였다.¹⁹⁾ 취한 봉독 추출물은 -20^oC에서 보관 하고, 투여 직전 멸균 수에 용해시킨 후 필요한 농도로 희 석하여 사용하였다.

세포주 및 세포 배양 − 본 연구에서는 피부각질형성세포 주인 HaCaT 세포를 사용하였다. HaCaT 세포는 일정한 습 도와 온도가 유지되는 37^oC에서 95% O₂와 5% CO₂의 혼 합기체를 공급해주면서 초기배양(5×10⁵ cells/ml) 농도로 배 양하였다. HaCaT 세포는 용기표면에 부착하도록 배양한 후 TNF-α를 100 ng/ml 농도로 처리하여 인위적 독성의 최적 유발 조건을 검토한 다음 순수 정제 봉독을 1, 10, 100 ng/

ml 농도로 투여하여 세포의 변화를 확인하였다.

Wound-healing Assay− 세포 배양용 6 well plate에 HaCaT 세포를 5×10⁵ cells/ml로 배양한 후 PBS로 세척하여 FBS가없는 배지로 overnight 배양하였다. 200 µl Yellow tip 을 이용하여 단일 세포층을 긁은 후 PBS로 1번 세척해 주 었다. 그 후 봉독을 농도 별로(1, 10, 100 ng/ml) 처리하여 24, 48시간 CO₂ 배양기에서 배양하였다. 세포이동성 평가

는 24, 48 각 시간 마다 현미경을 통해 사진 촬영하였고 긁 혀진 면적을 측정하였다. 이때, 0시간은 세포를 긁은 직후 를 말한다. 면적 측정은 촬영 된 사진의 긁혀진 면적을 측 정하여 24, 48시간 동안의 이동 거리를 측정하였다.

TNF-α, IL-1β와 IL-8의 발현 측정 − 봉독이 HaCaT 세 포의 TNF-α, IL-1β와 IL-8의 생성에 미치는 영향을 알아보 기 위하여 enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) kit (R&D, MN, USA)를 이용하여 측정하였다. TNF-α, IL-1β 와 IL-8의 일차항체와 이차항체를 순서대로 반응시키고 3,3',5,5'-tetramethyl benzidine을 첨가하여 발색시킨 다음 ELISA reader로 450 nm에서 흡광도를 측정하였으며, TNF- α, IL-1β와 IL-8 표준용액을 이용한 그래프로부터 시료의 농도를 환산하였다.

단백질 분리와 Western Blot 분석 − 분리한 HaCaT 세 포를 60 mm 배양 dish에 5×10⁵ cells/ml이 되도록 분주하여 부착시킨 다음, 봉독과 TNF-α를 함께 처리하여 8시간 배양 하였다. 배양된 세포를 회수하여 IPH lysis buffer(50 mM pH 8.0 Tris, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.5% NP-40, 100 mM PMSF, 1 mg/ml leupeptin, 1 mg/ml aprotinin and 1 M DTT)를 첨가한 후 4^oC에서 15분간 lysis시키고, 12,000 rpm에서 30분 동안 원심 분리 후 단백질을 분리하 였다. 분리한 단백질을 Bradford법(Bio-Rad Laboratories, CA, USA)으로 정량 하였으며, 정량한 단백질은 SDS-PAGE 로 전기영동하고 PVDF membrane(Milipore, MA, USA)에 옮겼다. Membrane은 일차 항체 항IL-1β(Santa Cruz Biotechnology, CA, USA)와 항TNF-α(Santa Cruz Biotech- nology, CA, USA) 와 반응시키고 TBS-T로 15분간 2회 세 척 후 membrane을 2차 항체로 2시간 반응시켰다. 항체들에 대한 발현 분석은 horseradish peroxidase-linked(HRP) 이차 항체에 의해 발현되는 enhanced chemiluminescence(ECL) Western Blot Analysis(Amersham, NJ, USA)시스템을 이용 하였으며 X-ray 필름에 현상한 후 Science Lab 2005 (Fujifilm, Japan)를 이용하여 비교 분석 하였다.

통계처리 − 실험의 분석결과는 각각의 군별로 평균과 표 준편차(mean±S.D.)를 사용하여 표기하였으며, 모든 자료는 SPSS 프로그램(Statistical Package for Social Science, SPSS Inc., IL, USA)을 이용하여 처리하였고, 반복측정에 의한 ANOVA test를 적용하여 유의도 수준 p<0.05에서 확 인하였다.

결과 및 고찰

봉독이 HaCaT 세포의 이동에 미치는 영향 − 피부의 각 질형성세포는 면역 및 염증 반응과 세포 증식에 관여하는 다양한 cytokine 및 성장 인자를 생산 함으로서, 피부의 항 상성 유지에 중요한 역할을 수행한다.¹⁹⁾ 본 연구에서는 봉

독이 피부각질형성세포의 이동 능력에 어떠한 영향을 미치 는가에 대하여 알아보고자 Wound-healing assay를 실시하 였다. 단층으로 균일하게 자란 HaCaT 세포에 멸균 Tip으로 긁은 후 실선 안의 세포를 모두 제거하였다. 그 후, 24시간 동안 배양하여 세포가 제거된 실선 안의 영역으로 세포가 이주되는 정도를 실험 군 별로 비교 관찰하였다. 그 결과, 아무런 물질도 처리하지 않은 세포는 Tip으로 긁은 직 후의 세포와 비교해 약간의 이동능력을 관찰할 수 있었다(Fig. A, B). 이에 반해, 봉독을 농도 별로 처리한 세포에서는 세포 이동이 증가하는 현상을 관찰할 수 있었다. 특히, 10 ng/ml 의 봉독을 처리한 세포에서 가장 많은 세포 이동능력을 관 찰 할 수 있었다(Fig. 1C-E). 또한, 같은 방법으로 봉독을 48 시간 처리하였을 때에도 유사한 결과를 관찰할 수 있었다 (Fig. 2). 이러한 결과를 미루어 볼 때 봉독은 HaCaT 세포 의 이동 능력을 증가시키는데 효과가 있는 것으로 사료되 고 특히, 10 ng/ml농도의 봉독이 다른 농도보다 더 효과가 있는 것으로 확인되었다. 100 ng/ml농도의 봉독은 10 ng/ml 의 봉독보다 세포독성이 있어 효과가 떨어지는 것으로 사 료된다.

봉독이 TNF-α, IL-1β와 IL-8의 발현에 미치는 영향 − TNF-α와 IL-1β는 대표적인 염증성 cytokine으로서 발현양 이 증가하면 염증성 피부질환을 심화시키는 것으로 알려져

있다.^21,22)종양괴사인자인 TNF-α는 많은 염증반응에서 가

장 중추적 역할을 하는 중요인자로서 대식세포나 림프구 등 백혈구에 의해 생성된다. 이는 정상 상태에서는 생성되지 않으나, 다양한 요인에 의해 세포가 자극을 받으면 합성되 어 분비 되는 것으로 알려져 있다.^23,24) IL-1β는 급성 혹은 만성 염증반응의 초기반응에 관여하여 염증의 발생 및 진 행 과정에서 중요한 역할을 한다. 또한, IL-8은 CXC chemokine으로서 백혈구의 탈 과립을 유도하여 염증세포들 이 자극부위로 모여들게 하여 염증반응을 촉진시키는 기능 을 한다.²⁵⁾ 따라서 TNF-α, IL-1β와 IL-8의 합성 조절은 염 증성 질환에서 중요한 역할을 한다.^26,27)본 연구에서는 ELISA실험을 통해 TNF-α, IL-1β와 IL-8의 발현양을 관찰 하였다. TNF-α(100 ng/ml)를 8시간 동안 단독 처리한 세포 에서는 TNF-α, IL-1β와 IL-8의 발현양이 아무것도 처리하 지 않은 정상 대조군에 비해 현저히 증가하는 현상을 관찰 할 수 있었다. 반면, 봉독을 함께 처리한 세포에서는 TNF- α, IL-1β와 IL-8의 발현양이 감소되는 것을 관찰할 수 있었 다. 특히, 10 ng/ml 농도의 봉독이 다른 농도 보다 더 효과 가 있는 것을 관찰할 수 있었다. 한 등의²⁸⁾ 연구에 따르면 human dermal fibroblast에서 적정 농도 이상의 봉독은 세포 독성을 보이는 것을 보고한 바 있다. 따라서 본 연구에서도 100 ng/ml농도의 봉독은 세포독성으로 인해 효과가 떨어지

Fig. 1. Effects of bee venom (BV) on migration of HaCaT cells. HaCaT cells were scratched using 200µl sterile pipette tip.

Migration levels of HaCaT cells were observed using the optical microscope and photographs were obtained. HaCaT cells were treated with different concentrations of BV (1, 10, 100 ng/ml) for 24 h. BV treatment led to an increase in migration of HaCaT cells. Especially, 10 ng/ml of BV were significantly increased the HaCaT cells migration. (A) None treatment cell (0 h), (B) None treatment cell (24 h), (C) 1 ng/ml of BV treatment cell (24 h), (D) 10 ng/ml of BV treatment cell (24 h), (E) 100 ng/ml of BV treatment cell (24 h). Data were expressed as means±S.D. *p<0.05 compared to the A group, ^†p<0.05 compared to the Bgroup.

는 것으로 사료된다. 이러한 결과는 TNF-α는 HaCaT 세포 에서 염증반응을 유도하는 것으로 여겨지며, 적절한 농도의 봉독은 대표적 염증성 cytokine인 TNF-α와 IL-1β의 발현 양을 억제 함으로서 염증성 피부질환을 완화시킬 수 있을 것으로 생각된다.

봉독이 염증성 Cytokines 발현에 미치는 영향 − 우리는

선행연구를 통해 봉독은 여드름 유발균인 Propionibacterium acnes의 활성과 염증반응을 억제시킴으로써 염증성 여드름 에 대한 치료 효과를 증명한 바 있다.¹⁵⁾ 특히, 봉독은 염증 이 유발된 동물모델에서 대표적 염증성 cytokine인 TNF-α 와 IL-1β의 발현을 조절 함으로서 염증반응을 억제하였다.

따라서 본 연구에서는 각질형성세포에서 TNF-α와 IL-1β의 Fig. 2. Effects of bee venom (BV) on migration of HaCaT cells. HaCaT cells were scratched using 200µl sterile pipette tip.

Migration levels of HaCaT cells were observed using the optical microscope and photographs were obtained. HaCaT cells were treated with different concentrations of BV (1, 10, 100 ng/ml) for 48 h. BV treatment led to an increase in migration of HaCaT cells. Especially, 10 ng/ml of BV were significantly increased the HaCaT cells migration. (A) None treatment cell (0 h), (B) None treatment cell (48 h), (C) 1 ng/ml of BV treatment cell (48 h), (D) 10 ng/ml of BV treatment cell (48 h), (E) 100 ng/ml of BV treatment cell (48 h). Data were expressed as means±S.D. *p<0.05 compared to the A group, ^†p<0.05 compared to the Bgroup.

Fig. 3. Effect of bee venom (BV) on TNF-α-induced HaCaT cells. The HaCaT cells were cultured with presence or absence of BV for 8 h, followed by TNF-α treatment. The ELISA results demonstrate that BV suppressed the secretion of TNF-α (A), IL-1β (B), and IL-8 (C) in culture medium with HaCaT cells. Especially, 10 ng/ml of BV were significantly suppressed TNF-α, IL-1β, and IL-8 secretion. Data were expressed as means±S.D. *p<0.05 compared to the normal control, ^†p<0.05 compared to the only TNF-α treatment cells.

발현변화를 Western blot을 통해 관찰하였다. TNF-α(100 ng/ml)를 8시간 동안 단독 처리한 세포에서는 TNF-α와 IL- 1β 발현양이 크게 증가하는 모습을 확인할 수 있었다. 이에 반해, 봉독을 함께 처리한 HaCaT 세포에서는 1 또는 10 ng/

ml의 농도에서 TNF-α와 IL-1β 발현양이 현저히 감소되는 것을 관찰할 수 있었다. 이는, ELISA 실험 결과와 유사한 결과로서 봉독은 염증이 유도된 동물모델뿐만 아니라 염증 성 세포모델에서도 염증억제 효과가 있는 것으로 생각된다.

결 론

봉독에 대한 연구는 항염증 및 항균효과와 관련하여 다양 한 질환에서 연구가 활발히 진행되고 있다. 그러나 염증성 피부질환에 봉독이 미치는 영향에 관한 연구는 미비한 실 정이다. 따라서 본 연구에서는 TNF-α(100 ng/ml)를 처리한 인간각질형성세포주인 HaCaT 세포에서 봉독이 세포 이동 에 미치는 영향과 항염증 효과를 조사하여 다음과 같은 결 론을 얻었다.

1. 봉독은 HaCaT 세포의 이동 능력을 증가시키는데 효과 가 있는 것을 wound-healing assay를 통해 관찰하였다. 특 히, 10 ng/ml농도의 봉독을 처리하였을 때 가장 효과가 있

는 것을 확인하였다.

2. TNF-α를 8시간 동안 단독 처리하였을 때 TNF-α, IL- 1β와 IL-8의 발현이 정상 대조군에 비해 현저히 증가하였 고, 이러한 결과로 TNF-α가 HaCaT 세포의 염증을 유도하 는 것을 확인하였다.

3. 적절한 농도의 봉독은 염증이 유도된 HaCaT 세포에서 대표적 염증성 cytokines인 TNF-α와 IL-1β의 발현을 억제 하였다. 또한, chemokine중의 하나인 IL-8의 발현을 조절하 는 것을 분자생물학적 실험 기법을 통해 확인하였다.

봉독은 피부각질세포의 이주능력을 증가시켰고 대표적인 염증유발 인자인 TNF-α와 IL-1β의 활성을 억제함으로써 염 증반응에 효과가 뛰어난 것으로 사료된다. 또한, 천연물인 봉독은 약리효과가 뛰어나며 부작용이 적어 염증성 피부질 환 예방물질로서의 개발 가능성이 있다고 생각되며, 궁극적 으로 피부건강에 있어 선제적 예방 차원의 근거자료로 활 용될 수 있을 것으로 사료된다.

사 사

본 논문은 농촌진흥청 차세대바이오그린21사업(과제번:

PJ009519)의 지원에 의해 이루어진 것임.

Fig. 4. Bee venom (BV) effectively inhibits pro-inflammatory cytokines in TNF-α-induced HaCaT cells. The HaCaT cells were cultured with presence or absence of BV for 8 h, followed by TNF-α treatment. Western blot result demonstrate that BV suppressed the expression of TNF-α (A) and IL-1β (B) in HaCaT cells. Especially, 1 or 10 ng/ml of BV markedly decreased the expression of pro-inflammatory cytokines. Data were expressed as means±S.D. *p<0.05 compared to the normal control, ^†p<0.05 compared to the only TNF-α treatment cells.

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