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J. Mushrooms 2015 March, 13(1):30-36 http://dx.doi.org/10.14480/JM.2015.13.1.30 Print ISSN 1738-0294, Online ISSN 2288-8853
© The Korean Society of Mushroom Science
*Corresponding author E-mail : [email protected]
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Received February 12, 2015Revised March 18, 2015 Accepted March 20, 2015
아위버섯 추출물의 혈전용해, 트롬빈저해, 항산화 및 항염증 활성
김은정·김준호1,*
상지대학교 임상병리학과,
1상지대학교 정밀화학신소재학과
Fibrinolytic, thrombin inhibitory, anti-oxidative and anti-inflammatory activities of Pleurotus ferulea
Eun-Jung Kimand Jun-Ho Kim1,*
Department of Biomedical Laboratory Science, Sangji University, Wonju 220-702, Korea
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Department of Fine Chemistry and New Materials, Sangji University, Wonju 220-702, Korea
ABSTRACT: Our study investigated the fibrinolytic, thrombin inhibitory, anti-oxidative and anti-inflammatory activities of the water extract and solvent fractions isolated from Pleurotus ferulea. Fibrinolytic activity was investigated using the fibrin plate method. Thrombin inhibitory activity was used to analyze thrombin inhibitor assay. The DPPH assay was used to estimate anti- oxidative activity. Inhibition of NO production was measured for anti-inflammatory activity in LPS-activated murine RAW 264.7 macrophage cells. An MTS assay was used to evaluate the effects of the water extract and solvent fractions isolated from Pleurotus ferulea on cell viability. Our results showed the fibrinolytic activity to be strong in the ethyl acetate fraction at 1.33 plasmin units. The ethyl acetate fraction also showed high thrombin inhibitory activity at 94.45%. The anti-oxidative activity of the water extract was 37.01% and the anti-inflammatory activity of the chloroform fraction was 98.13%. These findings suggest that Pleurotus ferulea's extract and fractions could be applicable in the development of functional foods for the treatment and prevention of cardiovascular diseases.
KEYWORDS: Pleurotus ferulea, Fibrinolytic activity, Thrombin inhibitory activity, Anti-oxidative activity, Anti-inflammatory activity
서 론
최첨단의 시대를 살고 있는 현대인들은 스트레스, 환경 오염 및 고령화로 인해 인간의 평균수명 연장과 삶의 질 에 대한 관심이 더욱 증가하면서 노후에 닥칠 성인병을
예방하기 위한 식생활에 다양한 생리활성을 갖는 식품재 료를 이용하려는 경향이 더욱 증가되고 있는 추세이다.
오래 전부터 식용뿐 아니라 약용으로도 이용되어 왔던 버 섯에 대한 다양한 효과가 밝혀지면서 기능성 식품의 재료 인 버섯에 대한 관심이 증가하고 있다.
최근 통계청 자료에 의하면 한국인의 사망원인으로 혈 관계질환이 크게 증가하는 것으로 보고되고 있다. 이 같 은 성인병은 발생하면 많은 비용과 함께 긴 시간을 요구 하기에 치료도 중요하지만 예방이 최선이다. 따라서 혈관 계질환을 식단으로부터 조절하려는 노력과 함께 다양한 기능성 식품 및 음료 개발들이 시도되고 있다.
심혈관계 질환의 치료와 예방을 위한 기능성 식품과 음료 개발에 사용할 목적으로 일상적으로 섭취 가능한 식용버섯에서 항산화, 항염증, 혈전용해 및 트롬빈저해 활성에 대한 연구들이 많이 이루어지고 있다. 식품은 유 효성분이 미량 함유되어 있어도 장기간 섭취 가능하므로 여러 가지 부작용을 일으키는 의약품에 비해 많은 장점 을 갖고 있다. 심혈관계 질환 예방 및 치료와 관련된 활
성을 갖고 있는 것으로 알려진 팽이버섯(Shin and Choi, 1998), 과 뽕나무버섯(Kim and Kim, 1999)으로부터 활 성이 큰 혈전용해효소와 능이버섯(Kang et al., 2011)의 항고혈압성 활성과 차가버섯의 혈소판 응집 저해활성 (Hyun et al., 2006)등이 확인되었다. 또한 상황버섯 (Choi et al., 1996), 표고버섯(Chihara et al., 1970) 및 구름버섯(Tsukagoshi and Ohashi, 1974)들에서 다당류 가 항암물질임이 밝혀졌다.
혈관내의 혈액응고계와 섬유소용해계는 균형을 유지 하고 있다. 그러나 혈관이 손상을 받으면 출혈이 일어나 고 손상 부위에 혈소판이 점착되고 섬유소원이 함께 응 집체를 형성하며 트롬빈이 작용하여 섬유소원을 섬유소 로 변화시켜 섬유소와 혈소판으로 이루어진 불용성의 혈전이 형성된다. 조직이 재생되면 생성되었던 혈전은 용해되어야 한다. 혈액내의 프라즈민에 의해 섬유소와 섬유소원이 분해되지만 혈액응고가 과다하게 이루어질 경우 혈전이 완전히 용해되지 않고 혈관을 따라 흐르며 혈액의 흐름을 방해하여 혈전증인 뇌졸중과 심근경색증 등 혈관계 질환을 유발한다. 따라서 혈전을 혈전용해 물 질로 분해하여 혈관계질환을 치료하거나 혈전형성의 필 수효소인 트롬빈의 활성을 억제하여 혈전생성 억제로 혈관계질환을 예방할 수 있다. 기존의 혈전용해제는 혈 전에 대한 선택성이 적어 장기간 복용 시 면역반응과 같은 부작용이 나타나고 비용이 비싼 단점이 있어 새로 운 혈전용해제 및 활성이 큰 트롬빈 저해제의 개발이 필요하다.
아위버섯(Pleurotus ferulea)은 새송이버섯의 변이종 으로, 담자균류의 느타리버섯과(Pleurotaceae) 느타리버 섯속(Pleurotus)에 속하는 버섯으로 중앙아시아 일대의 초원에서 자생하는 아위(Ferula assa-foetida)라는 약용 식물에 기생 혹은 부생하는 버섯으로 비타민C와 비타민 E를 다량 함유하고 있어 높은 항산화(Hong et al, 2004a), 콜레스테롤저해, 포도당 흡수저해 그리고 유해산소제거 (Hong et al, 2004b)등의 효과가 있는 것으로 보고되 었다.
본 연구는 식용과 약용으로의 이용 기대치가 높은 아위 버섯을 혈관계질환 관련 기능성 식품 재료로 사용하기 위 해 실온에서 준비한 아위버섯 물 추출물과 유기용매 분획 물의 혈전용해, 트롬빈저해, 항산화효과를 확인하고 대식 세포주인 RAW 264.7 cell을 이용하여 대식세포 활성 및 항염증 효능을 확인하였다.
재료 및 방법
실험재료
본 실험에 사용한 아위버섯(Pleurotus ferulea)은 (주)뜰 아채 세화종균 개발원(충남 천안시 동남구 풍세면)에서 제공한 버섯자실체를 동결 건조시켜 분말 상태로 냉동고
에 저장하면서 사용하였다. 생리활성 측정에 사용한 시약 류 중 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)(D913-2, Sigma, St. Louis, MO, USA), thrombin(T-4648), fibrinogen(F- 8630) 등은 Sigma사 제품이고, H-D-phenyl-alanine-L- pipecolyl-L-arginine-paranitroaniline dihydrochloride(S- 2238, Orangeburg, New York, USA)는 Chromogenix사 제품이었으며, 나머지 시약은 모두 일등급 시약을 사용하 였다.
세포배양
RAW 264.7 세포, mouse leukemic macrophage cells는 한국세포주은행(Korea Cell Line Bank, KCLB, seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였다. 세포는 DMEM (Gibco- BRL, Life technologies Inc., Grand Island, New York, USA)배지에 10% FBS(Gibco-BRL), 1% penicillin/
streptomycin(Gibco-BRL)을 첨가하여 37oC, 5% CO2 조 건의 배양기에서 계대 배양하였다.
물 추출물과 유기용매 분획물 조제
아위버섯 자실체 분말의 일정량에 20배의 증류수를 가 하고 25oC에서 24시간 동안 진탕 추출하였다. 이 추출액 을 5,000 rpm에서 30분 동안 원심분리 후 상등액을 Whatman No.2로 여과하고 동결 건조한 다음 물 추출물 시료로 사용하였다. 유기용매 분획물은 위의 Whatman No.2 여과지로 여과하여 얻은 여과액을 같은 부피의 핵 산(hexane), 클로로포름(CHCl3), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 부탄올(butanol)로 3번 씩 추출 후 각각의 추출 물을 농축시키고, 마지막에 남은 물분획과 함께 동결 건 조하여 분획물을 얻었다. 실험에 사용한 물 추출물과 분 획별 시료는 Dimethyl sulfoxide(DMSO)와 증류수에 10 mg/mL로 준비하여 혈전용해활성, 항산화활성 측정에 사용하였으며, 트롬빈 저해활성은 1 mg/mL의 농도를 사 용하였다.
혈전용해활성 측정
Fibrin 분해활성은 Haverkate and Traas(1974)의 방법에 따라 0.7%(w/v) fibrinogen을 함유하는 2% gelatin 용액 10 mL와 50 mM barbital buffer(pH 7.5)에 녹인 thrombin (100 NIH units) 50µL를 잘 섞고 petri-dish에 부어 fibrin 막을 만들었다. 준비한 아위버섯 물 추출물과 유기용매 분획물 20 µL씩을 fibrin plate 위에 점적하고 36oC에서 8 시간 방치한 후 용해면적을 측정하였다. 대조군으로 플라 스민(1.0 plasmin unit/mL)을 사용하였으며, 추출액의 혈 전용해 활성은 대조군의 용해 면적에 대한 시료의 용해면 적의 상대적인 비율로 환산하여 계산하였다.
트롬빈 저해활성 측정
트롬빈에 대한 저해활성은 Doljak et al (2001)의 실험
방법을 이용하여 측정하였다. 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.1% bovine serum albumin을 포함하는 HBSA 완 충용액(pH 7.5) 40 µL에 트롬빈용액(0.5 NIH units/mL) 50µL를 첨가하고 섞는다. 준비한 아위버섯 물 추출물이 나 유기용매 분획물(10 mg/mL) 10 µL를 첨가하고 실온에 서 15분간 incubation 후, H-D-phenylalanine-L-pipecolyl- L-arginine-paranitroaniline dihydro-chloride를 이용하여 준비한 기질 용액(0.5 mM) 50 µL을 가하고 5분 동안 incubation시킨 후 405 nm에서 흡광도 변화를 측정하였다 (UV-1601PC, Shimadzu, Japan). thrombin 활성 저해율은 다음 식에 의해 산출하였으며, 사용한 흡광도는 대조군의 흡광도를 제외한 수치를 이용하였다.
저해율(%) =
[1 − (시료 첨가구의 흡광도)/(시료 무첨가구의 흡광도)]
× 100
전자공여능 측정
Blois(1958) 및 Kim et al (1957)의 방법에 따라 준비한 아위버섯 물 추출물이나 유기용매 분획물 적정 희석액 0.4 mL를 시험관에 넣고, 1×10-4M의 1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl(DPPH) ethanol 용액 5.6 mL을 가하여 6 mL이 되도록 하였다. 이 혼합액을 4분간 반응시키고 다 시 여과한 다음, 총 반응시간이 10분이 되면 525 nm에서 흡광도를 측정하였다(UV-1201, Shimadzu Co., Japan).
전자공여능은 다음 식에 의해 산출하였다.
전자공여능＝{1 − (O.D.시료 / O.D.증류수)}×100
세포독성 측정
아위버섯 추출물에 따른 세포독성을 조사하기 위해 Cell Counting Kit-8(CCK-8, Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan)을 이용하여 측정하였다. RAW 264.7 세포를 96- well plate에 well(200 µL)당 2 ×104개의 수로 seeding하 고 12시간동안 배양한 후, 추출물 농도를 0, 3, 10, 30 및 100 ug/mL이 되도록 처리하였다. 그리고 추가적으로 37oC 배양기에서 48시간동안 반응시킨 후, CCK-8 용액을 세포 배양액에 10 µL/well을 첨가하고 3시간동안 37oC 배양기 에서 반응하였다. 반응 후, microplate reader(Molecular Devices, Sunnydale, CA, USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
NO 생성 저해 효과 측정
생성된 NO의 양을 조사하기 위해 RAW 264.7 세포를 96-well plate에 5 ×104개/well(200 µL)의 수로 seeding하 고 12시간동안 배양하였다. 그 다음 NO생성을 유도하기 위해 1 µg/mL농도 lipopolysaccharide(LPS)를 1시간 전 처리하고, 추가적으로 추출물 및 분획물 농도를 0, 10 및 100µg/mL이 되도록 처리하고 37oC 배양기에서 24시간
동안 배양하였다. 배양 후, 세포 배양 상층액과 Griess reagent(Sigma, St. Louis, MO, USA)을 1:1 비율로 반응 시켜 실온에서 15분 동안 반응한 후, microplate reader (Molecular Devices, Sunnydale, CA, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
통계 분석
3회 반복 실험을 통하여 얻은 결과는 mean ±SD로 나타 내었으며, 각 실험군 간의 통계학적 분석은 Student t-test 를 실시하여 유의한 결과를 얻었다(p < 0.05).
결과 및 고찰
용매별 분획물의 수율
아위버섯 350 g을 동결 건조한 결과 36 g의 건조물을 얻었다. 이 건조물을 물 추출 후 여러 종류의 유기용매를 이용하여 추출한 분획물의 수율을 측정한 결과 핵산 분획 물이 0.02%, 클로로포름 분획물 0.15%, 에틸아세테이트 분획물 1.94%, 부탄올 분획물 27.39%, 물 분획물 35.88%
로 물 분획물의 수율이 가장 높았다(Table 1).
혈전용해활성
혈전의 주성분인 피브린을 이용한 fibrin plate 방법으로 혈전용해 활성을 측정한 결과, 물 추출물, 핵산 분획물, 클로로포름분획물, 물 분획물에서는 활성을 나타내지 않 고 에틸아세테이트 분획물에서만 1.33 plasmin unit의 활 성을 나타냈다(Fig. 1). 검은비늘버섯은 0.70 plasmin unit 의 활성을 나타냈으며(Kim, 2014), 50 mg/mL의 농도에 서 송이버섯의 고분자 분획물은 1.51 plasmin unit, 애느 타리버섯은 1.47 plasmin unit, 양송이버섯은 1.16 plasmin unit의 혈전용해 활성을 나타내었으며(Choi et al, 2010), 아위버섯의 혈전용해 활성이 다른 버섯에 비해 상대적으 로 높음을 볼 수 있었으며, 아위버섯 열수추출물은 100 mg/mL의 농도에서 0.08 plasmin unit의 작은 활성을 나타 내 열처리 방법에 따라 활성에 차이를 나타냈다(Kim, 2011). 아위버섯에서 혈전용해 활성을 나타내는 물질로는 혈전용해효소와 함께 flavonoid나 페놀유도체 화합물로 예상할 수 있는데(Oh and Kim, 2007), 열을 가할 경우 효소가 파괴되어 혈전용해 활성이 감소하는 것으로 예측 할 수 있다.
Table 1. The fraction yields of a Pleurotus ferulea water extract
Hexane Chloro- form
Ethyl ace-
tate Butanol Water Yield(%) 0.02% 0.15% 1.94% 27.39% 35.88%
Fraction yields were described as the percent of dry substance of fractions based on the dry substance Pleurotus ferulea.
트롬빈 저해활성
혈전형성을 억제하는 트롬빈 저해물질로 사용하기 위해 트롬빈 저해활성을 측정한 결과, 1 mg/mL의 시료를 사용 한 물 추출액은 25.49%의 낮은 트롬빈 저해효과를 나타 냈지만, 에틸아세테이트 분획물은 94.45%은 가장 높은 저해활성을 나타낸다(Fig. 2). 검은비늘버섯 에틸아세테이
트 분획물과 노루궁뎅이버섯이 10 mg/mL의 농도를 사용 한 경우에도 87.36%와 77.67%의 저해활성을 나타낸 것 을 보면(Kim, 2014), 아위버섯의 트롬빈저해활성이 상대 적으로 높은 것을 알 수 있다.
항산화효과
DPPH radical 소거능 측정으로 항산화효과를 측정한 결 과 물 추출물은 37.01%의 항산화활성을 함유하고 있었으 며, 핵산 분획물 8.24%, 클로로포름분획물 17.08%, 에틸 아세테이트 분획물 22.21%, 부탄올 분획물 26.58%, 물 분획물은 35.20%의 항산화활성을 나타냈다(Fig. 3). 상황 버섯의 저분자 분획물은 80.74%의 높은 항산화활성을 나 타냈고, 양송이버섯은 51.35%, 애느타리버섯은 36.61%, 송 이버섯은 36.04%의 활성을 나타냈으며(Choi et al, 2010), 검은비늘버섯은 57.57%의 활성을 보였다. 아위버섯은 항 산화제인 비타민C와 비타민E를 많은 양 함유하고 있는 것으로 알려져 높은 항산화활성이 기대 되었다(Hong et al, 2004a). 버섯에 존재하는 polyphenol 화합물과 flavonoid는 대표적인 phytochemical로 천연 항산화제로 사용할 수 있 는 물질이며, 암, 심혈관계 질환, 항혈전 등의 치료와 예 방에도 이용할 수 있는 다양한 생리활성을 함유하고 있는 것으로 알려져 있다(Oh and Kim, 2007).
세포독성 조사
RAW264.7 세포에서 아위버섯 추출물에 대한 세포독성 을 확인하기 위해, LPS 단독처리군와 LPS와 0, 3, 10, 30 그리고 100 µg/mL의 다양한 농도로 모든 분획물을 함께 처리하여 48시간동안 반응하였다. 그 결과 대조군과 비교 했을 때, 100 µg/mL의 고농도에서도 80%이상의 생존율 을 유지하고 있었다. 이와 같은 결과를 바탕으로, 아위 버 Fig. 2. Thrombin inhibitory activity of solvent fractions
obtained from a Pleurotus ferulea water extract (F-value 230.70;
p < 0.001). WE: Water extract, Fr.He: Hexane
fraction, Fr.CF: Chloroform fraction, Fr.EA: Ethyl acetate fraction, Fr.B: Butanol fraction, Fr.DW: H2O fraction. We used 1 mg/mL of samples because of their high thrombin inhibitory activity.Fig. 1. Fibrinolytic activity of solvent fractions obtained from a
Pleurotus ferulea water extract by fibrin plate method. WE:
Water extract, He: Hexane fraction, CF: Chloroform fraction, EA: Ethyl acetate fraction, Bu: Butanol fraction, W: H2O fraction, Plasmin: 1.0 plasmin unit/mL, EA: 1.33 plasmin unit/mL. We used 10 mg/mL of samples.
Fig. 3. Electron donating activity of solvent fractions obtained from a Pleurotus ferulea water extract by DPPH assay (F-value 708.79; p < 0.001). WE: Water extract, Fr.He:
Hexane fraction, Fr.CF: Chloroform fraction. Fr.EA: Ethyl acetate fraction, Fr.B: Butanol fraction, Fr.DW: H2O fraction.
We used 10 mg/mL of samples.
섯 추출물 및 모든 분획물들이 독성을 나타내지 않음을 알 수 있었으며 또한 혈전용해, 트롬빈 저해, 항산화 및 항염증 효과가 세포에 영향을 주어 나타나는 효능이 아님 을 알 수 있었다(Fig. 4).
Nitric Oxide (NO) 생성 억제 효과
아위버섯 분획물들의 항염증효과를 조사하기 위해, RAW264.7 세포에 염증유발을 일으키는 LPS(1 ㎍/mL)를 첨가하여 과량의 nitric oxide(NO) 생성을 유도하고, 대조 군, LPS단독군 그리고 LPS와 10 또는 100 ㎍/mL 농도로 모든 분획물을 함께 처리한 군을 비교분석하였다. 그 결
과 LPS단독과 비교했을 때, LPS와 함께 100 ㎍/mL의 클 로로포름 분획물을 동시에 처리한 군에서 가장 효과적으 로 98.13%의 NO 생성이 억제됨을 확인하였다. 또한 핵 산 분획물 76.81%, 부탄올 분획물 37.69%로 유의하게 NO 생성 억제 효과가 관찰되었다(Fig. 5). 이와 같은 결과 를 바탕으로 아위버섯 클로로포름 분획물, 부탄올 분획물 및 핵산 분획물이 항염증의 기능을 보임을 알 수 있었다.
적 요
아위버섯을 혈관계질환 예방과 치료를 위한 기능성 식 Fig. 4. In vitro Cytotoxicity effects of solvent fractions obtained from a Pleurotus ferulea water extract in RAW 264.7 cells. The cells were treated with solvent fractions obtained from a Pleurotus ferulea water extract at different concentrations for 48 hours.
Data represent the mean ± S.D. of three independent experiments. WE: Water extract, He: Hexane fraction, CF: Chloroform fraction, EA: Ethyl acetate fraction, Bu: Butanol fraction, W: H2O fraction. (*; p < 0.05, **; p < 0.01).
품 개발에 이용하기 위한 기초 자료를 얻기 위해 아위버 섯 물추출물과 유기용매 분획물의 혈전용해활성과 트롬빈 저해활성, 항산화활성 및 항염증활성을 확인하였다. 에틸 아세테이트 분획물은 1.33 plasmin unit의 높은 혈전용해 활성과, 94.45%의 높은 트롬빈 저해활성을 나타냈으며, 물 추출물은 37.01%의 항산화활성을 나타냈으며, 클로로 포름 분획물은 98.13%의 가장 높은 항염증활성을 나타냈 다. 실험 결과로부터 아위버섯의 에틸아세테이트 분획물 은 높은 혈전용해활성, 트롬빈 저해활성 그리고 클로로포 름 분획물은 높은 항염증활성을 나타내 심혈관계 질환 관 련 치료나 예방을 위한 기능성식품 개발에 이용 가능할 것으로 기대된다.
References
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Choi SJ, Lee YS, Kim JK, Kim JK, Lim SS. 2010. Physiological activities of extract from edible mushrooms. J Kor Soc Food Sci Nutr. 39(8):1087-1096. (in Korean)
Fig. 5. Inhibitory effects of solvent fractions obtained from a Pleurotus ferulea water extract on LPS-induced NO production in RAW 264.7 cells. The cells were incubated for 24 hours with LPS in presence or absence of indicated concentrations of solvent fractions obtained from a Pleurotus ferulea water extract. Data represent the mean ± S.D. of three independent experiments.
WE: Water extract, He: Hexane fraction, CF: Chloroform fraction, EA: Ethyl acetate fraction, Bu: Butanol fraction, W: H2O fraction. (*; p < 0.05, **; p < 0.01, ***; p < 0.001).
