신형 콜레라균의 혈청형인 V ibrio cho/eγ'ae 0139 Bengal에 대한 항혈청

임상병리검사과학회지 : 제 27권 제 1 호 1995.

신형 콜레라균의 혈청형인 V ibrio cho/eγ'ae 0139 Bengal에 대한 항혈청

원광보건전문대학 임상병리과 · 원광대학병원 임상병리과*

김신무 · 정수진 · 신용섭* . 오재세

On the Serology of a Newly Described Vibrio

c，뼈eγae

0139 Bengal

Kim, Shin Moo., Chong, Su Jin., Shin, Yong Sop*., Oh, Jae Sae Dept.

01

ClinicaJ Pathology, W onkwang He，따~th Junior C여'lege

Dept.ol αinic따 P따뼈ogy， Wonkwang U niversity Hos，빼t따*

A strain of Vibrio cholerae 0139 that produce cholera toxin has been implicated in epidemics of cholera -like diarrhea. The morphological, cultural, and biochemical characteristics of V.

cholerae 0139 are similar to those of V. cholerae 01.

o

antisera were produced by immunizing rabbits with serogroups 022, 0139, 0155, and R of V. cholerae. Following results were obtained ;

1. The 0 agglutination titers in these three 0 antisera from immunized rabbits against the serogroups 022, 0139, and 0155 of V. cholerae were in the range of 640"-' 1280, these antisera contained R agglutinin titer of 80"-' 320 against an R antigen.

2. The agglutination of 0 antiserum against 022, 0139, and 0155 strains after absorption with R antigen were demonstrated between the 022 and 0139 antigen, and between the 0139 and 022 strains, respectively, and the 0155 antiserum did not react with 022 and 0139 antigen.

3. The titers of homologous agglutinin of 0 antiserum against 022 strain of V. cholerae after absorption with 0139 and R antigen of V. cholerae were 80. V. cholerae 0139 anti- serum were also agglutinated after absorption with 022 and R antigen of V. cholerae, and the homologous titer was 160.

4. V. cholerae 01 antiserum reacted not only 01 strain but also 0155 strain of V. cholerae, but 022, 0139, 0155 and R antisera of V. cholerae did not react with an 01 antigen of V. cholerae.

It is concluded from this study that the diagnostic antiserum against 0139 strains of V.

cholerae must be absorbed with 022 and R strain of V. cholerae to remove cross-reacting ag- glutinins of the 022 and R strain.

Key words: serology, Vibrio chderae 0139, Bengal

I. 서 론 험올 통해서 진단용 항혈청으로 사용하기 위해서 항혈 청 제조를 시도하며 ， V. cholerae 0139 에 대한 세균학적

V ibrio cholerae는 세균 분류학상으로는 Vibrio속의 한 지견을 넓히고자 한다.

균종에 속하지만 O군 항원에 의해서 혈청형으로 세분

되고 있고， 일반적으로 혼히 부르는 콜레라균은 혈청 II. 실험재료 및 방법 형 01 으로써 V. cholerae 01 을 가르키는 것이며， 01 이

외의 것은 V. cholerae non-01 으로 칭하고 있다. 또한 1. 실험균주

V. cholerae 01 은 classical 형과 EI Tor의 2가지 생물형

으로 나눈다1) 제 7차 콜레라 세계유행의 원인균은 생 V. cholerae의 항혈청 생산용 표준균주인 0139, 022, 물형인 EI Tor형인 V. cholerae 01 EI Tor 였고 아시아， 0155 및 R과 01 의 혈청형은 일본의 National

남미， 아프리카에서 콜레라 유행을 보이고 있다. 지금 Instituite of Health의 Shimada 박사로부터 분양받아 까지 콜레라의 원인균은 V. cholerae 01 이고， 01 이외 Yeast extra t -Casitone반고체배지 9) 에 보존하면서 사용 의 혈청형 즉 V. cholerae non-01 은 콜레라양 질환 유 하였다 (Table 1).

행의 원인균이 된다든가 대유행을 일으키는 것이 없는

것으로 생각하였다. 그러나 1992 년 10월경 인도 및 방 Table 1. Reference isolates of Vibrio cholerae used for an-

글라데시에서 V. cholerae non-01 이라고 생각되는 콜 tJserum preparat^lOn

레라 양질환의 대 유행이 발생하였다2.3) 유행지에서 분리주는 V. cholerae의 성상을 가지고 있었지만 이미 알려진 O군 항혈청 (01-0138 및 Hakata) 의 어느것에 도 웅집이 없었다. Shimada 등4)은 O항원의 해석결과와 처음으로 분리된 지명에 따라 V. cholerae 0139 Synonym

Bengal( 이하 V. cholerae 0139) 이라고 명명하였다.

V. cholerae 0139는 콜레라 독소(이하， CT) 생성 등의

성상이 V. cholerae 01 과 비슷하여 콜레라와 같은 심한

설사를 일으키고， 근년에도 인도， 방글라데쉬， 네팔， 파 키스탄， 태국， 말레이지아 및 중국 등에서 유행을 하고 있으며 2 ， 3 ， 5) ， 미국， 영국， 독일， 에스파니아， 싱가포르，

Serogroups Reference strains*

01 JNIH 569B

022 JNIH 169-68

0139 M045(ATTC 51394)

0155 JNIH 490-93

R JNIH CA385

*

^{A TCC,} American Type Culture Collection : JNIH, National In- stituite of Health.

2. V. cfderae 0139,022,0155 및 R 항혈청의 제조8.10)

일본 및 우리나라에서도 이 세균의 분리가 보고되고 토끼에 면역을 시키기 위해서 항원제조는 위의 혈청 있다6，8). V. cholerae 0139에 의한 유행이 계속 확대 된 형 균주를 tryptic soy agar(TSA) 에 접종하여 37t 에 다면 이 세균에 의한 콜레라 세계유행 (pandemic) 이 일 하룻밤 배양하여 집락을 생리 식염수에 부유시키고 어날 가능성이 있을 것으로 알려지고 있다7) 지금까지 m!Crowave로 2 ... 3 회 가열한 뒤 100 t 에서 1 시간 가

V. cholerae non-01은 O항원에 의해서 02-0155까지 열하여 3,000 rpm으로 15분간 원침하는 조작을 2 회 반

분류되고 있다8) 그러나 이와같은 V. cholerae의 혈청형 복하여 세균을 세척한 후 침사를 식염수로 희석하여 을 동정하기 위해서는 이 혈청형에 대한 혈청학적 방 McFarland의 제 4관에 맞추어 냉장고에 보존하면서 사 법이 중요한 것으로 알려지고 있다. 저자들은

V.

용하였으며， 토끼의 항원접종은 토끼의 귀 정맥내로 cholerae의 혈청형 중에서 상호간에 교차반응이 있는 각각의 항원을 4 일간격으로 0.5, 1.0, 2.0 및 4.0ml 씩을 것으로 알려져 있는8) 0139,022 및 0155 균주를 사용 접종하였으며 최종접종 후 제 6 일에는 경동맥이나 심장 해서 이 혈청형 사이의 항원 관계를 조사하고 흡수시 에서 혈액을 채취하여 혈청을 분리하였다. 경동맥에서

- 21-

혈액을 채취시 마취제는 25 % urethane을 4 ml/kg씩 을 넣어 사용하였다.

R항원에 의한 각각의 항 혈청의 흡수시험은 식염수 를 넣은 R항원을 microwave로 2 "， 3 회 가열 후 100 t 에서 1 시간 가열하여 3,000 rpm으로 15분간 원침하는 데 2 회 반복하여 침사만 분리해서 0항혈청을 식염수 로 1 : 5 의 비율로 섞은 희석액에 잘 혼합하여 50 t 에 서 30분간 반응시킨 후 -4t 에서 4,500 rpm으로 40 분간 원침조작을 2 회 반복하여 상층을 분리하고 10

%

sodium azide를 방부제로 10ml 혈청당 1 방울 비율로

넣어 냉장고에 보존하면서 사용하였다.R항혈청은 흡 수시험을 하지 않고 식염수로 1: 5 의 비율로 희석하였 다.

Fig. 1. Transmission electron microscopy of negatively stained V. cholerae 0139 Bengal which shows a curved organism with a single polar flagellum.(TEM, 8,000 x)

용해서 각각의 항원과 혈청을 넣고 3"'5분간 혼합하여 응집반응을 하였다.

A 제품인 V. cholerae 01 진단혈청으로 022, 0139, R 및 01 항원을 슬라이드 응집반응을 하였고， 역시 V.

cholerae 01 항원으로 제조된 항혈청과도 각각 슬라이드

응집반응을 실시하였다. 슬라이드 및 시험관법의 응집 시험의 판정은 대조시험관과 비교하면서 응집이 빠르 고 육안적으로 뚜렷한 것만을 양성으로 하였다. V.

cholerae 0139 의 형태학적 특징을 보기 위해서 TSA 에

접종하여 37 t 에서 18 시간 배양한 것을 투과 전자 현 미경으로 관찰하였다.

III. 결 과

1. 토끼에 면역시켜 제조된 O 항혈청의 응집소 역가

V. cholerae의 혈 청 형 022, 0139, 0155 균주로 토끼 에 면역 후 O항혈청의 응집소의 역가는 640^{" ,} 1280 이 었고， R항원과 이들 O항혈청과의 응집 역가는 80'"

320으로 각각의 0항원과 교차반응의 원인이었다 (Table 2).

Table 2. Homologous agglutinin and R agglutinin titer of

o

antisera of Vibrio cholerae 022, 0139, and 0155

Antise앙rum Agglutination titer Homologous 0 antigen R antigen*

640 80

1280 160

022 0139

0155 1280 320

*

Reference strain(CA 385) for the R antigen of Vibrio cholerae

제조된 항혈청의 응집소 역가를 측정하기 위해서는 56 t 에서 30분간 비동화한 혈청을 식염수로 2 배수 단 계희석하여 각 희석액 0.5ml 에 항원을 McFarland 의 제 2 관에 탁도를 맞춘 것을 0.5ml 씩 넣어서 50t 의 항 온 수조에서 18 시간 반응시킨 후 응집소 역가를 판독

하였다 022， 0139 및 0155 균주에 대한 각각의 O항혈청을

제조된 항혈청과 동종의 항원간의 특이반응 및 교차 R항원으로 흡수시험 후 슬라이드 응집반응은 022항혈 반응이 있는지를 보기 위해서 Boerner 슬라이드를 사 청은 022와 0139 항원과， 0139항혈청은 022와 0139항

2. R황원으로 R항체를 홉수시험 후 O항혈청의 슬라 이드 응집반응

원과 교차반웅을 보였으나 0155 항혈청은 0155항원만 이 웅집반용하였다 (Table 3).

Table 3. Cross-agglutination test among antisera of 022, 0139, and 0155 of Vibrio cholerae after agglutinin absorption tests with 022, 0139, and R antigen.

O-antiserum* Agglutination reaction with 0 and R antigen

022 0139 0155 R

022 + + ^**

Absorbed with 0139 +

0139 + +

Absorbed with 022 +

0155 +

*

^R antibody in these antisera was removed by absorption with R culture, A 385.

* *

^-, No agglutination of a dilution of 1 : 10 or higher.

3. R항원으로 홉수한 후 022와 0139항원으로 다시 홉수후의 O 항혈청의 역가

022, 0139 및 0155 항혈청을 R 항원으로 흡수한 후 022항혈청은 0139 항원으로， 0139항혈청은 022항원으 로 흡수한 후의 역가는 80-320 이었다.

T able 4. Agglutination titer of among antisera of 022, 0139, and 0155 of Vibrio cholerae after absorption with R -culture and other 0 antigen of V. cholerae.

Antigen(100

oc

^{, 1 h)}

Antiserum

022* 0139 0155 R 022 Absorbed with 0139

0139 Absorbed with 022 0155

R

80 -**

160

*

Antiserum diluted 1 : 5 with saline.

320

* *

No agglutinatin of a dilution of 1 : 10 or higher.

80

4. 홉수 항혈청， 항원과 V. chderae 이항혈청， 항원 사이의 슬라이드 응집반응

R항원과 슬라이드 웅집반웅에서 01 과 0155항원이 웅 집되었으며， 홉수시험 후의 022, 0139, 0155항혈청과 01 항원과는 응집반웅이 없었다 (Table 5).

Table 5. Slide agglutination reaction of Vihrio cholerae 01 antiserum against 01, 022, 0139, 0155, and R antigen of V. cholerae

o

antigen 01 antiserum

o

antiserum* 01 antigen

01 + 022

022 0139

0139 0155

0155 + ^R

R

* Antisera was removed by absorption with antigen of 022, 0139, and R culture, CA385

N. 고 찰

1992 년 10월 경 인도남부의 마드라스， 베 르니 아 지 방 에서 시작한 V. cholerae의 새로운 혈청형 0139 에 의해 서 발생한 집단 설사증은 많은 희생자가 있었으며 2.11) 그 후 이 유행은 인근까지 퍼졌고 11 월에는 캘커타에 도 확대되어 인도 서뱅갈지방을 시작으로 내륙부를 포 함 수십만명 이상의 환자가 발생한것으로 알려졌다.

한편 방글라데시에서도 1993 년 3월까지 10만명 이상 이 이 환되 었고 1 ，500 명 의 사상자를 내 었다4.12)

Ramamurthy 등2) 에 의하면 마드라스에서 분리된 48

균주는 CT 생산량이 10.4-80 mg/ml으로 통상 임상에 서 분리된 콜레라균과 거의 변화가 없는 CT 생산량을 보이고 있다. 이와같이 인도나 방글라데시에서 콜레라 양 질환의 원인균이 되 었던 V. cholerae 0139 는 그의 전염성과 CT 생성량이 종래의 콜레라균과 거의 차이 가 없고， 또한 임상증상이 중증이고 특히 심한 구토 및 중증의 탈수가 현저하며 l3)， 또한 복통과 혈변이 동 반하는 경우도 알려지고 있다.

V. cholerae 0139는 TCBS한천상에서 콜레라와 같이

황색집락을 보이고 주사 전자현미경에서 관찰은 콜레 라와 같이 약간 만곡된 형태를 보이고 1 개의 편모를 가지고 있다 (Fig 1). 이 세균은 비브리오 동정에 사용 하 는 0/129(150 μg) 및 trimethoprim - sulf amethoxa- V. cholerae 01 항혈청으로 01, 022, 0139, 0155 및 zole 에 내 성 이 며， mannose 에 발효한다 14) 또한 Muh-

- 23-

kerjee의 El Tor phage 5 및 classical phage IV에 감수 주에 대해서 주의갚게 감시체계를 하지 않으면 안된 성이며， polymyxin B에는 내성이고， 이 세균은 kappa 다.

phage를 생성하는 것도 있다. 대부분의 V. cholerae V. cholerae 0139균주를 검사실에서 동정하기 위해서

0139 세균은 CT를 생성하고 콜레라와 완전히 동일한 는 0139항혈청을 반드시 사용해야 정확한 동정을 할

CT 및 Zonula occludens toxin 유전자를 가지고 있지 수 있으며， 0139 항혈청 없이는 이 균주는 다른

V.

만 NAG-ST유전자를 가진 것은 없다고 Nair 등 15)은 cholerae non -01 과 혼통할 수 있다. 한편 A 제품의 V.

보고하였다. 또한 0139균주는 콜레라와 동일한 독력 cholerae 01 항혈청은 0155 항원과도 슬라이드 응집반웅 유전자의 발현을 조절하는 ToxR 유전자를 가지고 있 (Table 5) 을 보여 01 항혈청에 웅집이 보이는 콜레라 다 16) 한편 V. cholerae 0139는 El Tor콜레라균과 그 균주는 반듯이 0155 항혈청과 반웅시켜 확인을 해야 성상이 유사하지만 두 균주의 O항원의 LPS구성당의 할 것으로 사료된다. V. cholerae 0139를 동정하려면 성분이 다르고， 0139 균주는 콜레라균이 함유하고 있는 0139항혈청에 강하게 응집반웅이 일어나고， 0/129 및 perosamine을 가지 고 있지 않지 만 반대 로 콜 레 라균에 trimethomprim - sulf amethoxazole에 내 성 이 며 , mannose

는 없는 colitose (3, 6 - dideoxy - L - galactose )를 함유하 발효가 중요한 성상이다.

고 있다 17)

그러나 0139 균주를 동정하기 위해서는 생화학적인 V. 걸 론

전통적 방법이 요구되나 이 방법으로는 V. cholerae의

혈청형을 감별하기는 어렵고， 혈청학적 방법인 특이성 V. cholerae의 혈청형 022, 0139, 0155 및 R 균주로 이 높은 0139항혈청이 신속한 동정을 가능케 하는 것 토끼에 면역시켜 만든 항혈청을 이용해서 각각의 동종 으로 알려지고 있다8) 저자들이 토끼에 면역시킨 022, 및 이형항원 간에 웅집반웅을 하여 다음과 같은 결론

0139 및 0155 항혈청형 균주에서 O항혈청과 동종의 을 얻었다.

0항원 및 R항원과의 역가는 Shimada 등8) 이 보고한 것과 동일하여 역시 교차반응을 일으키는 R항체를 제 거 해야만 특이반응을 보일 것으로 확신케 하였다.R 항원으로 R항체를 홉수 후 각각의 통종항원으로 슬라 이드 응집반응에서 0155 항혈청을 제외하고， 022항혈 청은 022와 0139 항원과， 0139항혈청은 022와 0139 항 원과 각각 교차반응을 보여， Shimada 등의 결과와는 0139와 0155 항혈청에서 차이가 있었으나 흡수시험 후 모두다 특이성 반응은 동일하여 022, 0139, 0155 혈청 형의 콜레라균을 통정하는데 매우 필수적으로 쓸 수 있다 하겠다.

V. cholerae 0139는 흔히 콜레 라라고 부르는 V.

cholerae 01 과 증상을 감별할 수 없다13) 많은 나라에

서 즉 인도， 방글라데시， 네팔， 파키스탄， 태국， 말레이

지아 및 중국에서 이미 유행되고 있다2 ， 3 ， 5 ， 12 ， 18 ， 19) 인도

와 방글라데시와 같이 빠른속도로 퍼진다면 더 많은 나라에서 유행할 수 있으며， 우리나라에서도 유행일 가능성을 배제할 수는 없기 때문에 이 새로운 0139균

1. 022, 0139 및 0155균주에 대한 세가지 항혈청의

역가 범위는 640-1280 이었고， R항원과의 항체가 80-320으로 이것은 O항원과의 교차반응의 원인 이었다.

2. 022, 0139 및 0155 항혈청을 R항원으로， 흡수시 킨 후 슬라이드 웅집반응에서 022 항혈청은 022 와 0139 항원에， 0139 항혈청은 0139와 022항원 에， 0155 항혈청은 동종항원에만 웅집반응을 하였 다. 다시 022항혈 청 은 0139항원으로， 0139항혈 청 은 022항원으로 흡수시험 후 각각의 동종항원 및 항체반응에서 특이적 반응을 보였다.

3.022항혈청은 0139 항원으로， 0139항혈청은 022항 원으로 흡수시험 후 3동종 응집가는 각각 80, 160 이었고， R항원과는 모두 응집반응이 음성이었 다.

4. V. cholerae 01 항혈청은 동종항원 외에도 0155항 원과도 응집반응이 있었다. 그러나 022, 0139,

0155 및 R항혈청은 01 항원과의 응집반응은 하지

않았다.

이 연구에서 V. cholerae 0139 균주로 진단용 항혈청 을 만들때는 R항원으로 R항체 만을 제거할 뿐만 아니 라， 022균주로 교차반응을 일으키는 022 항체도 흡수 시험하여 제거해야 한다는 결론을 얻었다.

본 연구를 위해서 V. cholerae의 혈청형 균주를 협조 하여준 일본 NIH 의 Shimada박사에게 진심으로 감사를 드린다.

REFERENCES

1. Baumann P, AL Furniss & JV Lee: List of the species of the genus Vibrio.(Krige NR & JG Holt ed). Bergey’s Manual of systematic bacteriology vol. 1, p. 531-538, William and Wilkins^, Balti- more, 1984.

2. Ramamurthy T, S Grag, R Sgarma, SK Bha- ttacharya, GB Nair, T Shimada, T Karasawa, H Kurasono, A Pal & Takeda Y: Emergencce of novel strain of Vibrio cholerae with epidemic poten- tial in southern and eastern India. Lancet, 341 : 703

-704, 1993.

3. Albert MJ, AK Siddinque, MS Islam, ASG Faruque, M Ansarzzaman, SM Faruque & RB Sack : Large outbreak of clinical cholera due to Vibrio cholerae non-01 in Bangradesh. Lancet, 341 : 704, 1993.

4. Shimada T, GB Nair, BC Deb, MJ Albert, RB Sack & Y Takeda : Outbreak of V. cholerae non -01 in India and Bangladesh. Lancet, 341:

1347, 1993.

5. Chongsa -nguan M, W Chaicumpa, P Moolasart, P Kandhasingha, T Shimada, H Kurazono & Y Takeda : Vibrio cholerae 0139 Bengal in Bangkok.

Lancet, 342 : 430-431, 1993.

6. 김호훈， 신의철， 김동진 : 감염병 발생정보， 5 : 25- 36, 1994.

7. Swerdlow DL, & AA Ries : Vibrio cholerae non -01

the eight pandemic? Lancet, 342 : 382 - 383, 1993.

8. Shimada T, E Arakawa, K Itoh, T Nakazato, T Okitsu, S Yamai, M Kusum, GB Nair & Y Takeda : Two strains of Vibrio cholerae non-01 possessing somatic(O) antigen factors in common with V. cholerae serogroup 0139 synonym Bengal.

Current Microbiolog, 29 : 331-333, 1994.

9. 김신무 : 진단미생물학 실습. p.25-26, 고려의학，

1995.

10. 김신무， 박열， 정윤섭 : Vibrio vulnificus의 생물학적 성상과 혈청형. 대한미생물학회지， 26: 403-415, 1991.

11. Nair GB, T Ramamurthy, SK Bhattacharya et al.

: Spread of Vibrio cholerae 0139 Bengal in India.

J Infect Dis, 169 : 1029-1034,1994.

12. Cholera Working Group : Lagre epidemic of chol- era -like disease in Bangladesh caused by V ibrio cholerae 0139 Bengal. Lancet 342 : 387 - 390, 1993.

13. Bhattacharya SK, MK Bhattacharya, GB Nair et al. : Clinical profile acute diarrhoea cases infected with the new epidemic strain of Vibrio cholerae 0139 ; Designation of the disease as cholera. J In- fect 27 : 11-15, 1993.

14. Kurazono T, F Yamada, M Yamaguchi, Y Ohzeki

& Y Okuyama : The report of traveler’s diarrhea associated with a newly described toxigenic Vibrio cholerae 0139 strain in Japan. The Japanese As- sociation for Infectious Disease 68 : 8-12, 1994.

15. Nair GB, T Shimada, H Kurazono et al. : Charac terization of phenotypic, serological and toxigenic traits of Vibrio cholerae 0139 Bengal. J Clin Microbiol, 32 : 2775 - 2779, 1994.

16. Waldor MK, JJ Mekalanos : ToxR regulates viru- lence gene expression in non-01 strains of Vib- rio cholerae that cause epidemic cholera. Infect Immun 62 : 72 -78, 1994.

17. Hisatsune K, S Kondo, Y Isshiki et al. : 0 - anti- genic lipopolyssacharide of Vibrio cholerae 0139

- 25-

Bengal ; A new epidemic strain for recent cholera in the Indian subcontinent. BBRC 196: 1309- 1315, 1993.

18. Fisher- Hoch SP, A Khan, H Inamul, MA Khan,

ED Mintz: Vibrio cholerae 0139 in Karachi, Parkistan. Lancet 342 : 1422 -1423, 1993.

19. World Health Organization: Cholera -update, end of 1993. Weekly Epidemiol Rec 69 : 13-17, 1994.