alysis pylori

임앙병리럼마고1익외7\ 1 : 깨132뀐 깨13오， 73-84 , 2000.

Random Amplified Polymorphic DNA 분석 에 의 한

Helicobacter pylori의 분자적 형 별 분석

광양대학 임상병리과 · 서남대학교 의과대학 임상병리과* 순천대학교 생물학과**

김양호 · 신명근 조정선** 성치남**

Molecular Typing of Helicobacter pylori by Random Amplified Polymorphic DNA An alysis

Kim, Yang Ho. , S피n， Myuong

un*. , Jo , Jeong Sun**. , Seong , a피 Nam**

Department of αinical Pathology , Kuα7g y(α7g αllege， Kuα7g y(α19， Koreα αllege of Medicine , Seonam University , Kuxmg Yang , Korea*

Department of Biology , Sunchon Natioml University , 5띠u;hon， Korea* *

πlÏs study was undertaken to detennine molecular types and genetic diversity of Helicobacter pylori isolate obtained from v따ious gastroduodenal diseases.

tral biopsies were taken for culture from 90 patients with chronic gasσitis， gasσic ulcer and duodenal ulcer at the time of endoscopy.

pylori was identified by typical gram stain morphological and biochemical tests. UreA of the candidates were

plified using PCR , and 30 strains were identified as

pylori from 90 specimens. RAPD fmgerprinting was performed by 3 primers (OPA-ll , 5 ’ -CAATCGCCGT -3 ’ OPA-18 , 5 ’ -AGGTGACCGT -3 ’ OPA-19 , 5 ’ -CAAACGTCGG-3 ’Ope ron Technologies , A ^t1 anta , GA). Relationship of the strains shown by DNA band pattem was analyzed numerically and the result were expressed as phensgram.

l isolates were divided into five molecular types (1-

at similarity (S) value of 0 .4; 11 strains (36.6%) , 6 strains (20.0%) , 5 strains (1 6.7%) , 5 strains (1 6.7%) and 3 strains (10.0%) belonged to type 11 , 1 , 111 , V and IV , respectively. Th e mean S values of all isolates , type 1 , 11 , 111 , IV and V were 0.62 , 0.60 , 0.66 , 0.58 and 0.55 , respectively.

pylori isolates had high level of genetic diversity. Th e RAPD molecular types of

pylori were not disease-specific since the types were diverse in the is이ates from v따ious

gastroduodenal diseases.

Key Words: Helicobacter pylori , Random amplified polymorphic DNA analysis

1 . 서

Helicobacter pylori 감 염 은 오늘날 매 우 흔 한 감염증 중의 하나로 만성 활동성 위염， 위 및 십이지장 궤양 뿐만 아니라 위선암， 위의 mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma (MALToma) 와 강한 연관성이 있으며， 이의 치 료는 소화성궤양의 재발 방지에 중요하다 (Rauws and Tytgat , 1990; van der Hulst and Tytgat , 1996; Blaser et al , 1995; Foreman and Eurogast Study Group , 1993; Parsonnet et al ,

임상적 경과를 결정하는 요인으로 숙주 및 환 경적 요인 외에 균주 자체의 특성을 제시하였 다. 이상과 같이 가족내에서 분리된 균주에 대 한 연구 외에 일반 환자의 위생겸조직에서 분

리된 H. pylori 균주를 대상으로 분자생물학적

방법에 의한 유전적 다양성 규명에 대한 연구 가 활발하게 이루어지고 있다. 최근의 연구들 은 유전적으로 매우 다양하다고 보고하고 있 으나 random amplified polymorphic DNA (RAPD) 분석법을 이용한 Hua et al (1999) 의 보고에 의 하면 58 명의 환자에서 분리된 H. pylori 균주

1994) H. pylori 감염으로 초래되는 다양한 임 는 모두 핵산수준에서 동일균주 였다고 보고

상발현은 환경 및 숙주의 유전학적 특성과

하여 보고자에 따라 그 결과가 상이하다.

pylori 균주간의 독성의 차이에 의해 결정되는 이에 저자들은 만성위염， 위섭이지장궤양의

것으로 생각되며 특히 세포독성과 연관된 유 상부위장관질환을 가진 환자들의 위생검 조 전 자 즉， cytotoxin-associated gene A (cagA) 가

위축성 위염， 장상피화생， 소화성 궤양 및 위 암과 관련이 있다고 알려져 있으나 지금까지 이런 인자들 각각의 상대적인 역할은 잘 알려 져 있지 않다(van der Ende et al , 1998; Crabtree et al , 1993).

H.

pylori 균주의 핵산수준에서의 다양성의

규명， 독성 인자들의 확인 및 전파경로를 밝 히기 위해서 단백질 분석， plasmid 분석， 제한 효소분석 및 중합효소연쇄반응 기법을 이용 한 다양한 분자생물학적 방법들이 시도되고 있다(Han et al , 1997; Miehlke et al , 1998).

Miehlke et a1. (1998) 은 서 로 다른 질환을 가진 가족내 5 명의 구성원(위선암， MALToma , 장상 피화생과 위축성 위염， 장상피화생， 십이지장

직에서 분리된

pylori를 대상으로 RAPD 법 에 의 해 상사성 지 수 (similarity value) 를 구하 여 유전적 다양성을 알아보고， 분자형을 규명 하여 이들 질병과의 연관성을 고찰하고자 본 연구를 시행하였다.

n. ^{대상 및 밭법}

1 . 대 상

1999년 3 월부터 1999년 12월 31 일까지 상부 위장관 증상으로로 내원하여 순천시내병원에 서 상부소화관 내시경 검사를 받았던 환자 중 만성위염， 위궤양， 십이지장궤양의 소견을 보 였던 환자 90 예의 위전정부 조직 겸체로부터 궤양)의 병변부위 생검조직에서 분리된 H. H. pylori의 배양을 시행하였으며， 이 중 H

pylori를 대상으로 r빼tive extrag해ic 빼빼피c pylori가 배양에서 검출되었던 30 예로부터 얻

sequencebased PCR (REP-PCR)을 이용하여 유 어진 30균주를 대상으로 하였다.

전적 상사성(다양성) 및 연관성을 규명하였다.

그 결과 종양과 전암성 조직에서 분리된

2. 방 법 pylori는 유전적 상사성이 높았으나， 십이지장

궤양에서 분리된

pylori는 유전적으로 큰 차이를 보였음을 보고하여 H. pylori 감염증의

1)

pylori 배 양

내시경 소견상 위염이나 위 및 십이지장궤

양의 소견을 보이는 대상 환자의 위유문부로 부터 5cm 이내의 점막에서 조직을 채취하여 배양을 시행하였고 이때 내시경의 생검겸자 공은 99% 알코올로 소독하고 멸균생리 식염 수로 충분히 세척한 뒤 역시 소독된 생검겸자 를 이용하여 조직을 채취하였다. 생검 조직은 채취즉시 생리식염수에 넣어 검사실로 보내 배양 및 동정 검사를 시행하였다. 조직은 멸

80μ1 CTAB/NaCl 넣고 섞은 후 65

C 에서 10분 배양했다. 동량의 chlorofonnf isoamyl alcohol을 넣고 잘 섞어， 4

C 에서 5 분간 12，000rpm으로 원심분리 시킨후 상층액을 채취하여 phenolf chlorofonn/isoamyl alcoh이을 동 량 가한 후

12, 00 Orp m, 5min 원 심 분 리 후 0.6 volume iso-

propan이을 넣고， DNA가 가라앉을 때 까지 천 천히 흔들고， 가라앉은 DNA을 휘어진 파스테 균된 면도칼을 이용하여 잘게 부수어 효코렛 르 파이렛으로 걷어 올린후 새로운 시험관에 한천배지에 접종하였다. 배양은 3TC 이산화 옮긴후 70% 에탄올 lml을 넣은후 12，00야pm，

탄소 농도 10% 의 미호기성 상태에서 7 일간 5min , 4

C 로 원심분리， 냉동동결건조기에 건 실시하였으며 배양 기간중 충분한 습도를 유 조 시킨 후 100μ1 TE buffer에 녹인후 30

C

지하였다. 대개 배양 2 일이 지나면 아주 작고 deep freezer에 보관하였다.

점액 성상의 균집락이 관찰되었다.

(2) Oligoncleotide primer

2) H. pylori동정 각 primer는 한국바이오니아에서 상품화되

H. pylori의 동정은 전술한 특징적인 균집락 어 있는

pylori detection kit를 구입하여 사 의 모양， 그람염색상의 구부러진 형태의 그람 용하였으며， kit에 포함되어 있는 prlmer는 ureA

음성간균， catalase 양성， oxidase 양성 및 urease PCR gene sequence에서 유도되었다 primer염 양성 소견으로 동정하였다. 기서열은 및 PCR의 증폭산물은 Table 1 과 같

다.

3) 중합효소연쇄반응을 이용한

pylori 검출

(1 )DNA주줄

순수분리된 307R 의 균을 각각 적당량의 균 을 백금이로 떠서 tube에 넣고， 567μ1 TE bu담er，

30 μ 1 10% SDS, 20m밍ml용액 3 μ 1 pr'αeinase K 첨 가하여 3TC 에서 1 시간 배양하여 비활성화 시 킨후 100μ1 5M NaCl을 넣고 충분히 흔든후

(3) 중합효소연쇄반응

CD 1

PCR

1

PCR 시험관에 13μl씩의 8-MOP용액(한 국바이오니아)을 넣었으며， 양성대조는 8-MOP

용액을 17μl 넣었다， HEPY 1 와 HEPY 2

primer를 각각 1μl씩 시험관에 넣고， 시료 DNA를 5μl씩 넣었다. 이때 양성대조는 lμl

Table 1. Sequences of PCR primers used for the detection of

pylori DNA.

Prim

er Sequence (5'

3')

oduct size

HEPYl GCGGCTGAATTGATGCAAGAAGG 2811-2840

51 7b p

HEPY2 GCCATGAAAACCACGCTCTTTAGC 3310-3333

HEPY3 TGATGTGATGGATAACGTGG 2862-2881

HEPY4 AAATCTTACCGCTGTCCCGC 3167-3186 325bp

Table 2. Maπix of similarity values for 30 H. pylori isolates by RAPD analysis

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

1.0 0.50 1.00 0.50 1.00 1.00 0.37 0.40 0.40 1.00 0.56 0.43 0.43 0.38 1.00 0.64 0.52 0.52 0.31 0.50 1.00 0.64 0.50 0.50 0.26 0.48 0.76 1.00 0.33 0.55 0.55 0.64 0.35 0.35 0.30 1.00 0.33 0.45 0.45 0.64 0.52 0.35 0.30 0.64 1.00 0.48 0.53 0.53 0.36 0.50 0.30 0.35 0.32 0.32 1.00 0.64 0.54 0.54 0.55 0.59 0.52 0.58 0.54 0.54 0.52 1.00 0.64 0.61 0.61 0.54 0.50 0.58 0.67 0.43 0.35 0.50 0.67 1.00 0.38 0.42 0.42 0.36 0.50 0.60 0.59 0.53 0.32 0.38 0.52 0.50 1.00 0.38 0.50 0.50 0.52 0.64 0.48 0.45 0.58 0.42 0.48 0.71 0.48 0.76 1.00 0.57 0.53 0.53 0.45 0.60 0.40 0.35 0.32 0.42 0.50 0.35 0.40 0.38 0.29 1.00 0.61 0.48 0.48 0.50 0.55 0.73 0.74 0.48 0.48 0.23 0.49 0.55 0.67 0.52 0.55 1.00 0.40 0.43 0.43 0.62 0.50 0.50 0.48 0.69 0.52 0.20 0.44 0.50 0.60 0.64 0.40 0.73 1.00 0.53 0.71 0.71 0.30 0.33 0.44 0.53 0.35 0.24 0.43 0.48 0.56 0.29 0.32 0.57 0.37 0.33 1.00 0.48 0.52 0.52 0.46 0.58 0.50 0.47 0.52 0.43 0.20 0.66 0.50 0.60 0.72 0.40 0.55 0.67 0.56 1.00 0.56 0.52 0.52 0.46 0.58 0.50 0.48 0.61 0.43 0.20 0.67 0.42 0.60 0.72 0.50 0.64 0.67 0.56 0.92 1.00 0.48 0.63 0.63 0.55 0.40 0.40 0.47 0.42 0.53 0.50 0.69 0.70 0.38 0.48 0.38 0.44 0.30 0.57 0.50 0.51 1.00 0.26 0.29 0.29 0.50 0.18 0.18 0.21 0.48 0.48 0.44 0.48 0.27 0.33 0.35 0.22 0.30 0.27 0.25 0.27 0.27 0.33 1.00 0.52 0.57 0.57 0.50 0.36 0.45 0.42 0.28 0.38 0.44 0.48 0.55 0.44 0.44 0.44 0.40 0.27 0.50 0.45 0.45 0.67 0.30 1.00 0.55 0.50 0.50 0.35 0.48 0.67 0.56 0.30 0.30 0.47 0.58 0.48 0.47 0.45 0.35 0.42 0.29 0.53 0.48 0.48 0.59 0.32 0.63 1.00 0.42 0.45 0.45 0.56 0.35 0.43 0.40 0.64 0.45 0.32 0.62 0.61 0.53 0.58 0.21 0.38 0.52 0.47 0.69 0.60 0.63 0.48 0.57 0.60 1.00 0.48 0.61 0.61 0.54 0.67 0.42 0.48 0.52 0.61 0.60 0.74 0.58 0.50 0.64 0.50 0.45 0.58 0.56 0.58 0.58 0.70 0.45 0.55 0.67 0.61 1.00 0.61 0.57 0.57 0.50 0.55 0.45 0.53 0.38 0.48 0.56 0.56 0.55 0.44 0.35 0.67 0.50 0.36 0.63 0.45 0.45 0.56 0.50 0.60 0.63 0.48 0.73 1.00 0.44 0.37 0.37 0.32 0.47 0.47 0.57 0.37 0.37 0.31 0때 0.47 0.46 0.33 0.46 0.67 0.47 0.55 0.47 0.47 0.46 0.40 0.40 0.43 0.50 0.47 0.53 1.00 0.57 0.63 0.63 0.45 0.30 0.40 0.47 0.53 0.21 0.50 0.61 0.60 0.50 0.57 0.38 0.44 0.40 0.71 0.60 0.60 0.63 0.44 0.56 0.47 0.63 0.50 0.56 0.61 1.00 0.47 0.40 0.40 0.22 0.38 0.50 0.62 0.40 0.27 0.33 0.42 0.50 0.50 0.35 0.33 0.57 0.37 0.60 0.50 0.50 0.50 0.29 0.43 0.46 0.53 0.37 0.43 0.89 0.67 1.00

RAPD; random amplified polymorphic DNA analysis.

넣 고， microcenσifuge을 사용하여 , 13，OOOrpm에 서 5 초동안 원심 분리 하여 spin down 한후 mineral oil을 한방울씩 넣고 PCR을 시행하였다.

PCR은 94

C 5 분 pre-denaturation , 94

C 1 분 denaturation , 60

C 1 분 annealing , 72 oC 1 분 extension의 조건하에서 30회 반복한 다음， 7 2

C 5 분 최종적으로 post -extension하였다.

(z) 2

PCR

PreMix 시 험 관에 16 μ l씩 의 8-MOP용 액 을

넣 은후 HEPY 3 와 HEPY 4 primer를 각각 1 μ l

씩 시험관에 넣었으며， 1

PCR이 끝난 시료를 2μl씩 넣었다. 시험관를 vortex하여 내용물이 잘 섞 이 도록 한후 microcentrifuge을 사용하여 13，0어rpm에서 5 초 동안 원심 분리하였다.

mineral oil을 한방울씩 각 시험관에 넣어준후

이때 시험관 내용물이 완전히 잠기게 하였다.

PCR 반응은 1

PCR조건과 같게 하였다.

@ 결과판정

PCR이 끝난 후 시 험 관을 UV transilluminator

위 에 올려 놓고 5-10분 동안 post -inactivation

시키고， 각 시료를 10μl씩을 1.2% 의 agarose 액은 총 25 μL의 양으로 세균 genomic DNA

gel을 이 용하 여 전 기 영 동 시 켜 product size 25 ng , 3 mM MgCh , single random primer 20

(325bp)를 분석하였다. PCR산물 10μl 에 gel pmoles , DynaZyme (Finzyme Inc. , Fi피and) 1U , loading dye 2μl를 혼합하여 전기영동하여， 각각의 dNTP 250 uM , 50 mM KCl , 0.001 % ethidium bromide 염 색후 UV transillumi- nator gelatin을 넣어 시 행하였다. 이 때 사용한 primer

로 절 편 을 관 찰하 였 다. 는 3 종 의 lO -mer 이igonucleotide (Operon Tech- nologies , A t1 anta , Ga; Kit A) 를 사용하 였 다

4) RAPD 분석 (OPA-ll , 5 ’ -CAATCGCCGT -3 ’ OPA-18 , 5 ’-

H.

pylori로 동정된 세균의 분자생물학적 수 AGGTGACCGT-3 ’; OPA-19 , 5 ’ -CAAACGTCGG-

준에 서 의 감별을 위 하여 RAPD 분석 을 시 행 하 3 ’). PCR은 DNA thermal cycler (Model 9600;

였다. RAPD 는 Williams

1990) 의 방법을 Perkin-Elmer Cetus , USA) 를 사용하여， 온도조 변형하여 시행하였다. 2 mL의 brain heart 건은 95

C 에서 5 분간 predenaturation 시킨뒤 infusion broth에 순수 배 양한 세 균 집 락 1 개 를

백금이로 접종하여 35

C 부란기에서 흔들어 주면서 3 시간 배양하였다. 균 부유액 1 mL를 microcentrifuge 시 험 관으로 취 하 여 5 , 000 rpm

으로 4

C 에서 5 분간 원심분리하여 상층액은 버리고 균 침전물은 SE 완충액 (75 mM NaCl ,

25 mM EDTA) 으로 1 회 세척하였다. 세척한

균침전물은 200μL의 lysis 완충액 (2mg of lysozyme per mL , 1M NaCl , 10 mM tris [pH 8.0] , 100 mM EDTA , 0.5% sarkosyl) 으로 3TC 에서 30분간 배양한 후 500 μL의 ESP 완충 액 (0.5M EDT A , 1 % sarkosyl , 1mg of proteinase K per mL) 으로 55

C 에서 2 시간 배양하였고 다시 RNAse A를 20 μ g/ mL 되 게 추가하여 3TC 에서 1 시간 배양하였다. 이 용액에 동량 의 phenolfchloroform/isoamylalcohol (25 :24: 1) 을 넣고 12 , 000 rpm으로 4

C 에서 15 분간 원심분 리하여 상층액을 취하고 이 과정을 1 회 더 반 복한 다음 2 배 량의 ethan이과 1/1 0 양의 3 M sodium acetate를 넣고 -20

C 에서 하룻밤동안

침전시킨 뒤 13 , 000 rpm으로 4

C 에서 20분간 원침시켰다. 침전된 DNA는 1 mL의 70%

ethanol로 세척하고 즉시 진공건조시킨뒤 100

μ L의 TE 완충 액 (1 0 mM tris [pH 8.0] , 1 mM

EDTA) 으로 녹이고 UV 분광광도계로 측정하 여 DNA 농도를 50 ng/μL로 맞추었다. PCR 용

94

C 에서 30초， 35

C 에서 30초 그리고 72

C 에 서 1 분간을 한 주기로 44 회 반복하고 72

C 에 서 5 분간 postextension 시켰다. PCR 이 끝난 후

1.8 % agarose gel 에 PCR 산물 8 μ L 와

loading buffer를 섞 어 서 loading 한뒤 0.5x TBE 완충액에서 70V로 4 시간 동안 전기영동하여 0.5 μ gjmL ethidium bromide로 30분간 염 색 한 뒤 UV 광선을 투과하여 polaroid camera로 촬 영하였다.

5) RAPD 결과의 판독 및 통계분석

RAPD profile은 band가 있으면

1 ’ 없으면

‘0’으로 계수화하여 character matrix를 작성하

였다. 작성된 정보를 통계 프로그램인 NTSYS-

pc (Numerical taxonomy system and mu 1t ivariate

analysis system , version 1. 51 , Applied Biostatistics

Inc , USA) 에서 Dice 의 coefficient 법으로 상사

성 지 수를 구하고 UPGMA (unweighted pair-

group method , arithmetic average) 법 으로 군 집

분석을 시행한 다음 dendrogram을 그려서 균

주들간의 유사성 및 분자형을 구하였다. 상사

성 지수는 0에서 1 의 범위로 표현되는데， 1 인

경우 두 균주가 유전적으로 같음을 의미하고

0 인 경우 유전적으로 상동성이 없음을 시사한

다.

m. 결 과

1 . 생검조직검체에서 H. pv/orí 배양률

본 연구에서는 총 90 예의 위전정부 조직 검 체에서

pylori의 배양을 시행하였으며， 이 중 30 예에서

pylori가 검출되어 동정율은

33 .3% 였다.

2. 중합효소연쇄반응 결과

순수 배양된 균 중 생화학적 검사에서 양성 반응을 보인 307R 균의 겸체로부터 얻은 DNA

의 PCR산물 에 서 는 모두 모두 1st 517bp

2st

325bp 의 band를 확인할 수 있었으며， 음성반 응을 보인 검체로부터는 ureA 유전자를 확인 할 수 없었다.

3. RAPD 분석결과

1) RAPD 양상

예비실험에서 PCR산물의 DNA 띠가 가장 선명하게 평균 2 개 이상 보였던 시발체로서

OPA-ll

OPA-18 및 OPA-19 변을 선정하여 다 음의 성적을 얻었다. OPA-11 시발체는 100 bp

정도에서 2

000 bp 사이에 2-8 개의 뚜렷한 띠 를 보였으며， 2 번과 3 번 균주， 11 번과 12 번 균 주， 18-20번 균주 및 25 번과 26 번 균주는 매우 유사한 밴드양상을 보였다. OPA-18 시발체의 경우 2-8 개의 띠가 118 bp 에서 2, 300 bp 사이 에서 관찰되었으며， 본 실험에 사용된 시발체 중 대상 균주들의 DNA 다양성을 가장 높게 반영해 주었다. OPA-19 시발체는 110 bp 에서

2

400 bp 사이에 대상균주 모두에서 1-6 개의 뚜렷한 띠가 관찰되었다. 4주를 제외한 대부 분의 균주들은 872 bp 정도의 공통 띠를 보였 다(Fig. 1).

2) 아형의 분류

총 30주

pylori의 RAPD 분석 결과 5 가지 의 형 (1- V) 으로 분류할 수 있었다. 이를 den-

drogram으로 나타내 면 Fig. 2 와 같다. 대 상균 주들은 상사성 지수 0 .4 에서 한 개의 군집으 로 무리 지어졌고， 상사성 지수 0.5 부근에서 5 개의 형으로 구분할 수 있었다 .II 형이 11 주 (36.6%) 로 가장 많았으며， 1 형， IIT 형， V 형 및 W 형 이 각각 6주(20.0%)， 5주(1 6.7%)， 5주(1 6.7%) 및 3 주

0.0%) 였 다.

3) 대상 균주의 유전적 상사성

대상균주 사이의 상사성 지수의 분포는 0.18 에서 1.00로 유전적으로 다양하였다(Table

2). IIT 형에 속한 5주의 평균 상사성 지수는

0.66 으로 다른 형에 비해 유전적 상사성이

높았으며， 6주가 속한 I 형의 평균 상사성 지 수는 0.62 이고， II 형， IV 형 및 V 형의 상사성 지 수는 각각 0.60

0 .5 8 및 0.55 로서 대 상균주 전체의 평균 상사성 지수는 0.60 이었고 표준 편차는 0.11 이었다 (Table 3).

N. 고 찰

H. pylori는 인간에서 위염， 소화성 궤양 및 위암을 유발하는 나선형의 그람 음성 미호기 성 간균으로

pylori의 genomic DNA는 평균

1 ,672 ::t 64Kb 이 고 3부위 의 16S 와 23S rRNA 유 전자를 가지고 있으며 유전자 변이가 심하여 다양한 변종을 가지고 있는 것으로 알려져 있

q(Taylor et al , 1992). Helicobacter속 에 는 현 재 까지 19 개의 균종이 포함되어 있으며 이중 인 간에서는

pylori외에

bizzozeronii

canis

cinaedi , H. fennelliae , H. pullorum 및

westmeadii 등 7종이 발견된다(Versalovic et al

1999).

pylori 배양은 3TC 배양기에서 이 산화탄소 5-10%

질 소 80-90% 및 산소 5-10%

의 미호기성 및 습한 조건에서 잘 자란다. 배

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M M 11 12 13 14 15 16 17 18 19 xl M M 21 22 23 24 25 26 27 갱 29 :IJ M

2322

603 564

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M M 11 12 13 14 15 16 17 18 19 xl M M 21 22 23 24 25 26 27 28 29 :IJ M

2322

603 564

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M M 11 12 13 14 15 16 17 18 19 xl M M 21 22 23 24 25 26 27 갱 29 :IJ M

2322

603 564

Fig. 1. RAPD profiles of 30 H. pylori is이ates using OPA-ll primer (upper) , OPA-18 primer (middle) and OPA-19 primer (bottom). M; size marker (mix of

DNA HindIII digest and

ø X 174 RF/Hae III) , Numbers (1-20) on picture; strains of

pylori , RAPD; random amplified polymorphic DNA analysis.

Table 3. RAPD types and similarity values of 30

pylori isolates

Similarity value RAPD type

R m w

Total

Distribution 0

4-0.89 0

5-

0.50-0.92 0.50-0.67 0.27-0.69 0

8-

Mean 士 SD

0.62 ::t0

4 0.60 ::t O.09 0.66 ::t0

2 0.58 ::tO.09 0.55 ::t0

2 O.60 ::tO.ll

RAPD; random amplified polymorphic DNA analysis , SD;

deviation.

지는 선택배지 및 비선택배지로 구분되는데，

10% 소혈청 이 첨가된 mueller-hinton 한천배지 (Difco) 에 vancomycin(1 0μg/ml) , nalidixic acid

(25μg/ml) , amphotericin B(1μg/ml)를 첨 가한 배 지를

pylori의 분리용 배지로 이용하였다.

총 90 예의 위전정부 조직 검체에서 30 예에 서

pylori7r 검출되어 동정율은 33.3%였다.

위조직검체에서

pylori 동정율은 보고자마 다 매우 다양하여 배양검사의 예민도는 구미 의 경우 70-90% 로 보고되고 있으나， 국내의

Similarity value 0.0 0.1 0.2 0.3 0

0

0.6

경 우 이 보다 낮아 홍 등(1 997) 및 손 등(1 999) 의 연구에서는 각각 75% (69/92) 및 60% 로 보 고하고 있다. 본 연구에서 배양율이 낮은 이 유는 선택배지를 사용하지 않았던 점에 기인 한 것으로 판단되었다.

세균의 분류， 특징 규명 및 역학 조사의 방 법으로 최근에는 분자생물학적 기법이 많이 이용되고 있다. 이중 비교적 초기에 이용된 restriction fragment length polymorphism (RFLP) 은 띠수가 너무 많고 각 띠 사이의 해상도가

RAPD types 0.7 0.8 0.9

0

6 7 16 28 30 2 3 18 29

26 12 21 25 23 24 5 13 14 19 20

15 27 4 9 8 17 22

Fig. 2. Dendrogram of 30

pylori isolates by similarity values.

낮아 결과의 비교 분석이 어렵다는 단점이 있 한 Han et al(1 997) 의 연구에 의하면 H. pylori

다. 이를 극복하기 위하여 pulse field gel 균주 구분에 단백분석， plasmid분석， 제한효소 electrophoresis (PFGE) 및 ribotyping 등을 이 용 분해 법 들은 각 균주 사 이 에 명 확한 구분 이 어 하였는데 이들 역시 시간과 비용이 많이 소요 려웠고 RAPD 법이 단순하고 융통성이 있으며 되는 단점을 가지고 있다(Bostock et al

1993). 경제적이어서 가장 좋다고 하였다.

RAPD 분석 법 은 1990년 Williams 등(1 990) 에 RAPD 분석 법 에 의 한

pylori 유전 적 다양 의해 처음 소개되었는데， 이는 짧은 길이의 성에 관한 보고들을 보면 van der Ende 등6)은 primer( 대개 lO-mer)를 이용하여 genomic DNA 중국과 네델란드에서 분리된 H. pylori 균주를 를 증폭하고， 증폭된 산물을 전기영동하여

genomic DNA의 변이를 알아내는 방법으로，

신속하고 비교적 쉽게 genotyping을 할 수 있 는 방법 이 다. 따라서 RAPD 법 은 증폭하고자 하는 부위의 염기서열을 알지 못해도 빠른 시 간 안에 비교적 간단히 균내 분자생물학적 정 보를 얻을 수 있다. RAPD 분석법은 초기에는 식 물 병 원 균 인 Fusarium solani(Crowhurst et al , 1991) 와 Leptosphaeria maculαns(Goodwin et al, 1991) 에 적 용되 었으나， 그후 Proteus mirabilis (Bingen et al , 1993) , Listeria monocytogenes (Lawrence et al , 1993) , Escherichia. coli (Wang et al , 1993) 및 Staphylococcus species(Welsh et

al, 1990) 등의 세균에 대한 역학조사와 균주

의 구분 및 염 기 서 열의 다양성 규명 등의 분 야에서 다양하게 사용되고 있다. 본 연구에서 도

pylori의 분자형과 유전적 다양성 규명 을 위하여 RAPD 방법을 이용하였다. 이 방법 은 모든 분자생물학적 방법이 그렇듯이 실험 전에 충분한 반복시험을 통하여 검사법의 표 준화를 이루어 재현성을 확보하여야 한다. 또

한 RAPD 방법은 한 두 개의 primer만 사용하

였을 경우에는 그 유전자형에 신빙성을 두기 어렵다， 그러므로 본 연구에서는 실험전에 충

분석한 결과 유전적 다양성이 매우 높음을 발 견하였고， 이는 감염의 초기에 인간의 위내 환경에 적응하기 위해 H. pylori 가 변이를 일 으킨 것으로 설명하였다. 동일한 환자에서도 위내의 위치에 따라 여러 균주가 발견되는 것 도 이런 이유 때문이라고 하였다. 그러나 Hua et al(1999) 의 보고에 의 하면 58 명 의 환자에 서 위전정부 2 곳의 조직검사에서 배양된

pylori는 RAPD 분석결과 모두 동일 균주임을 보고하여 전자의 보고와 차이를 보였으며， 그 이유를 처음에는 다양한 균주들이 존재하였 으나 균주사이에 서로 경쟁하여 우월한 한 균 주만이 생존하게 된 결과로 설명하였다. 홍 등(1 997) 은 18 예의 소화성 궤양 환자의 위전 정부 조직절편으로부터

pylori를 배양하였 으며 증폭된 UreA와 UreB 유전자를 제 한효소 로 절단하여 제한절편의 다양성을 관찰하여 18 종의 균체중 11 개의 서로 다른 DNA 지문 을 확인하여 유전적으로 다양한 변이가 있음 을 관찰하였다. Han et al( 1997) 은 위 염을 가진 환자의 위조직 절편으로부터 11 종의

pylori

균체를 얻어 RAPD 법으로 분석한 결과 각 균 주는 1O-207H 의 주띠를 가졌으며 시발체 1290 에서 30-90%, 시발체 1281 에서 25-85% 의 상사 분한 사전준비를 통하여 검사의 재현성을 검 성이 있다고 하였다. 본 연구의 경우 예비실 증하였으며 더구나 O야ron사 (Ope ron Technol앵ies， 험에서 PCR산물의 DNA 띠가 가장 선명하게 At1anta, Ga) 의 RAPD 분석용 primer 중 kit A 평균 2 개 이상 보였던 3 개의 시발체 (OPA-07 ， 에 포함된 207H 의 primer 중 본 실험 조건에 OPA-I0, OPA-11 및 OPA-12)를 선정하였으며，

가장 부합된 3 개의 primer를 선별하여 사용하 각 시발체들은 200 bp 에서 1,800 bp 사이에

여 유전자형 판별에 객관성을 확보하였다. 또 2-107H 의 띠를 보여 대상 균주들의 유전적 다

양성을 반영해 주었다. 고하여 가족내 전파의 가능성이 높다고 하였 대상균주 사이의 상사성 지수의 분포는 0.24 다. 추후 가족내 전파의 가능성이나 혼합감염 에서 0.91 로 유전적으로 다양하였다(Table 2). 에 관한 연구가 보다 많은 예를 대상으로 연 총 30주

pylori의 RAPD 분석결과 5 가지의 구되어져야 할 것으로 생각되었다.

형 (1- V) 으로 분류할 수 있었으며 각 분자형 이상의 결과로 상부위장관 질환을 가진 환 에 속한 균주들의 평균 상사성 지수를 구할 자에서 분리된

pylori는 상사성 지수가 0.24 수 있었고， 전체 대상균주들의 상사성 지수를 에서 0.91 사이에 분포하여 유전적으로 매우 구할 수 있었다. 따라서 본 연구에서도 전술 다양함을 계량적으로 알 수 있었고， 이러한 한 보고자의 결과와 비슷하게 상부위장관 질 상사성지수를 근거로 군집분석을 시행하여 환에서 분리된

pylori는 유전적으로 매우 대상균주는 5 가지의 분자형 (I-V)으로 분류되 다양함을 알 수 있었다. 그러나 이런 유전학 었다. 한편 H. pylori 분자형과 질환과의 연관 적인 다양성에도 불구하고 Y oshimura

성은 찾기 어려웠다.

al(1 993) 은

pylori의 궤 양유발성 균주와 비 궤양유발성 균주는 구분할 수 있을 것이라고 하였으며， Go et al(1993)도 십이지장 궤양환 자에서 분리한 유전자와 증상이 없는 위염환

V. 결 ^{를 』}

최근 다양한 분자생물학적 방법에 의해

자에서 분리한 유전자간에 다른 군집을 이룬 pylori의 유전적 다양성을 규명하려는 연구가 다고 하여 상반된 의견을 제시하였다. 시도되고 있는 바 연자들은 상부위장관 질환

H.

pylori 감염으로 초래되는 서로 다른 임 을 가진 환자들의 위전정부 검체에서 분리된

상질환들과 균종들과의 관련성 여부에 관한

pylori를 대상으로 random amplified poly- Cho et al(1995) 의 연구에 의 하면， 건강한 성 morphic DNA (RAPD) 분석 에 의 해

pylori의 인， 위염， 소화성 궤양과 위암환자들 108 예를 유전적 다양성과 분자형을 규명하였다.

대상으로 RAPD 볍으로 분석한 결과 1087R 의 상부 위장관 증상을 주소로 내원하여 상부 균체에서 모두 11 가지 분자형으로 매우 다양 소화관 내시경 검사를 받았던 환자들중 만성 함을 확인하였고 각 질환과의 연관성은 관찰 위염， 위궤양， 십이지장궤양의 소견을 보였던 할 수 없었다고 하였으며， 3 가족 11 명의 33 균 환자90 예의 위전정부 조직 검체로부터

체를 분석한 결과 7 명의 자녀중 4 명이 부모와 pylori의 배양을 시행하여 동정된 30균주를 대 동일한 분자형이 관찰되어 일부 자녀는 부모 상으로 하였다. RAPD 는 3종의 primers (OPA- 로부터 감염되어 가족내 전파의 가능성을 제 11 , 5

-CAATCGCCGT -3

OPA-18, 5

-AGGT- 시하였으나 혼합감염의 가능성도 제시하였다 GACCGT-3 ’ OPA-19， 5

-CAAACGTCGG-3

본 연구의 경우 만성위염， 위 및 십이지장궤 Operon Technologies, Atlanta, GA) 를 이용하여 양의 상부위장관질환에서 분리된

pylori는 W i1l iams 등의 방법을 변형하여 시행하였다.

각각 다양한 RAPD 분자형을 가지고 있음이 RAPD 분석으로 대상균주들은 상사성 지수

관찰되어 이들과 비슷한 결과를 보여 주었다 0.4에서 한 개의 군집으로 무리 지어졌고， 상

그러 나 Miehlke et al(1 998) 과 van der Ende et 사성 지 수 0.5 부근에 서 5 가지 의 분자형 (I-V)

al(1998) 은 상부위장관 질환을 가진 한가족의 으로 구분할 수 있었다 .II 형이 11 주 (36.6%)

구성원들로부터 H. pylori 균주를 RAPD 법으 로 가장 많았으며， 1 형， ill 형， V 형 및 W 형

로 분석한 결과 유전적으로 매우 유사함을 보 이 각각 6주 (20.0%)， 5 주 (16.7%)， 5주(1 6.7%)

및 3주 (10.0%) 였다. 대상균주 사이의 상사성 지수의 분포는 0.18 에서 1. 00 사이로 유전적으 로 다양하였다 .rn 형에 속한 5주의 평균 상사 성 지수는 0.66 으로 다른 형에 비해 유전적 상사성이 높았으며， 6주가 속한 I 형의 평균 상사성 지수는 0.62 이고， II 형， IV 형 및 V 형 의 상사성 지수는 각각 0.60 , 0.58 및 0.55 였 다. 대상균주 전체의 평균 상사성 지수는 0.60 이었고 표준편차는 0.11 이었다.

이상의 결과로 상부위장관 질환을 가진 환 자에서 분리된

pylori는 RAPD 분석으로 5 가지 유전형으로 구분할 수 있었고， 유전적으 로 매우 다양함을 알 수 있었다.

칩고문흰

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