kfas

515

Copyright © 2020 The Korean Society of Fisheries and Aquatic Science pISSN:0374-8111, eISSN:2287-8815

서 론

전복

(Haliotis discus hannai)

^{은우리나라주요해산양식패}

류종으로서

2000

년대에들어인공종묘생산기술의발달과해

상가두리양식방법의이용을통해양식생산고의많은양적성 장이이루어진바있다

(Park and Kim, 2013).

그러나최근들어 여름철고수온환경의심화에따른생존율저하및빈번한질병 유발등국내전복양식의단위노력당생산성은점차저하되고 있는실정이며

,

이에전복의양식생산성개선을위해선발육종 을위시하여여러육종연구들이추진되고있고

,

그일환으로서 염색체공학을이용한삼배체

(triploidy)

전복의개발과경제형

질의평가가진행되고있다

(Park et al., 2018; Kim et al., 2019).

전복양식에서문제를야기시키는여러환경요인들중지구 온난화와관련한수온의증가와여름철고수온환경의장기간 유지가최근전복양식의생산성을저하시키는주요환경요인 들로주목받고있으며

,

때문에고수온충격또는고수온노출 에대한전복의생리반응에대한분자메커니즘을이해하기위 한여러연구들이이루어지고있다

(Chen et al., 2019; Kyeong et al., 2020).

^특히

,

^{고수온노출또는적응시차등발현하는분} 자발현마커들의발굴과이들에대한발현특징을해석하기위 한연구들이전복에서최근이루어진바있으며

,

그주요대상 유전자그룹으로서열충격단백질유전자들

(heat shock protein

이배체 및 삼배체 전복( Haliotis discus hannai) 치패에서 주요 열충격 단백질 유전자들(heat shock protein genes)의 발현 특징

박철지·김은정 ¹ ·남윤권 ¹ *

국립수산과학원 육종연구센터, ¹부경대학교 해양바이오신소재학과

Expression Pattern of Major Heat Shock Protein Genes in Diploid and Triploid Abalone Haliotis discus hannai Juveniles

Choul Ji Park, Eun Joeng Kim

¹

and Yoon Kwon Nam

¹

*

Genetics and Breeding Research Center, National Institute of Fisheries Sciences, Geoje 46083, Korea

1Department of Marine Bio-Materials and Aquaculture, Pukyong National University, Busan 48513, Korea

Basal and heat shock-induced mRNA expression patterns of major heat shock protein (HSP) genes, including those encoding heat shock protein (HSP) 90, HSP70, HSP70-12A, heat shock inducible protein 70 (HSIP70), heat shock binding protein 1 (HSPBP1), HSP60, and HSP40 were examined in the gill and hepatopancreas of 1-year-old diploid and triploid abalone Haliotis discus hannai juveniles. Under non-stimulated conditions at 19ºC, triploid abalones displayed, in general, higher mRNA levels of various HSPs (HSP70, HSIP70, HSPBP1, HSP70-12A, and HSP60 in the gill and HSIP70, HSPBP1, and HSP60 in the hepatopancreas) than did communally cultured diploids. Con- versely, only the hepatopancreatic expression of HSP70-12A was higher in diploids than in triploids. However, the fold changes in gene expression in response to an acute thermal challenge (elevation from 19 to 30ºC) were gener- ally greater in diploids than in triploids, such that the difference in basal expression was diminished, weakened, or even reversed after heat shock treatment. However, unlike other HSP genes, the basal expression of HSP60 (higher in 3N) was more pronounced after heat shock treatment. Collectively, the results of this study suggest that triploid abalones have different capacities for not only basal expression but also the heat-induced expression of HSPs in an HSP member-dependent manner.

Keywords: Abalone, Haliotis discus hannai , Heat shock protein genes, Thermal changes, Triploidy

*Corresponding author: Tel: +82. 51. 629. 5918 Fax: +82. 51. 629. 5910 E-mail address: [email protected]

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial Licens (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0/) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Received 3 July 2020; Revised 30 July 2020; Accepted 5 August 2020 저자 직위: 박철지(연구관), 김은정(대학생), 남윤권(교수) https://doi.org/10.5657/KFAS.2020.0515

Korean J Fish Aquat Sci 53(4), 515-523, August 2020

박철지

ㆍ

김은정

ㆍ

남윤권

516

genes)

^{및관련유전자들에대한연구들이활발히진행되고있}

다

(Wan et al., 2012; Sun and Hu, 2016; Shin et al., 2017; Park et al., 2018; Kyeong et al., 2020).

Heat shock protein (HSP) gene family

는열충격에의한세포 내단백질의보호를주기능으로하는

molecular chaperone

들

로서다양한분자량의크기를갖는여러종류의

HSP member

들

(HSP90, HSP70, HSP60, HSP40

및그외저분자

HSPs)

을 포함하며

,

각

HSP member

내에서도생물종에따라서로다 른다양한

isoform

들이존재하는것으로알려져있다

(Kregel, 2002; Kampinga et al., 2009).

아울러일부

HSP member

들의 경우일반적인스트레스반응인자

(general stress response fac- tor)

로작동함으로써고수온충격외에산화성스트레스

(oxida- tive stress)

및감염

(infection)

등에대한세포방어기능의단 백질로서도그역할을수행함이보고되고있다

(Brokordt et al., 2015; Dubey et al., 2015).

전복의경우역시최근

whole genome assembly

^{와고수온발} 현

transcripts

들의대량발굴실험을통해서다양한

HSP mem-

ber

들과

isoform

들이생물정보학 분석에 의해 동정된바 있

으나

(Nam et al., 2017; Kyeong et al., 2020),

아직전체

HSP member

들의

isoform

들에대한명명및 분류체계

(nomencla- ture)

^{는부분적으로완성되어있지는못한상태이다}

.

^하지만

,

^전 복류를포함한여러수산생물종들을대상으로수행된

HSP

유 전자발현에관한여러선행연구들은동일한고수온자극에대 해서

HSP member/isoform

특이적인차등발현을나타내며

,

그 차등발현패턴은자극원에대한유도발현의민감도

,

차등발 현의양적인절대량

,

^{차등발현유발주요조직등에서생물종} 뿐만아니라계통등에서도그차이가관찰됨이보고된바있다

(Cheng et al., 2007; Wang et al., 2011; Shiel et al., 2014).

유도된

3

배체

(triploidy)

는일반적인

2

배체

(diploidy)

에비해 서

1.5

배증가된

genome

크기를갖도록설계된개체로서

2

배 체와달리

3

^{개의상동염색체를}

(homologous chromosomes)

^보

유하게되므로제

1

감수분열

(meiosis I)

에서상동염색체들간의

등분할이어렵기때문에감수분열의지연또는억제에따른소 위불임효과

(sterility effect)

의유도된다

(Piferrer et al., 2009;

Dheilly et al., 2014).

때문에

3

배체유도기술은불임효과를 통한부가적인경제형질의차등발현을유도하거나인위적으 로형성한육종계통또는유전자변형계통의생식학적 제어

(reproductive confinement)

전략으로써그가능성을인정받고 있다

.

하지만인위적으로유도된

3

배체의경우

,

주목적형질인 불임성

(sterility)

유도외에도세포대사및생리측면에서다양 한비표적형질

(non-intended traits)

^{들에서도이배체와차이를} 나타낼수있는데

,

이는배수화된이론적으로유전좌위

(locus)

별조합가능한대립유전자

(allele)

의수가증가할뿐만아니라

,

genome

및세포크기의증가로인한세포분열

,

세포수및세

포대사의차이에기인한다

(Piferrer et al., 2009; Van de Pol et al., 2020).

이에본연구는배수체전복의고수온노출에대한생리반응 특징을평가하기위한연구의일환으로전복에서발굴된바있 는주요

HSP

유전자들을대상으로일반

2

배체대조군및

3

배체 전복치패에서기초발현및고수온자극에대한유도발현특징 을조사하고자하였다

.

재료 및 방법

실험 전복

실험에사용한전복은제

1

극체방출억제를통해유도된

3

배 체치패

(1

^년산

;

^각장

6.5±1.0 cm)

^{과동일모패로부터생산된} 동일연령의이배체치패

(

각장

6.2±1.2 cm)

들이다

(Park et al., 2018; Kim et al., 2019).

이들전복은국립수산과학원육종연구

센터

(Geoje, Korea)

에서동일사육시스템에서사육한개체들

로서

,

기초발현수준평가는육종연구센터에서사육중인개체 들을직접샘플링하여분석조직을확보하였다

.

^{반면고수온처} 리실험의경우육종연구센터에서부경대학교수산과학대학수 해양종합실험실습센터부속어장으로이송후수온

19±1ºC

에 서

1

주간순치후수온처리실험에사용하였다

.

HSP 유전자

분석을위해선발한

HSP

^{유전자들은전복}

genome draft

^로부 터선행연구를통해보고된바있는유전자들로써

, heat shock protein 90 (HSP90) 1

개

isoform, HSP70 member

에서

3

개

iso- forms [HSP70

및

heat shock inducible protein 70 (HSIP70)

및

HSP70-12A], heat shock binding protein -1 (HSPBP1),

그 리고

HSP60

^및

HSP40 member

^에서각

1

^개의

isoform

^씩선발 하여총

7

개의

HSP genes

들을유전자발현분석에이용하였다

(Kyeong et al., 2020).

각유전자의

Gene ID

및발현유전자를 증폭하기위한

RT-PCR

용

primer pair

는

Table 1

에나타내었다

. 수온 자극 처리 및 실험 전복 샘플링

첫째

, 2

^{배체대조군과}

3

^{배체그룹의}

HSP

^{유전자들의기초발} 현에있어차등유무의여부를조사하기위해서동일사육시스

템내에서개체별전자표식칩을이용

, 19±1ºC

에서혼합사육

(communal culture)

중인

2

배체와

3

배체를무작위로선발하여

(

그룹당

6

개체

)

아가미및간췌장에서발현하고있는각

HSP

유 전자들의발현수준을조사하였다

.

^총

3

^{반복의샘플링을통해}

2

배체와

3

배체에서의기초발현수준을비교하였다

.

둘째

,

고수 온자극유도시

, 2

배체대조군과

3

배체그룹에서고수온에유 도되는

HSP

유전자들의종류및각

HSP

유전자의발현증가민 감도등에차등발현이관찰되는지여부를조사하기위해실험 적인고수온자극처리를실시하였다

.

^{상기동일사육시스템내}

19±0.5ºC

에서혼합사육하고있는개체들을대상으로개체식

별전자칩을이용하여유사한크기의

2

배체및

3

배체개체들 을선발하여총

6

개의실험수조

(100 L; 19±0.5ºC)

를선발하

여수조당

16

^개체

(2

^배체및

3

^배체각

8

^개체

)

^{씩을혼합수용하} 였다

.

실험수조환경에적응하기위해

48

시간동안

19±1ºC

에 서적응기간을거친후

, 6

개실험수조중

3

개의수조를대상으 로수온증가를유도하였다

.

수온증가는자동온도조절기가연 결된

300 W

석영히터를이용하여시간당

0.5ºC

씩수온상승 을유지하였고

,

^{고수온으로설정한}

30ºC

^에도달후

30±0.5ºC

에서

24

시간항온으로유지하였다

.

이때수온상승에의한용존 산소저감에효과를배제시키기위해서전기산소발생기를이

용하여

19ºC

유지대조군과

30ºC

고수온처리군의용존산소

를

6.0±0.5 ppm

으로조절하였다

.

실험군및대조군의수온과 용존산소는실험처리전기간동안매

1

^{시간간격으로측정하} 여확인하였다

.

고수온자극처리직전및종료시점에서각반 복처리수조로부터

2

배체

6

미및

3

배체

6

미를샘플링하여아 가미와간췌장에서의

HSP

유전자발현수준을분석하였다

.

이

때각개체별맨틀

(mantle)

의일부조직을샘플링하여유세포

분석

(flow cytometry)

^{을통해배수성}

(ploidy level)

^{을재검증하} 였다

(Park et al., 2018).

핵산분리, 역전사 및 RT-qPCR assay

개체별아가미및간췌장조직으로부터

total RNA

를분리하 기위해서

Tri-Reagent (Invitrogen)

을이용

,

제조사의권고방 법에따라

total RNA

^{를추출하였고}

,

^{이어추출한}

total RNA

^시 료는

RNeasy plus mini kit (Qiagen, Hilden, Germany)

을이

용하여

DNA

제거과정을포함한순수분리과정을거쳐최종

total RNA

시료를확보하였다

.

각

total RNA

시료를대상으로

Nano Drop (ND-1000; Thermo Fisher Scientific, Waltham,

MA, USA)

^{을이용하여}

260 nm, 280 nm

^및

230 nm

^에서흡광 도를측정하여

1.9

이상의

260/280 nm

및

260/230 nm

흡광도

비율을갖는

total RNA sample

들만을선발하여 역전사반응

에이용하였다

.

역전사반응은

Qiagen

사의

Omniscript RT kit

를이용하여 제조사의권고방법대로

oligo-d(T)

₂₀프라이머와

random nonamer

^{프라이머를}

9:1

^{비율로혼합하여}

cDNA

^합성 을수행하였다

.

합성된

cDNA

는멸균증류수를이용하여

10

배

희석후각증폭반응당

2 μL

씩을주형으로이용하였다

.

실시간

PCR

반응은

Light Cycler 480

시스템

(Roche Applied Science, Penzberg, Germany)

및

2X SYBR mater mix (Roche)

를이

용하여유전자증폭산물의변동을

45 cycles

^{에걸쳐검출하였}

으며

,

이후

melting curve

조사를통해서유전자별단일증폭 산물이특이적으로증폭되었음을확인하였다

. cDNA

의

serial log-dilution

샘플을이용한표준곡선

(standard curve)

작성을 통해각유전자증폭에사용된

primer pair

의

PCR efficiency

가

90-105%

^{범위에속함을검증하였고}

,

^{각유전자의}

PCR ef- ficiency

값과

threshold cycle (Ct)

값을이용하여상대정량분석

(delta CT

및

delta-delta CT)

을실시하였다

.

각조직내

HSP

유

전자들간상대발현수준의비교및각

HSP

유전자의온도자

극처리에따른차등발현수준을비교하기위해서상기합성한

cDNA

^{주형들을이용하여}

, reference

^용후보

housekeeping

^유 전자들을대상으로

geNorm software package (Hallemans et al., 2007)

에의한발현안정성을평가한결과

, normalization

효 과가가장우수하다고판정된

ribosomal protein L7 (RPL7)

유 전자

(Lee and Nam, 2016; Lee et al., 2019)

를

reference

유전자 로선정하여각

cDNA sample

^별

HSP

^{유전자들의발현수준을}

Table 1. Information on the HSP genes selected and PCR primers for RT-qPCR assay used in this study

Gene symbol Gene ID/Scaffold Primer sequence (5´-to-3´)

HSP90 HDSC00143CG00040/ HDSC00143 FW: TTGACGAGTACTGTGTCCAG

RV: ACCAGACGATTGGAAACCAC

HSP70 HDSC00042CG00040/ HDSC00042 FW: GGATCGACCCGTATTCCTAA

RV: TCCTGCTGTCTCAATGCCAA

HSIP70 HDSC00653CG00030/ HDSC00653 FW: AGAAAGCTCTGCGAGATGCT

RV: CAGAACATCCTTGATGGCGT

HSPBP1 HDSC02831CG00020/ HDSC02831 FW: TTGGCATGATTGACCAGCTG

RV: ACCTTCACAGACTCACCTGA

HSP70-12A HDSC06051CG00020/ HDSC06051 FW: GAGTCAGCCACATTGCAGTA

RV: AGCTTACTGGATGGATGACG

HSP60 HDSC04352CG00030/ HDSC04352 FW: AACCCCTTCTCATCATCGCT

RV: GATGTCCTCCAGCTTGTACA

HSP40 HDSC01574CG00060/ HDSC01574 FW: TTTCGGAGGTCCAAGTATGC

RV: CAAGTGACACCTGTAGGTCT

HSP, heat shock protein; PCR, polymerase chain reaction; FW, forward primer; RV, reverse primer. Gene IDs/Scaffolds annotated from the Haliotis discus hannai genome assembly are referred to Nam et al. (2017) and Kyeong et al. (2020). HSPBP1 gene is also referred to Park et al. (2018).

박철지

ㆍ

김은정

ㆍ

남윤권

518

normalization

^하였다

(Schmittgen and Livak, 2008). cDNA

^별

technical replication

으로서

3

반복증폭실험을통해

median Ct

값을취하여유전자발현분석에이용하였다

.

통계처리

HSP

유전자들의조직내발현수준평가및

2

배체

-3

배체간

HSP

^{유전자들의발현수준차이에대한평가는}

Student t-test

분석또는

One-way ANOVA

분석을이용

P=0.05

수준에서유 의성검정을수행하였고

, ANOVA

분석결과의경우

Duncan’s multiple range test

를이용하여평균값의분리를실시하였다

.

결 과

2배체와 3배체간 HSP 유전자들의 기초발현 수준 Normalization control

로사용한내재유전자

RPL7

유전자 의발현 수준은

2

배체와

3

배체간유의적인 차이가관찰되지 않았다

(data not shown). 19ºC

^{수온조건에서샘플링한}

2

^배체 의아가미에서

HSP

유전자들의기초발현수준을평가한결 과

, HSP90

이가장높은발현량을그리고이어서

HSP70

이두 번째로 높은발현량을 나타내었다

.

나머지유전자들이 경우

HSP70-12A, HSP40

및

HSP60

순으로발현수준이관찰되었 고

, HSPBP1

^및

HSIP70

^{유전자들이가장낮은발현량을나타} 내었다

(P<0.05). 3

배체에서도상기

2

배체에서의발현패턴과

유사한경향을나타내어

3

배체아가미조직내

HSP

유전자들의

상대발현량의순위에는차이가없는것으로관찰됨으로써

, 3

배

체에서도역시

HSP90

이가장높은발현량을그리고

HSPBP1

및

HSIP70

^{이가장낮은발현수준을보였다}

.

^그러나각

HSP

유전자별

2

배체및

3

배체그룹간발현량을비교시분석한

7

개

HSP

유전자들모두에서

3

배체가높은발현수준을나타내는경

향을보였으며

,

이중

HSP90

및

HSP40

을제외한

5

개

HSP

유전 자들에서통계적인차이가관찰되었다

(P<0.05).

통계적유의차 가인정되는

5

^개의

HSP

^{유전자들은}

2

^{배체의평균값과비교시}

3

배체에서의

1.3-2.6

배높게나타났고

,

이중

HSP60

에서

2

배체 와

3

배체간가장큰차이를보였다

(Fig. 1A).

간췌장에서의

HSP

유전자들의발현분석결과

,

이배체의경 우역시

HSP90

및

HSP70

이상대적으로다른

HSP

유전자들에 비해월등히높은발현량을나타낸다는점

,

^{그리고이들두유}

전자에이어서

HSP70-12A

가높은발현수준을보인다는점에

서아가미에서의발현결과와유사하였다

.

반면

,

다른

HSP

유 전자들의경우

,

아가미와달리간췌장에서는

HSIP70

유전자가

HSP40, HSP60

및

HSPBP1

보다유의적으로높은발현을나타 내는차이가관찰되었다

(P<0.05). 3

^{배체간췌장내}

HSP

^유전자 들의기초발현경향역시

HSP90/HSP70

이매우높은발현을

,

그리고

HSPBP1, HSP40, HSP60

에서상대적으로낮은발현을 보인다는점에서

2

배체에서의결과와유사하였으나

, 2

배체와 달리

3

배체의경우

HSIP70

의유전자발현이

HSP70-12A

보다

더높게나타나차이가있었다

.

한편

,

각

HSP

유전자별

2

배체와

3

배체간기초발현수준을비교한결과

,

분석한

7

개의유전자

중아가미에서와마찬가지로

HSP90

및

HSP40

에서는유의적 인차이가없었고

(P>0.05),

그외추가적으로

HSP70

유전자역 시간췌장에서는통계적인유의차가인정되지않았다

(P>0.05).

나머지

4

개유전자중

HSIP70, HSPBP1

및

HSP60

에서는

3

배 체가

2

배체에비해

3.6-6.3

배높은기초발현수준을나타낸반 면

, HSP70-12A

의경우

2

배체가

3

배체에비해

10

이상의높은 기초발현수준을나타내었다

(P<0.05) (Fig. 1B).

아가미에서 2배체와 3배체들간 고수온 자극에 대한 HSP 유전자들의 차등 발현

2

배체및

3

배체모두에서고수온자극처리에의해

HSP

유전 자들의다양한유도발현양상이관찰되었으며

,

각

HSP

유전자 별로유도발현의민감도및

fold change

값에큰차이를나타내

(A)

(B)

1 10 100 1000 10000

H SP 90 H SP 70 H SI P7 0 H SP BP 1 H SP 70 -1 2A H SP 60 H SP 40

Relative mRNA expression levels of HSP genes (normalized against RPL7)

*

* *

*

*

a a

b c

d f e

u u

w v x z y

Diploid (2N) Triploid (3N)

1 10 100 1000 10000

H SP 90 H SP 70 H SI P7 0 H SP BP 1 H SP 70 -1 2A H SP 60 H SP 40

Relative mRNA expression levels of HSP genes (normalized against RPL7)

Diploid (2N) Triploid (3N)

*

*

*

* b a

d c

e g f

v x v w

y

z z

(A)

(B)

0 20 40 60 80 100 120

H SP 90 H SP 70 H SI P7 0 H SP BP 1 H SP 70 -1 2A H SP 60 H SP 40

*

*

Fold change of

expression relative to 19

°C-control group

Diploid (2N) Triploid (3N)

0 1 2 3 4 5

HSPBP1 HSP70-12A HSP60 HSP40

* *

1 10 100 1000 10000 100000

H SP 90 H SP 70 H SI P7 0 H SP BP 1 H SP 70 -1 2A H SP 60 H SP 40

Relative mRNA expression (normalized against RPL7)

Diploid (2N) Triploid (3N)

*

* * *

a a b

c c e d

v w w

x x y z

(A)

(B)

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600

H SP 90 H SP 70 H SI P7 0 H SP BP 1 H SP 70 -1 2A H SP 60 H SP 40

*

*

Fold change of *

expression relative to 19

°C-control group

Diploid (2N) Triploid (3N)

0 5 10 1520 25 30

HSP90 HSP70 HSP70 -12A HSP40

1 10 100 1000 10000 100000

H SP 90 H SP 70 H SI P7 0 H SP BP 1 H SP 70 -1 2A H SP 60 H SP 40

*

*

*

a b c

d e e

f

z z

y x

w x

w

Relative mRNA expression (normalized against RPL7)

Diploid (2N) Triploid (3N)

* *

Fig. 1. Basal mRNA expression levels of selected heat shock re- sponse genes at 19ºC in the gill (A) and hepatopancreas (B) of dip- loid and triploid abalone Haliotis discus hannai juveniles. Within a given ploidy group, means with different letters (a-g in 2N and u-z in 3N) are significantly different based on ANOVA followed by Duncan’s multiple range tests at P<0.05. Also within a given HSP gene, statistical difference between diploid and triploid groups is indicated by asterisk based on student’s t-test at P<0.05. HSP, heat shock protein.

전복 2배체 및 3배체에서 주요 HSP 유전자들의 발현

519

었다

. 2

배체의경우

RPL7 normalization

을토대로

19ºC

유지

군의경우앞서시행한기초발현수준평가와비교시

HSP

유

전자발현수준의순서및상대발현수준에서큰차이를나타 내지않았다

.

반면

30ºC

로수온상승그룹의경우

19ºC

항온유

지군에비해서

HSP

^{유전자별로다양한폭의유도발현수준이}

관찰되었는데

30ºC/19ºC fold change

값을기준시

, HSIP70 (> 80-fold)

에서가장많은변화가유발되었고

,

이어서

HSP90 (22.5-fold)

및

HSP70 (17.8-fold)

에서많은발현수준의변화가 관찰되었다

(P<0.05).

^나머지

HSP40, HSP70-12A

및

HSPBP1

유전자의경우

1.5-fold

^에서

4.0-fold

^{의비교적소폭의유전자} 발현증가를나타내었으며

(P<0.05),

^다른

HSP

유전자들과는

달리

HSP60

의경우이배체아가미에서고수온자극에의한유

의적인발현의증감은관찰되지않았다

(P>0.05) (Fig. 2A).

3

^{배체의경우고수온자극에의해}

HSIP70, HSP90

^및

HSP70

이 다른

HSP

유전자들에 비해 상대적으로 많은 폭의

fold

change

변화가관찰된다는측면에서

2

배체에서의발현패턴

과유사하였다

(P<0.05).

그러나

3

배체의경우

2

배체에서고수

온에발현의증가를나타낸바있는

HSP70-12A

가

3

배체에서

는오히려발현이감소되는결과를보인다는점

(P<0.05),

^그리 고

2

배체에서는고수온자극에발현의변화가없는

HSP60

유 전자가

3

배체에서는동일고수온자극에대해서

4

배에가까운 발현증가를나타낸다는점에서

2

배체와뚜렷한차이를보였 다

(P<0.05) (Fig. 2A).

각

HSP

^유전자별

fold change

^값에관한

2

^배체와

3

^배체간차 이를비교할경우

HSP90, HSPBP1

그리고

HSP40

에서는유의 적인차이가없었으나

HSP70 (2N vs 3N=18-fold vs. 10-fold)

및

HSIP70 (89-fold vs. 32-fold)

에서

2

배체가

3

배체에비해 유의적으로높은유도발현민감도를나타내었다

(P<0.05).

이

에기초발현수준을반영한고수온자극시최종발현양

(end-

point expression level)

을

HSP

유전자별로

2

배체와

3

배체를비 교할경우

,

역시

HSP90, HSPBP1

그리고

HSP40

에서는고수 온자극이후

2

배체와

3

배체가유사한발현수준에도달하는 것으로나타났으며

(P>0.05), HSP70 (2N/3N ratio=1.4-fold), HSIP70 (1.8-fold)

^및

HSP70-12A (4.6-fold)

^{에서는고수온자} 극에의해

2

배체가

3

배체에비해더높은발현량을최종나타 내었다

(P<0.05).

^반면

HSP60

의경우

3

배체가기초발현수준 이

2

배체에비해더높았음에도

(2.6-fold)

불구하고고수온자 극시

3

배체특이적인유도발현을나타냄으로써고수온처리이 후

2

^배체와

3

^{배체간발현수준의차이는더심화되었다}

(3N/2N ratio=9.5-fold) (P<0.05) (Fig. 2B).

간췌장에서 2배체와 3배체들간 고수온 자극에 대한 HSP 유전자들의 차등 발현

아가미에서와마찬가지로고수온자극에의해간췌장에서도

HSP

^{유전자별다양한}

fold change

^{값이관찰되었고}

HSP

^유전 자종류에따라

2

배체와

3

배체간유도발현의민감도및고수 온자극처리후최종도달유전자발현량에차이가관찰되었 다

. 2

배체간췌장의경우고수온자극에의해가장큰폭의

fold change

를나타낸유전자는

HSIP70 (30ºC/19ºC ratio=1,200-

fold)

^{로써 급격한 발현 증가가 유도되었고}

, HSIP70

^{에 이어}

HSPBP1

역시 고수온처리에의해

300

배 이상의발현증가

가 관찰되었다

(P<0.05).

^이들두

HSP

유전자외에

HSP90

및

HSP70

에서약

18-fold

에서

20-fold

의발현증가가관찰되었으 며

HSP40

및

HSP60

의경우각각

1.4-fold

및

2.8-fold

의유전 자발현증가를나타내었다

(P<0.05).

^반면

HSP70-12A

^에서는 고수온자극에의해오히려발현이감소하는결과를나타내어 아가미에서의결과와차이를보였다

(P<0.05). 3

^{배체의경우역} 시

HSIP70

및

HSPBP1

에서높은유도발현을나타내었으나그

fold change

값의증가폭이

2

배체에비해서상대적으로낮았고

(B)

1 10 100 1000

H SP 90 H SP 70 H SI P7 0 H SP BP 1 H SP 70 -1 2A H SP 60 H SP 40

Relative mRNA expression levels of HSP genes (normalized against RPL7)

* *

*

*

a a

b c

d f e

u u

w v x z y

1 10 100 1000 10000

H SP 90 H SP 70 H SI P7 0 H SP BP 1 H SP 70 -1 2A H SP 60 H SP 40

Relative mRNA expression levels of HSP genes (normalized against RPL7)

Diploid (2N) Triploid (3N)

*

*

*

* b a

d c

e g f

v x v w

y

z z

(A)

(B)

0 20 40 60 80 100 120

H SP 90 H SP 70 H SI P7 0 H SP BP 1 H SP 70 -1 2A H SP 60 H SP 40

*

*

Fold change of

expression relative to 19

°C-control group

Diploid (2N) Triploid (3N)

0 1 2 3 4 5

HSPBP1 HSP70-12A HSP60 HSP40

* *

1 10 100 1000 10000 100000

H SP 90 H SP 70 H SI P7 0 H SP BP 1 H SP 70 -1 2A H SP 60 H SP 40

Relative mRNA expression (normalized against RPL7)

Diploid (2N) Triploid (3N)

*

* * *

a a b

c c e d

v w w

x x y z

(A)

(B)

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600

H SP 90 H SP 70 H SI P7 0 H SP BP 1 H SP 70 -1 2A H SP 60 H SP 40

*

*

Fold change of *

expression relative to 19

°C-control group

Diploid (2N) Triploid (3N)

0 5 1015 20 25 30

HSP90 HSP70 HSP70 -12A HSP40

1 10 100 1000 10000 100000

H SP 90 H SP 70 H SI P7 0 H SP BP 1 H SP 70 -1 2A H SP 60 H SP 40

*

*

*

a b c

d e e

f

z z

y x

w x

w

Relative mRNA expression (normalized against RPL7)

Diploid (2N) Triploid (3N)

* *

Fig. 2. Differential expression of HSP genes in response to acute thermal challenge (elevation of water temperature from 19ºC to 30ºC) in the gill of diploid and triploid abalone Haliotis discus han- nai juveniles. (A) Fold changes of induced expression at the end of heat shock treatment relative to 19ºC-control group. (B) Rela- tive end-point expression levels normalized. In (A) and (B), aster- isks indicate the statistical difference between diploid and triploid groups based on Student’s t-test at P<0.05. In (B), within a given ploidy group, means with different letters (a-e in 2N and v-z in 3N) are significantly different based on ANOVA followed by Duncan’s multiple range tests at P<0.05. HSP, heat shock protein.