Effects of Cicadae Periostracum (CP) in Allergic Contact Dermatitis (ACD) Induced by DNCB in Mice

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Received: April 6, 2015 ∙ Revised: May 13, 2015 ∙ Accepted: May 15, 2015 Corresponding Author: Chae Jung Won

Department of Pediatrics, Dongshin University Hospital at Mokpo, 313, Baeknyeon-daero, Mokpo-si, Jeonlanam-do, 530-822, Republic of Korea.

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DNCB로 유발된 생쥐의 알레르기성 접촉피부염에 蟬蛻가 미치는 영향

김빛나래ㆍ채중원

동신대학교 한의과대학 소아과학교실

ISSN 1226-8038(Print), 2287-9463(Online), http://dx.doi.org/10.7778/jpkm.2015.29.2.001

Abstract

Effects of Cicadae Periostracum (CP) in Allergic Contact Dermatitis (ACD) Induced by DNCB in Mice

Kim Bit Na Rae․Chae Jung Won

Department of Pediatrics, College of Oriental Medicine, Dongshin University

Objectives

In the theory of Korean Medicine, Cicadae Periostracum (CP) has been used to treat skin diseases such as inflammatory dermatitis, tetanus and pruritus. CP can reduce heat and disperse wind. In prior studies, anti-allergic effect and anti-inflammatory effect of CP were reported. However, there has been no report regarding the correlation of CP and allergic contact dermatitis (ACD). This study was performed to show the effects of CP in ACD induced by 2,4-dinitrochlorobenzene (DNCB) in mice.

Methods

In this experiment, the effects of CP on biological changes were measured, such as changes in ear and spleen weight, ear and dorsum skin thickness, clinical aspect on the dorsum skin and histological changes.

The effect of proliferation rate of splenocytes was also investigated in vitro and vivo study.

Results

In results, CP application (CPA) group and CP application and administration (CPAA) group were significantly restrained in ear weight gain and increase in ear and dorsum skin thickness compared to the control group. In addition, CPA and CPAA group showed diminished erythema, desquamation, bloodstain, and marks. Also, the histological assessment showed that CP treatement diminished thickness of epidermis, hyperkeratosis, pigmentation and parakeratosis.

Conclusions

In conclusion, these data suggest that CP can decrease symptoms of ACD.

Key words : Cicadae Periostracum (CP), Allergic contact dermatitis (ACD), 2,4-dinitrochlorobenzene (DNCB)

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Ⅰ. Introduction

1970년대 이후 전 세계적으로, 특히 서구화가 이루 어진 도시에서 알레르기 질환의 유병률이 급격하게 증 가하였다. 우리나라도 1960년대에 비해서 2000년대에 알레르기 질환의 유병률이 3 ∼ 5배 증가하였는데, 이 러한 증가의 원인은 유전적 요인보다는 대기 오염, 주 거환경 변화로 인한 알레르겐 노출 등 환경적 요인의 변화가 주 요인이라 할 수 있다¹⁾.

알레르기 질환은 어른보다 소아에게서 많이 볼 수 있으며 소아의 약 20%에서 발생하는데, 소아는 생체 구조와 기능이 미숙하여 알레르겐의 침입을 받기 쉽기 때문이다. 또한 신생아 때는 모친의 태반을 거친 알레 르겐 외에는 알레르겐에 노출될 기회가 적으나 성장하 면서 점차 여러 가지 알레르겐에 접촉하게 되므로 알 레르기 질환이 많이 발생한다²⁾.

특히 피부는 외부 환경과 경계부에 있기 때문에 각 종 면역 과민성 질환을 유발시키는 알레르겐에 항상 노출되어 있으며, 이 때문에 인체의 보호를 위한 다양 한 면역학적 방어기전을 가지고 물리화학적 장벽으로 서의 역할을 한다³⁾.

피부 장벽이 기능을 제대로 하지 못하여 발생하는 알레르기 질환 중 접촉피부염 (contact dermatitis)은 인체 외부의 여러 환경인자나 화학 물질과의 접촉에 의해 발생하는 모든 피부염을 말한다⁴⁾. 그 중 알레르기 성 접촉피부염 (allergic contact dermatitis, ACD)은 개 체가 이미 항원에 감작된 후 다시 항원에 노출되면서 T림프구와 대식세포 등에 의해 발생되는 세포매개 면 역반응으로, 항원과 접촉 시 24 ∼ 48시간 사이에 염증 반응이 시작되는 지연형 과민반응 (delayed type hypersensitivity)이다⁵⁾.

한의학에서 ACD의 범주에 속하는 것은 漆瘡^6,7), 狐尿刺⁷⁾, 粉花瘡⁸⁾, 膏藥風⁹⁾등으로, 모두 외부 물질의 접 촉에 의해 발생하는 피부질환이며 발병 원인이나 증상 이 ACD와 유사하다. 이 피부질환들은 증상과 병정에 따라 急性期에는 風熱, 濕熱, 熱毒 등으로 변증하여 淸熱, 解毒, 祛風, 利濕, 凉血의 치법을 위주로 치료하고, 慢性期에는 熱毒으로 인하여 津液이 손상된 血燥로 변증하여 祛風, 養血의 치법을 위주로 치료한다.

蟬蛻 (Cicadae Periostracum, CP)는 매미과 (蟬科, Cicadidae)에 속한 곤충인 昆蟬 Cryptotympana pustulata Fabricius 또는 黑蟬 Cryptotympana atrata

Fabricius의 유충이 땅 속에서 나와 성충이 될 때 탈피 한 껍질로, 蟬退, 蟬殼, 蟬甲이라고도 불린다. 그 성질 은 차고 달며, 주로 肺, 肝經으로 들어가 風熱을 흩어 지게 하고 肺氣를 소통시키며 경련을 진정시키는 효능

이 있다^11-2). CP는 《本草綱目》¹³⁾, 《東醫寶鑑》¹⁴⁾등

의 문헌에서 피부 질환에 다양하게 활용되었으며 선행 연구를 통해 CP의 항알레르기 효과¹⁵⁾와 항염 효과¹⁶⁾ 등이 검증되었다. 그러나 ACD가 유발된 동물실험모델 에서 ACD로 인한 생체의 다양한 변화와 CP 간의 유의 성 검증과 CP를 직접 도포하거나 경구 투여하였을 경 우의 차이에 대한 연구는 이루어지지 않았다.

이에 본 연구에서는 CP가 ACD의 치료에 활용될 수 있는 근거를 마련하기 위해, DNCB로 ACD를 유발한 생쥐에 CP를 도포 및 경구 투여하여 귀와 비장 무게, 귀와 등 피부 두께, 피부 표면의 육안적 소견 및 피부 조직의 병리학적 소견을 관찰하고 생체 내와 시험관 내에서 비장세포 증식률에 미치는 영향을 관찰한 결과 유의성이 있었기에 보고하는 바이다.

Ⅱ. Materials and methods

1. 재료 1) 시료

이번 실험에 사용된 蟬蛻 (Cicadidae Periostracum, CP)는 매미과 (蟬科, Cicadidae)에 속한 곤충인 昆蟬 Cryptotympana pustulata Fabricius 또는 黑蟬 Cryptotympana atrata Fabricius의 유충이 땅 속에서 나와 성충이 될 때 탈피한 껍질로서 동신대학교 부속 목포한방병원에서 구입하여 사용하였다.

2) 실험 동물

동신대학교 실험동물윤리위원회 (DSU-2014-031)의 승인을 거친 후, 7주령의 수컷 Balb/c 생쥐 (mouse)를 동물실험 전문업체 (Samtako, Korea)에서 구매하여 사 용하였다. 반입 후 식품의약품안전처에서 고시한 동물 실험시설의 규정에 적합한 사육시설에서 1주일 간 적 응시켰으며 적응기간 중에는 고형사료와 물을 충분히 공급하였고 12시간 명암주기 및 실내온도 (24 ± 2 ℃) 와 습도 (55 ± 5%)를 일정하게 유지시켰다.

3) 알레르기성 접촉피부염 유발

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알레르기성 접촉피부염 (Allergic Contact Dermatitis, ACD)을 인위적으로 유발시키기 위해서 Sigma 社 (시약 번호 : 237329, USA)에서 2,4-dinitrochlorobenzene (DNCB)을 구매하여 사용하였다.

2. 방법

1) 시료의 제조 및 투여

경구 투여용 약물로 활용할 시료는 CP 100 g을 증 류수 (D/W) 1,500 ㎖에서 100 ℃로 4시간 동안 달이고 이후 찌꺼기를 제거한 상층액을 모아서 감압농축기 (EYELA, Japan)를 이용하여 농축한 후 동결건조기 (Samwon, Korea)를 이용해 동결 건조하여 사용하였 다. 건조된 분말을 증류수에 희석하여 경구 투여하였 다. CP의 동결 건조분말은 2.4 g으로 수득률은 2.4%이 었다.

도포용 약물은 CP 100 g을 100% 에탄올에 24시간 동안 담가 놓은 후 이를 추출해 농축시켜 동결 건조한 후 사용하였다. 이 추출물을 다시 에탄올에 녹인 후 acetone과 olive oil을 4 대 1로 섞은 AOO 혼합액에 100 mg/ml의 희석률로 희석하여 도포하였다.

2) 알레르기성 접촉피부염의 유발 방법

ACD를 유발하기 위해 AOO 혼합액에 DNCB를 1%

비율로 희석한 혼합용액 (이하 혼합용액)을 제모된 생 쥐의 피부에 도포하였다¹⁷⁾. 이를 위해 동물전용 마취제 인 zoletile (Virbac, France)을 완충용액 (PBS)에 1 : 100 비율로 희석하여, 평균 생쥐 무게인 20 g 기준으로 100 ㎕를 복강 주사하여 마취시켰다. 이후 전기면도기 를 사용하여 엉덩이 쪽부터 1 차 제모한 후 도포용 주 걱으로 크림용 제모제를 발라 넓게 도포한 후 5 ∼ 10 분 방치하였다. 이후 온수를 거즈에 묻혀 제모제를 제 거하고 다시 거즈를 이용하여 깨끗한 온수로 다시 세 척한 후 티슈로 물기를 제거하고 상처 치유를 위해 24 시간 방치하여 제모시켰다.

24시간이 지난 후 isoflurane (중외제약, 한국)을 마 취통에 1.5 ㎖ 넣어 호흡을 통해 마취시킨 후 귀 부위 와 등 부위에 혼합용액을 도포하였다. 귀 부위는 pipet (yellow tip)을 이용하여 1일 1회 3일간 혼합용액 30 ㎕ 을 도포하고, 등 부위는 1일 1회 3일간 혼합용액 50 ㎕ 을 도포하였다. 이후 3일간 관찰 후 등 부위에 CP 에탄 올 추출액 도포를 시작하면서 2일 1회에 걸쳐 혼합용 액을 귀와 등에 각각 30 ㎕과 50 ㎕씩 도포하여 최종적

으로 ACD를 유발하였다.

3) 시료 투여 및 도포

경구 투여는 경구 투여용 시료를 투여량 500 mg/kg/day 농도로 11일간 투여하였고, 도포는 도포용 으로 제조된 시료를 사용하여 등 부위에 시행하였으며 경구 투여 및 도포는 오후 2시경에 이루어졌다. ACD 유발 약물과 도포용 약물의 도포 간격은 최소 4시간 이상 차이를 두었고 도포 용량은 혼합액 기준으로 50

㎕로 했으며 11일간 매일 도포하였다.

4) 군 설정

군은 정상군, 대조군, 도포군, 도포와 경구 병행 투 여군으로 구분하였다. 정상군 (normal)은 제모 후 ACD 유발약물인 혼합용액을 대신하여 증류수를 도포 한 후 증류수를 경구 투여하고 AOO 혼합액을 도포한 군이며, 대조군 (control group, CON)은 혼합용액을 도포하여 ACD를 유발하고, 증류수를 경구 투여하고 AOO 혼합액을 도포한 군으로 설정하였다. CP 도포군 (CP application, 이하 CPA)은 ACD를 유발하여 증류 수를 경구 투여하고 CP 에탄올 추출액을 도포한 군이 며, CP 도포 및 경구 투여군 (CP application and administration, 이하 CPAA)은 ACD를 유발하고 CP 에 탄올 추출액의 도포와 CP 전탕액의 경구 투여를 동시 에 시행한 군으로 설정하였다. 각각의 개체 수는 정상 군과 대조군은 8마리였고, 실험군들은 10마리로 실험 을 시행하였다.

5) 귀 및 비장 무게의 측정

희생시킨 생쥐의 귀를 수동형 펀치기를 이용하여 직경 5 mm의 둥근 절편을 만들어 측정하였고, 비장의 경우 희생시킨 생쥐를 개복한 후 비장 전체를 적출하 고 측정하였다. 측정기기는 미량 저울 (OHAUS, USA) 을 이용하였다.

6) 귀 및 등 피부 두께의 측정

ACD가 유발된 생쥐에서 약물의 도포 및 투여로 변 화된 상태를 관찰하는 지표로 귀 두께와 등 피부 두께 를 측정하기 위하여 희생시킨 생쥐의 등 피부와 귀의 피부를 절제한 후 측정 장치 (디지털 캘리퍼, Mitutoyo, Japan)를 이용하여 두께를 측정하였다.

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7) 피부 표면의 육안적 관찰 및 Symptom score 판정 실험을 마친 후 약물의 도포 및 투여에 따른 ACD의 변화 정도를 관찰하기 위하여 각 군별 생쥐의 등 부위 를 디지털 카메라 (Samsung, Korea)로 촬영하였다. 이 를 토대로 생쥐의 등에 발생한 피부질환의 병변 정도 를 수치화하였으며 피부 부종과 종창의 정도를 다음의 기준에 따라 판정하였다.

점수 피부상태

0점 피부병변이 없는 정상인 상태

1점 경미한 착색이 있는 상태

2점 짙은 착색 및 홍반이 있는 상태

3점 홍반과 낙설이 동반된 상태

4점 홍반과 낙설, 혈흔이 존재하는 상태

5점 홍반과 낙설, 혈흔이 뚜렷한 상태

8) 조직학적 관찰 (Histological assessment) 3주간의 실험을 마친 후 각각의 약물투여로 발생한 생쥐 피부의 조직학적 관찰을 위해 H & E 염색 (Hematoxylin & Eosin stain)을 시행하였다. 희생된 생 쥐로부터 등 부위 피부 조직을 적출하여 10% 포르말 린에 고정한 후 파라핀에 포매하고 이를 미세절단기 (Sakura, Japan)를 이용하여 4 ㎛ 두께로 박절해 슬라 이드에 부착시키고 탈수와 투명 과정을 거쳐 흐르는 물에 침전시켰다. 파라핀을 제거한 후 조직 절편을 Hematoxylin (HHS32, SIGMA)과 Eosin (HT110232, SIGMA)으로 염색하였고 과염색된 부분은 흐르는 수 돗물에 5분 정도 수세하였다. 이후 탈수 및 투명 과정 을 거쳐 봉입하여 100배율의 광학현미경으로 관찰하 였다.

9) 비장세포 증식률에 미치는 영향 (1) in vitro 실험

약물 및 시료 등을 처치하지 않은 상태의 생쥐에서 비장을 적출한 다음 이것에서 추출한 비장세포 (splenocyte)의 부유액을 RPMI 1640 배지로 희석하고 96 well plate에 1.0 × 106 cells/㎖ 농도로 나눈 후 LPS 5 ㎕/㎖와 각각의 농도로 희석한 CP를 첨가하여 24시 간 동안 배양하였다. 이후 Ez-cytox 15 ㎕를 각 well에 첨가하고 24시간 정도 배양한 후 well의 흡광도를 Microplate Reader로 450 nm에서 측정하였다.

(2) in vivo 실험

실험을 통해 각종 약물과 시료가 처치된 생쥐에서 비장을 적출한 뒤 비장세포의 부유액을 RPMI 1640배 지로 희석하고 96 well plate에 1.0 × 106 cells/㎖ 농도 로 나눈 후 LPS 5 ㎕/㎖를 첨가하여 배양하였다. 이후 Ez-cytox 15 ㎕를 각 well에 첨가하고 48시간 정도 배 양한 후 well의 흡광도를 Microplate Reader로 450 nm 에서 측정하였다.

3. 통계 처리

데이터의 통계 처리는 통계프로그램인 SPSS ver. 21 을 사용하였고 one-way ANOVA를 시행한 후 사후검 정은 Tukey 방법을 활용하였다. 이 때 P 값이 0.05 미 만인 경우 유의한 것으로 인정하였다.

Ⅲ. Results

1. 귀 무게에 미치는 영향

실험이 끝난 후 희생된 생쥐의 귀를 일정한 크기로 잘라낸 후 무게를 측정하여 각 군 간을 비교한 결과 control군에 비해서 CP를 처치한 CPA군 (P<0.05)과 CPAA군 (P<0.01)이 모두 유의하게 귀 무게가 감소된 것이 관찰되었다 (Table 1, Fig. 1).

2. 귀 두께에 미치는 영향

실험을 마친 후 희생된 생쥐의 귀 피부를 가위를 이 용하여 절제한 후 디지털 캘리퍼를 이용하여 귀 피부 의 두께를 비교하였다. 실험결과 control군에 비해서 CPA군 (P<0.01)과 CPAA군 (P<0.01)이 모두 유의하게 귀 두께가 감소하였다 (Table 2, Fig. 2).

3. 등 피부 두께에 미치는 영향

실험을 마친 후 희생된 생쥐의 등 피부를 가위를 이 용하여 절제한 후 디지털 캘리퍼를 이용하여 등 피부 의 두께를 비교하였다. 실험결과 control군에 비해서 CPA군 (P<0.01)과 CPAA군 (P<0.01)이 모두 유의하게 얇아진 것을 확인할 수 있었다 (Table 3, Fig. 3).

4. 등 피부 표면의 육안적 증상 및 Symptom score에 미 치는 영향

실험이 끝난 후 희생시키기 직전 카메라를 통해 등

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Table 1. The Changes of Ear Weight in ACD Induced Mice

Ear weight (g)

mean SD

Normal 0.0069 0.00092

Control 0.0159 0.00181

CPA 0.0140* 0.00132

CPAA 0.0122** 0.00184

Normal : naive group, Control : only ACD group, CPA : CP application group, CPAA : CP application and administration group. Values are represented as mean ± SD. All groups data were expressed as mean ± SD of 8 ∼ 10 experiments.

* : Statistically significance compared with control group (* ; P<0.05).

** : Statistically significance compared with control group (** ; P<0.01).

Fig. 1. The changes of ear weight in ACD induced mice

* : Statistically significance compared with control group (* ; P<0.05).

Table 2. The Changes of Ear Thickness in ACD Induced Mice

Ear thickness (mm)

Mean SD

Normal 0.1981 0.00884

Control 0.4975 0.06600

CPA 0.3435** 0.04358

CPAA 0.3135** 0.02668

Fig. 2. The changes of ear thickness in ACD induced mice

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Table 3. The Changes of Thickness of Dorsum Skin in ACD Induced Mice

Thickness of dorsum skin (mm)

Mean SD

Normal 0.4675 0.07815

Control 0.8140 0.08502

CPA 0.5600** 0.03615

CPAA 0.5790** 0.03367

Fig. 3. The changes of thickness of dorsum skin in ACD induced mice

Table 4. Effects of CP on Symptom Score in ACD Induced Mice

Symptom score

Mean SD

Normal 0 0

Control 4.25 0.71

CPA 2.38** 0.52

CPAA 2.25** 0.71

Normal : naive group, Control : only ACD group, CPA : CP application group, CPAA : CP application and administration group. Values are represented as mean ± SD. All groups data were expressed as mean ± SD.

Fig. 4. Effects of CP on symptom score in ACD induced mice Symptom scores were estimated in each animal respectively.

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Normal

Control

CPA

CPAA

Fig. 5. Effects of CP on clinical aspect in ACD induced mice

Clinical aspect of dorsum skin in ACD mice were observed using digital camera at the end of the day. Top : normal group, Second : control group, Third : CPA group, Bottom : CPAA group.

Normal : naive group, Control : only ACD group, CPA : CP application group, CPAA : CP application and administration group.

피부에서 관찰되는 임상 양상을 5점 척도로 수치화하 여 관찰하였다. DNCB를 처치하지 않은 normal군의 등 피부에서는 특별한 변화를 관찰 할 수 없었고, 혼합 용액으로 ACD를 유발시킨 후 증류수를 처치한 con-

trol군의 등 피부에서는 혈흔을 비롯한 피부의 홍반, 낙 설 그리고 착색이 중증도 이상 관찰되었다. 하지만 CPA군과 CPAA군에서는 이러한 홍반 및 낙설이 현저 하게 감소되는 경향을 보였다 (Table 4, Fig. 4 - 5).

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A B

C D

Fig. 6. Histologic examination of skin lesion in DNCB-induced dermatitis model of mice

Skin biopsy was stained with hematoxylin and eosin (H & E). (A : normal, B : control, C : CPA, D : CPAA, × 100).

Table 5. The Changes of Spleen Weight in ACD Induced Mice

Spleen weight (g)

Mean SD

Normal 0.0766 0.01051

Control 0.1093 0.01306

CPA 0.1212 0.01641

CPAA 0.1219 0.01184

Fig. 7. The changes of spleen weight in ACD induced mice

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Table 6. Effects of CP on Proliferation Rates of Splenocyte in vitro

Proliferation rates

Mean (%) SD

CON(-) 0 ㎎/㎖ 100.00 3.50

CON(+) 0 ㎎/㎖ 360.72 36.85

0.0625 ㎎/㎖ 390.14** 33.74

0.125 ㎎/㎖ 392.31** 13.90

0.25 ㎎/㎖ 395.31** 28.88

0.5 ㎎/㎖ 414.97** 2.38

1 ㎎/㎖ 410.29** 6.46

Proliferation rates of splenocyte were measured using modified MTT method described in materials and methods.

CON(-) : only media group, CON(+) : LPS addition group.

** : Statistically significance compared with CON(+) group (** ; P<0.01).

Fig. 8. Effects of CP on proliferation rates of splenocyte in vitro

Proliferation rates of splenocyte were measured using modified MTT method described in materials and methods.

CON(-) : only media group, CON(+) : LPS addition group.

** : Statistically significance compared with CON(+) group (** ; P<0.01).

5. H & E 염색 소견

실험을 마친 후 희생된 생쥐의 등 피부조직을 H &

E 염색을 통해 관찰한 결과 normal군 (A)은 epidermis 가 얇게 분포하면서 다른 특이소견이 거의 관찰되지 않았고 이에 비해 control군 (B)은 epidermis의 두께가 과형성이면서 확장되어 그 주변에 과각화, 색소침착, 과립증가, 부전각화증이 정상군에 비하여 현저하게 증 가하였다. CPA군 (C)의 일부는 대조군에 비하여 정상 군에 가깝게 epidermis의 두께가 줄어들었고, 그 주변 에 세포 변형과 각화 증상 등이 감소되었다. CPAA군 (D) 역시 control군에 비하여 epidermis의 두께가 줄어 들었고 과각화, 색소침착, 과립증가, 부전각화증 등이 현저하게 감소되었다 (Fig. 6).

6. 비장 무게에 미치는 영향

실험을 마친 후 희생된 생쥐의 비장을 적출하여 무

게를 측정하여 각 군간을 비교한 결과, normal군에 비 해 다른 군에서 모두 유의하게 증가하였으나 control군 과 CP를 처치한 실험군 사이에서는 유의한 차이를 보 이지 않았다 (Table 5, Fig. 7).

7. 시험관 내 (in vitro) 비장세포 증식률에 미치는 영향 시험관 내에서 CP 추출물의 농도에 따라 변화하는 비장세포 증식률을 관찰하기 위하여 어떠한 유발 약물 과 시료가 투여되지 않은 생쥐를 희생시킨 후 비장 세 포를 분리하고 농도별로 약물을 투여하였다. 실험 결 과 농도가 증가됨에 따라 증식률이 모든 군에서 CON(+)군에 비해 유의한 수준 (P<0.01)으로 증가하는 것이 관찰되었다 (Table 6, Fig. 8).

8. 생체 내 (In vivo) 비장세포 증식률에 미치는 영향 실험을 마친 후 희생된 생쥐에서 적출한 비장에서

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Table 7. Effects of CP on Proliferation Rates of Splenocyte in vivo

Proliferation rates

Mean (%) SD

Normal 100.00 9.82

Control 104.92 4.49

CPA 102.71 3.94

CPAA 95.09 11.25

Fig. 9. Effects of CP on proliferation rates of splenocyte in vivo

Proliferation rates of splenocyte were measured using modified MTT method described in materials and methods. Values are represented as mean ± SD.

비장세포를 분리하여 증식률을 측정하였다. 세포의 증 식을 위해 LPS 5 ㎕/㎖을 첨가하였고 normal군을 100 (%)으로 환산하여 다른 군과 비교하였다. 실험 결과 CPAA군에서 다소 감소하는 경향이 보였으나 통계적 으로 유의하지는 않았다 (Table 7, Fig. 9).

Ⅳ. Discussion

접촉피부염 (contact dermatitis)은 외부 물질과의 접촉에 의해 생기는 모든 피부질환으로¹⁾, 평균적으로 전체 인구의 5 ∼ 10%에서 발생하며 피부과 외래환자 의 약 10%를 차지한다¹⁸⁾. 접촉피부염은 면역기전의 관 여 유무에 따라 접촉 물질 자체의 자극에 의해 누구에 게나 발생할 수 있는 자극성 접촉피부염 (irritant contact dermatitis, ICD)과 접촉하는 물질에 대한 알레르 기 반응이 있는 사람에게서만 발생하는 알레르기성 접 촉피부염 (allergic contact dermatitis, ACD)으로 분류 된다^1,4).

ACD의 원인 물질은 알레르겐 (allergen) 또는 항원 이라 부르며 이는 정상인에게는 반응을 일으키지 않으

나 이에 감작된 (sensitized) 사람에게는 피부염을 일으 킨다¹⁾. 이론적으로는 모든 물질이 ACD의 항원이 될 수 있으나 원인 물질의 대부분은 화학 물질로^1,19), 국내 에서 시행한 한 역학조사연구에 따르면 특히 니켈 (18%), 코발트 (14%), 크롬 (11%)이 항원성이 높다⁴⁾. 식물 중에서는 옻나무에 포함되어 있는 pentadecylca- techol, 은행나무 열매에 포함되어 있는 gingkolic acid 등이 항원성이 높으며, 우리나라에서는 옻에 직접 접 촉했을 때 뿐만 아니라 닭과 함께 달여 먹은 후 혈행성 으로 발생하는 전신성 접촉피부염 (systemic contact dermatitis)을 자주 볼 수 있다. 화장품 중에는 향료 (cinnamic alcohol, cinnamic aldehyde, balsam of Peru 등), 방부제 (parabens) 및 기제 (wool alcohol, propy- lene glycol 등) 등이 흔히 원인 물질로 작용하며 머리 염색약에 포함된 PPDA (paraphenylenediamine), 매 니큐어의 성분들도 종종 ACD를 일으킨다^19,20). 이외에 도 일상생활이나 직업적으로 노출될 수 있는 어떠한 물질이라도 항원성을 지니고 있다면 ACD를 일으킬 수 있다⁴⁾.

발생기전은 과민반응기전 중 세포매개 면역반응인 제 Ⅳ 형 지연형 과민반응으로, 초기의 감작단계

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(sensitization)와 반복 접촉시의 발현단계 (elicitation) 로 나뉜다. 원인 물질은 피부를 통해 쉽게 흡수될 수 있는 단순 화학 물질로서 불완전 항원형태인 합텐 (hapten)이며, 이것이 초기에 피부 속으로 침투되면 표 피 내에서 피부의 운반단백 (carrier protein)과 결합하 여 완전한 항원으로 작용할 수 있게 된다. 완전 항원은 Langerhans 세포에 의해 포식되어 국소 림프절로 이동 하고, 항원특이 T림프구가 형성되어 체내에서 기억세 포로 존재하게 된다. 이후에 동일한 항원이 다시 침투되 면 감작된 해당 T림프구들이 피부에서 항원과 작용하면 서 IL-1, IL-2, IL-3, IL-6, IFN-γ, TNF-α, GM-CSF 등의 각종 cytokine이 분비되어 염증반응이 유발된다^4,19).

ACD에서는 주로 홍반, 부종 등을 동반한 습진양 병 변이 발생하나 병변의 모양, 분포, 윤곽에서 습진과 차 이가 있는데, ACD의 발진은 노출 부위나 접촉 부위에 국한되어 명확한 경계, 작은 각, 곧은 선 등의 인위적인 양상으로 나타난다. ACD의 急性期에는 홍반과 선상 또는 수포가 발생하고, 자극에 의해 수포가 터지면서 진물이 날 수 있다. 亞急性期에는 삼출물이 서서히 감 소하며 경계가 불분명한 홍반과 인설이 나타나고, 慢性期에는 건조해지며 인설이 나타나고 병변이 두터워 져 태선화가 되기도 한다^1,21).

ACD는 알레르기 항원에 노출된 과거력이 있거나 특 정 화합물 또는 그와 유사한 화합물에 의해서만 발생하며, 피부의 모든 부위가 알레르기 항원에 반응하여 민감화 (sensitization)는 지속되고 민감 소실 (desensitization)은 거의 불가능하기 때문에, 먼저 원인 물질을 확인한 후 그 물질과의 접촉을 피하는 것이 중요하다. 그러나 원인이 되는 항원들은 대부분 환자의 직업과 연관되어 있는 경우가 많기 때문에 환자가 항원을 알고 있더라도 항원과 의 접촉을 피하기가 힘든 경우가 많다^19,20).

발생한 피부 증상은 습진성 질환의 치료에 준하여 시행하는데¹⁹⁾, 항히스타민제와 부신피질호르몬제가 광 범위하게 사용되고 있다. 항히스타민제는 소양감을 완 화시키기 위해 다용되지만 진정 작용이 강하여 중추신 경계를 억제하는 부작용이 있고, 부신피질호르몬제는 강력한 항염증 작용과 면역 억제 작용이 있으나 장기간 투여할 경우 뇌하수체-부신피질의 억제가 나타나 부작 용을 일으킬 수 있다²¹⁾.

한의학에서 ACD의 범주에 속하는 漆瘡, 狐尿刺, 粉花瘡, 膏藥風 중 漆瘡^6,7)은 漆의 맵고 뜨거운 성질의 毒이 조밀하지 못한 腠理에 닿아 발생하고, 狐尿刺⁷⁾는 螳螂의 분비물, 배설물에 접촉하여 발생한다. 粉花瘡⁸⁾

은 鉛粉으로 화장을 많이 하여 발생하고, 膏藥風⁹⁾은 외용약의 藥毒이 肌膚에 鬱滯하여 발생한다. 이 질환 들 모두 접촉 부위에 증상이 발현하여 紅斑, 丘疹, 腫脹, 瘙痒, 灼熱感, 焮痛 등이 나타나므로^6-9)발병원인이 나 증상이 ACD와 유사하다.

ACD에 속하는 질환들은 腠理가 不密한 신체 상태 또는 체질적인 素因이 있는 內因과 有毒한 물질에 접 촉한 外因이 결합하여 발생하며, 辛熱有毒한 邪氣에 접촉하여 營衛氣血이 鬱滯되거나 火熱로 인해 傷津耗血하여 발생한다^10,22).

변증은 증상과 病程에 따르는데, 急性期에는 급성 염증 반응인 紅斑, 水疱, 水腫, 丘疹, 大疱, 糜爛, 潰瘍, 壞死 등이 나타나고 자각적으로는 瘙痒, 灼熱感을 느 끼며 심할 경우 전신증상을 동반하므로 風熱, 濕熱, 熱毒으로 변증한다. 慢性期에는 피부가 肥厚乾燥하게 되 고 심하면 苔癬樣으로 변하게 되며 瘙痒이 극렬하므로 熱毒으로 인해 津液이 손상된 血燥로 변증한다¹⁰⁾.

치료는 內外治法을 倂用하여 病程에 따라 이루어진 다. 內治法은 急性期에 淸熱, 解毒, 祛風, 利濕, 凉血의 치법을 위주로 消風散과 龍膽瀉肝湯 등을 활용하여 치료하고, 慢性期에는 祛風, 養血의 치법을 위주로 四物消風飮, 當歸飮子 등을 활용하여 치료한다. 外治法 은 急性期에 苦寒한 약성을 가진 淸熱燥濕하는 약물 들을 洗劑, 散劑로 多用하고, 慢性期에는 活血, 養血하 는 약물들을 膏劑로 多用한다^10,22).

최근 항히스타민제와 부신피질호르몬제를 이용한 ACD의 치료에 여러 부작용이 보고되고 있으며²¹⁾, 이에 부작용이 적으면서 유의한 효과가 있는 치료법을 찾기 위한 연구의 일환으로 한의학적인 연구가 활발하게 이 루어지고 있다. DNCB (2,4-dinitrochlorobenzene)는 ACD의 원인 물질로 장기간의 반복 접촉을 통해 감작되 는 다른 항원과 다르게 1회 접촉만으로 감작화가 되므 로¹⁾ 최근 이루어지는 동물 실험에서 다용되고 있다.

DNCB는 과민한 세포성 면역반응을 일으켜 상피의 각 질형성세포의 과형성, 진피 상부의 염증 세포 침윤, 비 만세포와 T림프구의 증가 등이 나타나며^23,24), 실험실에 서 DNCB에 의해 유발된 염증에서는 피부 홍반, 귀 부 종, 피부조직 변화 등이 관찰된다²⁵⁾. DNCB로 유발한 ACD에 대한 한의학적 연구는 黃芩²⁶⁾, 生地黃²⁷⁾, 金銀花

28), 玄蔘²⁹⁾, 馬齒莧³⁰⁾, 苦蔘³¹⁾등의 개별 한약재와 連翹敗毒散³²⁾, 黃連解毒湯³³⁾, 散風苦蔘丸³⁴⁾, 凉膈散火湯³⁵⁾, 四妙勇安湯³⁶⁾, 牛蒡解肌湯³⁷⁾, 消風散³⁸⁾, 祛風燥濕解毒方³⁹⁾, 內托千金散²³⁾, 桂枝芍藥知母湯⁴⁰⁾등의 처방을 활

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용하고 있는데, 대부분이 淸熱解毒26-30,32-7)의 치법을 위 주로 이루어졌고, 淸熱祛風利濕³¹⁾, 淸熱凉血祛風^23,38), 淸熱解毒祛風利濕³⁹⁾, 祛風利濕凉血⁴⁰⁾등의 치법을 이 용한 연구도 있다.

蟬蛻 (Cicadae Periostracum, CP)는 매미과 (蟬科, Cicadidae)에 속한 곤충인 昆蟬 Cryptotympana pustulata Fabricius 또는 黑蟬 Cryptotympana atrata Fabricius 의 유충이 땅 속에서 나와 성충이 될 때 탈피한 껍질이다.

그 성질은 차고 달며, 주로 肺, 肝經으로 들어가 肺經의 風熱을 흩어지게 하여 解表透疹의 효능이 있고, 肝經에 들어가 凉肝熄風시켜 止痙退翳의 효능이 있다. 따라서 外感風熱, 咳嗽로 인하여 목소리가 쉬는 증상, 痲疹의 발진이 늦은 증상, 風疹의 瘙痒, 소아 驚癎, 目赤, 翳障, 疔瘡腫毒, 破傷風 등을 치료한다^11,12). 《本草綱目》¹³⁾에 는 “治頭風眩運, 皮膚風熱, 痘疹作痒, 破傷風及疔腫毒瘡.”이라 하여 CP가 피부의 瘡瘍風熱이나 痘疹의 瘙痒, 破傷風 및 疔腫毒瘡 등을 치료하는데 사용된다고 하였 다. 또한 《東醫寶鑑》¹⁴⁾에서는 硫黃膏, 蟬蛻散, 淸肌散, 加味羌活散 등의 처방에 포함되어 있어, CP가 피부 질환 에 다양하게 활용되었다는 것을 알 수 있다.

CP에 대해 선행된 연구에서, 박¹⁵⁾은 Picryl-chloride (PC)에 의해 접촉성피부염증반응을 보이는 생쥐의 耳介의 두께차를 측정해 CP가 消風, 淸熱, 止痒의 효능 으로 風熱로 인한 알레르기의 예방과 치료에 응용될 수 있음을 보고하였다. 김¹⁶⁾은 LPS로 유도된 대식세포 의 NO와 cytokine의 생성, MAPKs의 인산화와 NF-kB 의 활성화를 관찰하여 CP가 항염 효과를 가지고 있어 염증 질환 치료에 유효하다는 것과 CP가 대식세포에 서 세포 독성이 거의 나타나지 않는다는 것을 입증하 였다. 그리고 한⁴¹⁾은 곤충의 섬유소 용해 활성을 측정 하여 CP의 항혈전 효과를 보고하였고, 노⁴²⁾는 문헌 고 찰을 통해 고용량의 CP를 복용하거나 과민체질이 있 는 경우 중독 증상이 나타날 수 있으므로 복용량의 범 위를 지키는 것이 중요하다는 결론을 얻었다. 박⁴³⁾, 김

44), 진⁴⁵⁾, 안⁴⁶⁾, 송⁴⁷⁾, 김⁴⁸⁾은 실험을 통해 CP가 포함된 처방이나 기존 처방에 CP 등을 가미한 처방이 항염 효 과와 항알레르기 효과가 있다는 것을 보고하였다.

그러나 ACD가 유발된 동물실험모델에서 ACD로 인 한 생체의 다양한 변화와 CP 간의 유의성 검증과 CP를 직접 도포하거나 경구 투여하였을 경우의 차이에 대한 연구는 이루어지지 않았다. 이에 본 연구에서는 DNCB 로 ACD를 유발한 생쥐에 CP를 도포 및 경구 투여하여 귀와 비장 무게, 귀와 등 피부 두께, 피부 표면의 육안적

소견 및 피부 조직의 병리학적 소견을 관찰하고 생체 내와 시험관 내에서 비장세포 증식률을 측정하여 ACD 에 대한 CP의 효과를 입증하고자 하였다.

ACD 동물 모델에서는 ACD에서 볼 수 있는 국소 부위의 염증 반응에 의한 피부 조직의 부종, 각질형성 세포의 과형성, 면역세포의 침윤 등으로 조직이 비후 되어 귀 무게, 귀와 등 피부의 두께 등이 증가하는 경향 을 보인다. 따라서 약재가 무게와 두께 변화에 미치는 영향은 항염 작용의 평가 척도로 사용되고 있다³⁰⁾.

본 연구에서도 DNCB를 반복적으로 처리한 결과, 귀 무게, 귀와 등 피부의 두께가 normal군에 비하여 증 가하였고, 이러한 증가는 CP의 도포 및 경구 투여에 의하여 유의하게 (P<0.05, P<0.01) 억제되었다. 특히 귀 무게와 두께에서 CPAA군이 CPA군보다 더 나은 예 후를 보였다 (Table 1 - 3, Fig. 1 - 3). 이상의 결과를 보았을 때, 淸熱, 祛風의 작용을 하는 CP가 ACD에서 보이는 피부의 무게와 두께 증가를 억제하는 항염 효 과가 있고, CP의 도포와 경구 투여를 병행하였을 때 그 효과가 증대된다는 것을 짐작할 수 있다. 그리고 CP 를 복용하지 않은 귀의 무게와 두께에도 변화가 있다 는 것으로서 CP의 도포만으로도 항염 효과가 나타날 수 있다는 것을 유추할 수 있다.

CP가 ACD의 임상 양상에 미치는 영향을 확인하기 위해 ACD를 유발한 등 피부에는 홍반, 낙설, 혈흔과 중증도 이상의 착색이 존재하였다. 이러한 임상양상을 5 점 척도로 수치화하여 관찰한 결과, CP의 처치로 인 해 홍반, 낙설, 혈흔과 착색이 현저하게 감소되는 경향 을 보였고 수치상으로도 유의성 있게 (P<0.01) 감소하 였다 (Table 4, Fig. 4 - 5). 이와 같은 결과는 CP가 ACD에서 보이는 피부 증상을 효과적으로 억제하고 있다는 것을 시사한다.

육안상 관찰되는 증상의 변화를 조직에서도 관찰하 기 위해 희생된 생쥐의 등 피부 조직을 H & E로 염색 한 결과, epidermis가 얇게 분포하면서 다른 특이소견 이 거의 관찰되지 않는 normal군에 비해 ACD를 유발 시킨 군에서는 epidermis의 두께가 증가하였고 그 주 변에 과각화, 색소침착, 과립증가, 부전각화증이 현저 하게 증가하였다. CPA군은 control군에 비해 epi- dermis의 두께가 줄어들었고, 그 주변의 세포 변형과 각화 증상 등이 감소되었으며 특히 CPAA군에서는 과 각화, 색소침착, 과립증가, 부전각화증 등이 현저하게 감소된 것을 관찰할 수 있었다 (Fig. 6). 이를 통하여 CP가 피부 조직 내 염증 반응을 억제하는데 효과가 있

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어 항염 효과를 가지고 있다는 것을 짐작할 수 있으며 CP의 도포와 경구 투여를 병행하였을 때 더 큰 항염 효과를 기대할 수 있을 것이라 사료된다.

비장은 이차 림프기관으로 적혈구의 파괴와 재생, 항체의 합성, 항원을 걸러내는 역할 등 각종 면역반응 에 관여하며 이러한 기능이 항진되면 비장 종대를 일 으킬 수 있다⁴⁹⁾. 본 연구에서는 모든 실험을 마친 후 비장을 적출하여 무게를 측정한 결과, normal군에 비 해 다른 군에서 모두 유의하게 증가하였으나 CP를 처 치한 군과 처치하지 않은 군 사이의 유의한 차이는 관 찰 할 수 없었다 (Table 5, Fig. 7).

면역반응의 증가와 감소를 관찰하기 위한 지표로서 비장세포 증식률이 사용되는데, 이는 여러 가지 림프 구가 밀집되어 있는 비장의 크기와 세포의 수가 면역 반응과 밀접한 관련이 있기 때문이다⁵⁰⁾. 본 연구에서는 시험관 내에서 CP 추출물의 농도에 따라 변화하는 비 장세포의 증식률을 관찰한 결과, 모든 군이 CON(+)군 에 비해 유의하게 (P<0.01) 증식하였다 (Table 6, Fig.

8). 또한 모든 실험을 마친 후 적출한 비장에서 분리한 비장세포의 증식률을 확인한 결과, normal군에 비해 CPAA군에서 다소 감소하는 경향이 있었으나 통계적 으로 유의하지는 않았다 (Table 7, Fig. 9).

비장의 무게와 비장세포 증식률을 통한 실험 결과 를 종합해보면 CP가 비장세포의 증식을 촉진시켜 면 역반응을 활성화 시키는 것으로 유추할 수 있다. 그러 나 CP로 인해 활성화된 면역반응이 ACD로 인한 증상 의 완화 후에 적절하게 억제되는지의 여부는 3주의 단 기간에 확인하기에는 한계가 있으며 장기간의 관찰 등 추가적인 연구가 필요하다고 생각된다.

이상의 결과, CP는 ACD에 유의하게 치료 작용을 하는 것을 알 수 있다. 그러나 CP가 ACD의 치료에 효 과적이고 안전하게 활용되기 위해서는 향후 지속적인 연구와 고찰이 필요할 것으로 사료된다.

Ⅴ. Conclusion

DNCB로 유발된 알레르기성 접촉피부염에 蟬蛻가 미치는 영향을 관찰한 결과, 다음과 같은 결론을 얻었다.

1. CPA 및 CPAA 군에서 귀의 무게 증가가 유의하게 억제되었다.

2. CPA 및 CPAA 군에서 귀와 등 피부 두께 증가가

유의하게 억제되었다.

3. CPA 및 CPAA 군에서 DNCB로 유발된 피부의 홍반, 낙설, 혈흔, 착색이 현저하게 감소되었다.

4. CPA 및 CPAA 군에서 DNCB로 유발된 epi- dermis의 두께 증가, 과각화, 색소침착, 과립증가, 부전각화증이 현저하게 감소되었다.

5. CPA 및 CPAA 군에서 유의한 비장 무게의 변화는 관찰되지 않았다.

6. In vitro 에서 CP의 농도가 증가함에 따라 비장세 포 증식률이 유의하게 증가하였다.

7. In vivo 에서 CPA 및 CPAA 군이 CON(+) 군에 비해 유의한 비장세포 증식률의 변화를 보이지 않았다.

이상의 결과로부터 蟬蛻가 알레르기성 접촉피부염 의 증상 완화에 유효한 영향을 미친다는 것을 알 수 있었다.

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