약학회지 제30권제 1호 42〜 46 (1986) Yakhak Hoeji Vol. 30, No. 1
약물과 생체고분자 간의 상호작용(X)
Cefamandole, ceftriaxone, cefoxitin, latamoxef 및 cefotetan과 소 혈큉 알부민과의 결합에 관한 연구
김 종 국 • 신 철 교 • 양 지 선 서울대학교 약학대학
(Received January 7, 1986)
Drug-Biomacromolecule Interaction X
— Binding of Cefamandole, Ceftriaxone, Cefoxitin, Latamoxef and Cefotetan to Bovine Serum A lbum in—
Chong-Kook Kim, Chul-Kyo Shin and Ji-Sun Yang College o f Pharmacy, Seoul National University, Seoul 151，Korea
A b stract— The binding characteristics of five cephalosporins, cefamandole, ceftriaxone, cefoxitin, latamoxef, and cefotetan to bovine serum albumin (BSA) was examined by UV difference spectr
ophotometry. 2-(4'-hydroxybenzeneazo) benzoic acid was used as the spectrophotometric probe.
Competitive bindings between the probe and cephalosporins were observed. Based on the Scatchard plot, the BSA appeared to have two classes of binding sites in BSA binding with cephalosporins.
The number of primary binding sites appears to be one, secondary binding sites appears to be three. The binding constants were found as follows: BSA-HBAB; K iob8= 8 .3 9 x 104 M _1, K20bs
= 1 .60x 104 M _1, BSA-Cefamandole; K iob8=5. 44x 103 M _1, K 2obs= 0 .7 4 x 103 M _1, BSA-Cefotriax- one; K iob8= 6 .7 8 x l0 3 M _1, K 2ob8= 0 .8 8 x l0 3 M '1, BSA-Cefoxitin; K iob8= 7 .2 4 x l0 3 M "1, K2ob8=
1 .13x 103 M -1, BSA-Latamoxef; K iobs= 8 .8 7 x 103 M _1, K 20b8 = l. 92x 103 M _1, BSA-Cefotetan; K iobs
= 1 5 .4 l x l 0 3 M ' 1, K2ob8= 2.7X103 M _1.
广락탐계 항생물질은 세균의 세포막 합성을 저해하는 항균작용 기전을 가지고 있는물질로서 세균에 대한 작용은 강력하나 인체에 대해서는 부작용이 적은 선택적 독성 이론에 부합되는 항 생물질이다. 갖-락탐계 항생제 중에서 임상에 주 로 사용되고 있는 계열은 세팔로스포린계로서, 이는 1948년에 Brotzu가 Cephalosporium acremo- 의 배양액에 항균력이 있는 물질이 함유되 어 있다고 보고한 이후 세팔로스포린 C 의 구조 가 규명됨으로써 사용상의 문젯점이 많은 페니 실린에 대치하는 방향으로，또한 비교적 독성이 있는 아미노글리코사이드계열의 항생물질이 가 지고 있는 항균범위를 포괄할 수 있는 방향으로
개발이 진행되어 왔다. 1> 현재 임상에서 번용되고
있는 세팔로스포린계 항생물질들은 지속적으로 기존물질의 단점을 부분적으로 보완하면서 개발 한 물질들로서 항균력과 항균 스펙트럼, 생체 이용률등의 관점에서 제1〜4세대로 대별하여 불 리우고 있다. 각 세대의 항생물질을 화학구조 면에서 고찰하면 cephem의 3, 7위치의 측쇄 종류 에 따라 구분할 수 있다. 3위치의 측쇄변화는 약물의 생체내 안정성 및 위장관 흡수율등 약물 동력학적 특성과 균체 내로의 투과성등에 영향을 주며，7위치의 측쇄의 경우는 페니실린 결합 단 백과의 친화력 증가에 기인하는 항균력의 증가와
々-lactamase에 대한 안정성에 영향이 있다고 알
려져 있다. 21 인체에 투여된 약물은 혈액 중에서
유리상태인 약물만 항균활성을 나타내며 31, 단백
42
약울과 생체고■분자 간의 상호작용 43
Table I-Structures of injectable cephems.
Compound Structure
Cefamandole
Ceftriaxone
Cefoxitin
Latamoxef
Cefotetan
-CHCONI OH Ho ^ > 'coor
:OONa cH,
II.NOC NaOOC：
COONa CH, H，NOC s、 (,)CH5'
NaOOC S' J Cl 1,5
-N
CHa
과의 결합이 생물학적 활성도， 혈중농도， 체내 분포, 조직내의 이행，배선등생체에서의 약효발
현에 지대한 영향을 주는 인자로 알려져 있다. 4>
따라서 혈청단백과 항생제와의 결합양상을 규 명하는 것은 체내의 유효 혈중농도를 유지하는 것이 필수적인 항균요법에서 지대한 관심과제로 되어 있으며 많은 연구가 실시된 바 있다. 5
본 연구에서는 분광학적인 방법의 하나인 diff
erence spectrophotometry를 이용하여 소혈청 알 부민과 Table I에 표시한 화학구조를 가진 2，3 세대 세팔로스포린계 항생물질인 cefamandole, ceftriaxone, cefoxitin, latamoxef, cefotetan 간의 결합성질을 연구하여 지견을 얻었기에 보고하고 자 한다.
실 험 방 법
시약 및 기기一본 실험에 사용한 소 혈청알부 민 (BSA), 분획 V는 Sigma Co. 제품을 구입하였 다. BSA의 농도는 280 nm에서 UV흡광도를 측 정하여 몰농도를 £ &m=6. 67을 기준으로 결정 하였으며 BSA의 분자량은 69, 000으로 계산하였 다. 실험에 사용한 cefamandole(대웅릴리 (주 ))，
ceftriaxone (한국 로슈), cefoxitin(중외제약(주))，
cefotetan (제일약품 (주) ) ，latamocef (일동제약) 은
시판되고 있는 분말주사제를 구입하여 사용하였 다. U V probe인 2- (4/-hydroxybenzeneazo) ben
zoic acid (H B A B ) 는 IC N Pharmaceuticals Inc . 제 품을 구입하여 사용하였으며 probe의 용매로 사 용한 메탄올은 spectroscopic grade를 사 용 하 였 으 며 그 의의 시약은 시판하는 특급품을 정제하지 않고 사용하였다.
Difference spectra는 Cary 219 스 펙 트 로 포 토 미 터 (V arian Associate I n c . )를 사용하여 측정하였 으며 측정에 사용한 cell은 10 m m X 4. 5 m m ta ndem cell이었다.
실험방법ᅳp H 7 .4 , 0. 054M의 인산염 완충액 에 B S A를 용해시켜 1 . 4 5 x l ( r 4M 용액을 조제하 여 고농도 B S A용액으로 사용하고 2. 9 8 X 1 0 _5M
용액을 저농도 B S A용액으로 사용하였다. 고농
도 B S A용액은 이농도에서 첨가된 probe 전량이
B S A와 결합할 수 있는 농도라고 앞서 발표한
논문에서 결정하였다. 1W
Fig. 1과 같이 인산염 완충액과 B S A용액을 2 m요씩 양쪽에 넣은 2개의 tandem cell을 각각 re
ference beam과 sample beam에 평행하게 놓고
기저선을 그린 후에 대조용 cell에 든 완충액과
시료용 cell에 든 B S A용액에 메탄올로 용해시킨 l x l O _ 2M의 H B A B용 액 을 ;마이크로피펫으로 5사1
씩 차례로 가하면서 484nm에서 흡광도 차이를
측정하였다. 또한 약물을 l X i r 3M씩 함유하는
각각의 저농도 B S A용액에 대하여 위와 善일한
방법으로 H B A B용액을 가하면서 홉광도 4 이를
측정하였다.
데이타 처리一H B A B와 B S A와의 결 합 으 ^로‘ 나 타나는 흡광도 차이와 세팔로스포린계열 4 물의
Fig. 1-Tendem cell arrangement for the measurement of di任erence spectra. Buffer: 0. 054M phosphate buffer at pH of 7. 4.
44 낌총국• 신철교• 양지4
15 20 25 30 35 40
HBAB Cone V10*
Fig*. 3-Difference absorbance titration curve of BSA with HBAB at high(h) and low (a) albumin concentration. Curve b,c，d，e，and f are the titration curves of low albumin concentration with HBAB in the presence of 1 x 10-3 M of cefamandole, ceftriaxone, cefoxitin, latamoxef and cefotetan, respectively.
이와 같은 분광학적 변화는 신속하며 또한 가역 적이다. HBAB와 HBAB-BSA의 difference 스펙 트럼들은 484 nm와 262nm에서 2개의 양성 피이 크와 345 nm에서 1개의 음성 피이크를 나타내는
데 484 nm에서의 흡광도가 가장 안정하고 재현
성이 높았으므로 본 연구에서는 484nm에서 측 정한 자료를 처리하였다. 10)
Fig. 2는 HBAB-BSA 결합체의 difference spe- ctra와 각각의 약물을 첨가함으로써 홉광도가 감 소된 difference spectra 이다. 본 실험에 사용한
약물이 BSA에 결합할 경우에 자외흡수가 없으
므로 각 약물이 BSA에 결합하는 정도에 따라
HBAB-BSA 결합체의 자외흡광도가 감소된다.
Fig. 3은 BSA와 각 약물의 농도를 일정하게
하고，HBAB의 농도를 변화시키면서 홉광도 차
이를 측정한 것이다. 고농도 BSA용액에서는
BSA에 HBAB가 결합할 수 있는 부위가 과량으
로 존재하므로 HBAB의 농도를 증가시키면 첨
가한 HBAB가 전량 BSA에 결합되어 홉광도 차
이는 직선적으로 증가한다. 저농도 BSA용액에
서는 HBAB의 농도가 증가함에 따라 결합부위가
포화되므로 곡선이 휘어지게 된다. 세팔로스포 린계열 약물을 첨가하였을 경우, cefamandole, ceftriaxone, cefoxitin, latamoxef, cefotetan순으로 존재에 의한 흡수강도의 감소로 부터 H B A B 및
약물의 결합상수를 계산하였다. 먼저 Bmnd^ 등
의 방법에 따라 H B A B와 B S A와의 결합분율을
구한 다음 Scatchard방정식12)을 사용하여 H B A B 의 결합 상수(£«) 와 결합부위의 수 (»)를 구하였 다.
~AT~n^ a~ P尺0
이 식에서 P는 B S A 1분자당 결합한 H B A B의 분자수이며, ^ 는 유리 H B A B의 농도이다. HB-
A B를 가하면서 측정한 데이타를 가지고 Scatch
ard 플롯하여 x축 절편과 직선의 기울기에서 n과
^ 0를 구한 다음 이 값을 K lo tz방정식13>에 적용 시켜서 약물의 결 합상수(표*)를 계산하였다.
실험결과 및 고찰
유리상태로 존재하는 H B A B의 자외흡수 스펙
트렴과 B S A에 결합한 H B A B의 자외흡수 스펙
트럼은 상당히 다르다. 유리상태로 존재하는
H B A B는 가시부에서 흡수극대가 없으나 H B A B
가 B S A와 결합하면 가시부와 자외선 영역에서
3개의 혿수극대를 가진 스펙트럼을 나타내는데，
Fig. 2-Di£ference spectra of the HBAB-BSA com
plex in the presence and absence of cephal
osporin.
a: in the absence of cephalosporin,
b，c，d，e，f: in the presence of cefamandole, ce
ftriaxone, cefoxitin, latamoxef and cefotet
an, respectively.
DifferenceAbsorbans
J. Pharm. Soc. Korea
약물과 생체고분자 간의 상호작용 45
F ig. 4-Scatchard plots for the binding of HBAB to BSA.
Key: ■: in the absence of drug, *，이0，스，口: in the presence of 1 x 10"3 M of cefamandole, ceftriaxone, cefoxitin, latamoxef and cefotetan.
BSA와의 결합이 커지는 것을 알수 있다. HBAB
와 BSA의 결합에 의한 흡광도가 약물이 존재했
을 때 ， 감소하는 것으로 보아 BSA의 동일 결합
부위에 HBAB와 이들 약물이 상경적으로 작용
하여 HBAB를 치환시켜 결합한다는 것을 알 수
있으며, 흡광도의 감소 정도는 약물과 BSA와의
친화성의 강약으로 나타났다.
Fig. 4는 Fig. 3의 수치를 Scatchard 플롯하어
나타낸 것이다. Scatchard 플롯의 결과 직선이
아닌 2원상의 곡선으로 나타내서 2개의 직선으로 해석하였다• BSA에는 이들 약물이 결합하는데 있어서, 결합력이 다른 2종의 결합부위가 있음 을 알 수 있었다.
Fig. 4의 工축절편에서 결합부위의 수를 구하
고, 직선의 기울기에서 HBAB와 BSA의 결합상 수를 구하였다. 직선의 기울기는 상경적인 약물 을 첨가함에 따라 감소하고 있다. 결합상수가 큰 쪽의 결합부위를 1차 결합부위 (»!) 라 하고, 작은 쪽을 2차 결합부위 (하) 라고하였다. BSA에
있어서 HBAB가 결합하는 1차 결합부위의 수는
1개이며，결 합상 수(지 0bs) 는 8.39X104 M-1 이고, 2차 결합부위의 수는 3개이며 결합상수 CK：2°bs) 는 1. 60X104 M-1 이었다. 이 수치를 Klotz 방정식에
적용하여 구한 BSA와 측정약물의 결합상수는
Table II와 같았다.
Table II-Bindiiig parameters of cephalosporins to bovine serum albumin.
Compound ni K iohs x 10~3 n2 K 2ohs x 10-3
Cefamandole 1 5. 44 3 0. 74
Ceftriaxone 1 6.78 3 0. 88
Cefoxitin 1 7. 24 3 1.13
Latamoxef 1 8. 87 3 1.92
Cefotetan 1 15.41 3 2.7
n\. number of primary binding sites, » 2: number of secondary binding sites, J^iobB： observed binding constant at the primary binding sites, i^ 20bs- observed binding constant at the secondary binding sites.
B S A분자 내의 모든 아미노산이 약물에 대한
결합부위가 될 수 있으며 실제로 많은 아미노산 들이 여러 종류의 결합양상으로 단백결합을 일 으킬 수 있다ᅵ13' 〜 따라서 단백결합이 임상효과 에 많은 영향을 주는 항생제의 경우에는 혈청단 백에 대한 결합성향이 중요한 연구과제이다.
비교적 최근에 개발되어 임상에 사 용 되 고 있 는 2, 3세대의 세팔로스포린계 약물인 cefam and
ole, ceftriaxone, cefoxitin, latam oxef, cefotetan등
5종의 약물은 단백결합상수가 비교적 크며 , 혈액
내에 결합한 상태로 많이 존재하므로 약물의 효 능 및 생체이용률을 증가시키기 위하여 합리적인 약물투여방법 및 계획이 필요하다고 사 료 된 다.
본 연구는 1980〜 1981년도 한국 과학제단의
지원 연구비에 의한 연구결과의 일 부 분 이 다.
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