58
책임저자：양철우, 서울시 서초구 반포동 505 강남성모병원 내과, 139-701 Tel: 02-590-2527, Fax: 02-599-3589 E-mail: yangch@catholic.ac.kr
본 연구는 보건복지부 보건의료기술진흥사업(과제고유번호: A04- 0004)과 한국과학재단 기초의학연구센터사업지원(R13-2002-005- 01001-0)으로 수행되었음.
Induction of Acute Cyclosporine Nephrotoxicity in Pig
Jin Young Kim, M.D.1, Sun Woo Lim2, Kyung Ok Ahn2, Hyun Kuk Song2, Jung Yeon Ghee2, Byung Ha Chung, M.D.1, Yong Soo Kim, M.D.1, Byung Kee Bang, M.D.1 and Chul Woo Yang, M.D.1,2
1Department of Internal Medicine, The Catholic University of Korea College of Medicine, 2Xenotransplantation Center, Seoul, Korea
Purpose: Pigs are promising donor species for xeno- transplantation. This study was performed to examine acute cyclosporine (CsA) nephrotoxicity in a pig model. Methods:
Adult pigs were treated daily for 1 week with vehicle (VH), or 7.5 mg/kg (CsA7.5), 15 mg/kg (CsA15), and 30 mg/kg (CsA30) CsA. The renal function, electrolyte levels, whole- blood CsA levels, and histopathological results (va- cuolization and tubulointerstitial fibrosis) were compared among the different treatment groups. Results: After 1 week of treatment, it was found that CsA induced characteristic lesions that were remarkably similar to those of chronic CsA nephropathy in humans. Compared with the results obtained for the VH group, CsA reduced renal function and yielded poor histopathological results. With an increase in the CsA concentration, the renal function and histological parameters worsened in a dose-dependent manner. Conclusion: The study showed that CsA dose-dependently induced renal injury in a pig model. These results provide basic data to estimate or prevent the adverse renal effects of immuno- suppressants during porcine xenotransplantation in the future. (J Korean Soc Transplant 2007;21:58-62)
Key Words: Xenotransplantation, Cyclosporine nephropathy, Pig
중심 단어: 이종장기이식, 사이클로스포린 신독성, 돼지
돼지에서 급성 사이클로스포린 신독성 모델유도
1가톨릭대학교 의과대학 내과학교실, 2이종장기이식연구소
김진영1․임선우2․안경옥2․송현국2․기정연2․정병하1․김용수1․방병기1․양철우1,2
서 론
이종장기이식은 공여장기 부족현상을 극복할 수 있는 대 안으로서 이식에 있어 새로운 도전이다. 인간과 가장 계통 학적으로 가까운 영장류가 이종이식에 있어서 가장 이상적 인 동물로 생각되지만, 돼지는 인체와 면역학적 특성을 비 롯한 여러 조건이 유사하면서 영장류가 가지고 있는 윤리 적 또는 비용적 단점을 극복할 수 있어 이종장기이식의 최 적의 조건을 지닌 동물로 알려져 있다.(1)
돼지는 이미 신장, 췌장 도 세포, 심장 판막, 각막이식에 대한 동물실험이 광범위하게 진행되고 있는데,(1-3) 영장류 에 존재하지 않는 여러 항원을 가지고 있어 인체와 달리 세포 매개성 거부반응뿐 아니라 초급성, 아급성 거부반응 도 잘 발생하기 때문에 적절한 면역억제제가 중요하다.(3-5) 이종장기이식 시 투여되는 면역억제제는 동종장기이식시 투여되는 면역억제제에 의존할 것으로 판단된다.(5) 이중 사이클로스포린(CsA)은 동종장기이식 시 중추적인 면역억 제제로서 interleukin-2 (IL-2)를 선택적으로 억제함으로써 면역억제기능을 한다. 그러나 CsA는 신독성이 가장 중요한 합병증으로 알려져 있다.(6-8)
현재까지 CsA에 의한 신독성은 흰쥐나 토끼와 같은 설치 류 모델을 이용하여 연구되어 왔으나 돼지를 대상으로 한 연구는 드물었다.(9) 이에 저자들은 돼지를 대상으로 CsA에 의한 급성 신독성을 평가하고자 본 연구를 시행하였다.
방 법 1) 실험 모델과 약제
생후 21일된 WLD (요크셔 랜드레이스 듀록) 품종의 돼 지를 사용하였고 실험시작 당시 돼지의 체중은 4.3～5.5 kg 이었다. 본 실험은 가톨릭대학교 중앙의료원 의과학연구원 의 승인하에 이루어졌다. 실험기간동안 돼지는 사료와 물 을 자유롭게 섭취하도록 하였으며 일주일간의 안정기를 거 쳐 실험을 시작하였다. CsA (Novartis Research East Hanover, NJ, USA)은 7.5 mg/mL 농도로 올리브기름에 희석시켜 사용 하였다.
Table 1. Body weight and kidney weight in different groups
VH CsA7.5 CsA15 CsA30
BW (kg) 5.6±0.1 5.1±0.4 4.8±0.5 4.7±0.2*
Kidney weigh (g) 17±1.0 13.3±3.2 13.7±1.2* 14.0±1.0*
BUN (mg/dL) 11.7±1.6 10.8±1.8 14.4±3.5* 14.8±3.7*
sCr (mg/dL) 1.1±0.1 1.2±0.1 1.4±0.1† 1.5±0.2†
CsA level (ng/mL) 0±0 1,001±336 1,583±517† 2,154±150†
Values are means±SE. VH = vehicle; CsA7.5 = Cyclosporine 7.5 mg/dL; CsA15 = Cyclosporine 15 mg/dL; CsA30 = Cyclosporine 30 mg/dL; BW = body wt; BUN = blood urea nitrogen; sCr = serum creatinine. *P＜0.05 vs. VH, †P＜0.05 vs. VH or CsA7.5.
Table 2. Electrolytes in different groups
VH CsA7.5 CsA15 CsA30
Sodium (mEq/L) 135.7±0.6 135.7±0.6 137.3±1.5 137.0±2.0
Potassium (mEq/L) 4.1±0.5 5.7±0.6* 5.7±0.6* 6.0±0.8*
Magnesium (mg/dL) 2.0±0.3 2.0±0.2 2.1±0.3 1.8±0.2*
Values are means±SE. VH = vehicle; CsA7.5 = Cyclosporine 7.5 mg/dL; CsA15 = Cyclosporine 15 mg/dL; CsA30 = Cyclosporine 30 mg/dL. *P＜0.05 vs. VH.
2) 실험 디자인
실험돼지들을 4개 그룹으로 나누어 각기 6마리씩 구성하 였다. 대조군은 올리브기름을, CsA 치료군은 그룹에 따라 각각 7.5 mg/kg, 15 mg/kg, 30 mg/kg의 CsA를 피하주사하였 다. 실험기간 동안 돼지의 체중은 매일 측정하였고 일주일 간 주사한 후 각 실험군을 케타민 마취하에 복부를 절개하 여 대동맥에서 혈액을 채취한 다음 신장을 적출하여 신장 무게를 측정하였다.
3) 신기능측정 및 CsA혈중농도 측정
혈액의 혈액요소질소, 크레아티닌, 전해질(나트륨, 칼륨, 마그네슘)은 Cobas autoanlyszer (Roche Diagnostics, Div.
Hoffman-La Roche Inc. Nutely, NJ)로 측정하였다. CsA 혈중 농도는 CsA투여 직전에 채취한 혈액검체로 단일클론 방사 면역측정법(Incstar Co., Stillwater, MN)을 이용하여 측정하 였다.
4) 조직학적 소견
신조직은 periodate-lysine-paraformaldehyde (PLP) 용액으 로 관류 고정한 후 신장조직을 절취하여 중심부위를 4μm 두께로 자른 후 Masson's trichrome, Hematoxylin으로 염색하 였다.
CsA에 의한 신세뇨관의 공포화(vacuolization)는 color image analyzer (TDI Scope EyeTM Version 3.0 for Windows,
Olympus, Japan)를 이용하여 200배 배율에서 각각의 신피질 영역에서 공포화영역을 백분율을 계산하여 정량화하였다.
세뇨관 간질성 섬유화의 정도는 100배 현미경으로 color image analyzer를 이용하여 각각의 신피질 영역에서 손상된 부위의 분율을 계산하였다.
5) 통계분석
자료는 평균값±표준오차로 표시하였고 그룹간의 다중 비교분석은 one-way ANOVA와 post hoc Bonferroni test (SPSS software version 12.0)를 이용하였다. n값은 각 그룹의 실험동물수이며, P값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의하 다고 분석하였다.
결 과
1) CsA투여용량에 따른 체중 및 신장무게변화
실험 전 각 군 돼지의 나이와 평균 체중은 유의한 차이가 없었다(P=0.058). Table 1은 각 군의 기초검사를 요약한 것 이다. CsA투여군의 평균 체중과 신장무게는 대조군에 비해 감소하는 경향을 보였으나 통계학적으로 유의하지 않았고, CsA용량 증가에 따른 체중과 신장무게 차이는 관찰되지 않 았다.
2) CsA투여용량에 따른 신기능 및 CsA농도의 변화 CsA투여군의 혈중요소질소는 대조군에 비해 증가하였고
CsA15, CsA30군이 CsA7.5군에 비해 증가하였으나 CsA15 와 CsA30군에서 유의한 차이가 없었다. CsA투여군의 혈청 크레아티닌치가 대조군에 비해 높았으나 투여 용량에 따른 유의한 차이는 없었다. CsA15, CsA30군의 CsA혈중농도는 CsA7.5군에 비하여 각각 유의하게 증가하였다(Table 1).
3) CsA투여용량에 따른 전해질 변화
혈청 나트륨치와 마그네슘은 대조군과 CsA 투여군 사이 에 유의한 차이가 없었다. 반면 CsA 투여군의 혈청 칼륨치 는 대조군에 비해 유의하게 증가하였고, 투여 용량이 증가 할수록 더욱 상승하였다(Table 2).
4) CsA투여용량에 따른 조직학적 변화
CsA투여군의 신세뇨관에서 전형적인 공포화가 관찰되었 다(Fig. 1). 정량적 점수 시스템에 의한 공포화정도는 대조
군에 비해 CsA7.5군이 유의하게 높았고(0±0 vs. 5.1±2.3/
0.5 mm2) CsA투여용량에 비례하여 더욱 증가하였다 (CsA15; 10.7±3.6/0.5 mm, CsA30; 20.3±4.9/0.5 mm).
Fig. 2는 각 군에서 간질성 섬유화 정도를 비교하는 그림 이다. 간질성 섬유화 정도는 CsA7.5군에서 대조군에 비해 유의하게 증가하였고(2.1±0.7 vs. 0±0/0.5 mm2) CsA투여용 량에 비례하여 증가하였다(CsA15; 5.3±2.4/0.5 mm2, CsA30;
17.5±5.4/0.5 mm2).
고 찰
본 연구에서는 이종장기이식시 공여동물로 각광받는 돼 지에서 CsA에 의한 신독성을 평가하고자 하였다. CsA용량 은 7.5 mg/kg부터 두배씩 증량하여 30 mg/kg까지 다양한 용 량을 주사하였다. CsA투여용량결정은 CsA 신독성 쥐모델
Fig. 1. Histopathologic findings (A: VH, B: CsA 7.5 mg/kg, C: CsA 15 mg/kg, D: CsA 30 mg/kg) and quantitative analysis of vacuolization by color image analyzer (E). Vacuolization was significantly increased in pig kidneys with CsA treatment.
Vacuolization score was increased in dose-dependent manner.
Trichrome stain; original magnification: 200. *P＜0.05 vs.
VH, †P＜0.05 vs. CsA7.5, ‡P＜0.05 vs. CsA15.
에 관한 이전 연구들을 토대로 정하였다.(6-8) 급성 CsA신 독성을 유도하기 위하여 일주일간 투여하였으며 신장기능 과 조직학적 변화를 관찰하여 CsA신독성을 평가하였다. 연 구결과 돼지 신장은 CsA용량에 비례하여 신기능의 저하와 신조직의 손상이 유발되는 것을 확인하였다. 이러한 소견 은 CsA에 의한 신독성이 돼지에서 비교적 조기에 발생하며 CsA 투여용량에 따라 CsA에 의한 신독성이 증가한다는 것 을 시사한다.
CsA에 의한 신장기능의 저하는 사구체의 혈역동학적 변 화에 기인하며 투여용량에 비례하는 것으로 알려져 있 다.(7,10-12) 본 연구결과 CsA에 의한 혈청 크레아틴치와 BUN은 CsA7.5군에서는 대조군에 비하여 유의한 차이가 없 었고 CsA15군에서 대조군에 비하여 증가하였다. CsA7.5군 에서 전해질과 조직학적 변화가 관찰된 것으로 보아 7.5 mg/kg의 CsA를 투여했을때 신세뇨관 손상이 먼저 일어나
고 15 mg/kg 이상을 투여하여야 사구체의 혈역동학적 변화 를 유도할 수 있는 것으로 생각된다.
CsA신독성에 의한 전해질 장애 중 가장 특징적인 소견은 고칼륨혈증과 저마그네슘이다.(13-16) 고칼륨혈증은 CsA가 신세뇨관에서 칼륨의 배설을 감소시켜서 발생하고(13,14) 이에 반해 저마그네슘증은 신세뇨관에서 마그네슘의 배설 이 증가함으로써 발생한다고 알려져 있다.(15,16) 본 연구결 과 혈청 칼륨치는 CsA7.5군에서 대조군에 비하여 증가하였 으며 투여용량에 따른 혈청칼륨치의 유의한 증가는 없었 다. 이에 반해 혈청 마그네슘치는 CsA30군에서 다른 군에 비하여 감소함을 확인하였다. 이러한 소견은 인체에서 볼 수 있는 CsA에 의한 고칼륨혈증과 저마그네슘이 돼지에서 도 볼 수 있으며 이러한 변화는 고용량의 CsA 투여 시 발생 한다는 점을 고려하면 CsA신독성을 반영해 주는 주요한 소 견으로 이해된다.
Fig. 2. Representative photomicrographs showing the degree of renal tubulointerstitial fibrosis (A: VH, B: CsA 7.5 mg/kg, C: CsA 15 mg/kg, D: CsA 30 mg/kg). CsA treatment induced a typical interstitial fibrosis, inflammatory cell infiltration, and tubular atrophy. TIF score was increased in dose-dependent manner (E). Trichrome stain; original magnification: 100. *P
＜0.05 vs. VH, †P＜0.05 vs. CsA7.5, ‡P＜0.05 vs. CsA15.
CsA에 의한 신독성의 조직학적 변화 중 특징적인 소견은 신세뇨관에서의 공포화와 섬유화 소견이었다. 신세뇨관의 공포화는 CsA를 7.5 mg/kg 투여 시부터 확인되었으며 용량 을 증가할수록 심해지는 경향을 보였다. 조직의 섬유화도 CsA를 7.5 mg/kg 투여 시부터 신피질에서 확인되었으며 용 량을 증가할수록 섬유화되는 부위가 증가하였다. CsA에 의 한 신손상 시 섬유화가 초기부터 증가한 점은 CsA에 의한 신독성이 만성적인 경과를 보일 수 있다는 것을 시사해주 는 주요한 소견이라 하겠다.
CsA의 전혈 혈중농도는 CsA를 7.5 mg/kg 투여 시 약 1,000 ng/mL로 인체를 기준으로 할 때 약 3～4배 정도 높은 농도를 유지하였다. 이러한 혈중농도는 인체에서의 CsA농 도에 비하여 현저히 높은 농도이다. 이러한 농도차이는 실 험종에 따른 차이에 의하며(sepcies specific) 실제로 설치류 의 경우 CsA농도를 1,000 ng/mL 이상 증가시켜도 조직학적 변화가 나타나지 않는다는 점을 고려하면(6,7) 돼지와 같은 대동물은 쥐와 같은 소동물에 비하여 CsA에 의한 신독성이 잘 일어날 수 있다는 것을 의미한다.
결 론
본 실험을 통하여 대동물인 돼지에서 CsA를 투여하여 용 량에 따른 급성 CsA신독성을 관찰할 수 있었으며 이러한 소견은 향후 돼지를 이용한 이종장기이식 시 신장에 발생 할 수 있는 면역억제제의 독성을 진단하거나 예방하는 데 주요한 자료가 될 수 있을 것으로 판단된다.
REFERENCES
1) Shimizu A, Yamada K. Pathology of renal xenograft rejection in pig to non-human primate transplantation. Clin Transplant 2006;20(Suppl 15):46-52.
2) Wang DZ, Skinner S, Elliot R, Escobar L, Salto-Tellez M, Garkavenko O, Khoo A, Lee KO, Calne R, Isaac JR. Xeno- transplantation of neonatal porcine islets and Sertoli cells into nonimmunosuppressed streptozotocin-induced diabetic rats.
Transplant Proc 2005;37:470-1.
3) Kasimir MT, Rieder E, Seebacher G, Wolner E, Weigel G, Simon P. Presence and elimination of the xenoantigen gal (alpha1, 3) gal in tissue-engineered heart valves. Tissue Eng 2005;11:1274-80.
4) Dalmasso AP, Vercellotti GM, Fischel RJ, Bolman RM, Bach FH, Platt JL. Mechanism of complement activation in the hyperacute rejection of porcine organs transplanted into
primate recipients. Am J Pathol 1992;140:1157.
5) Ibrahim Z, Busch J, Awwad M, Wagner R, Wells K, Cooper DK. Selected physiologic compatibilities and incompatibilities between human and porcine organ systems. Xenotrans- plantation 2006;13:488-99.
6) Yang CW, Ahn HJ, Kim WY, Shin MJ, Kim SK, Park JH, Kim YO, Kim YS, Kim J, Bang BK. Influence of the renin- angiotensin system on epidermal growth factor expression in normal and cyclosporine-treated rat kidney. Kidney Int 2001;
60:847-57.
7) Li C, Lim SW, Sun BK, Yang CW. Chronic cyclosporine nephrotoxicity: new insights and preventive strategies. Yonsei Med J 2004;45:1004-16.
8) Young BA, Burdmann EA, Johnson RJ, Alpers CE, Giachelli CM, Eng E, Andoh T, Bennett WM, Couser WG. Cellular proliferation and macrophage influx precede interstitial fibrosis in cyclosporine nephrotoxicity. Kidney Int 1995;48:439-48.
9) Cibulskyte D, Samsoe Engberg A, Hanefelt Kristensen D, Ringer Ellingsen A, Pedersen M, Hoerlyck A, Flyvbjerg A, Marcussen N, Hansen HE, Madsen M, Mortensen J. Renal effects of long-term ciclosporin A treatment in a large animal model. Nephron Exp Nephrol 2007;105:e91-7.
10) Ramírez C, Olmo A, O'Valle F, Masseroli M, Aguilar M, Gómez-Morales M, Revelles F, García-Chicano MJ, Arrebola F, Reguero ME, del Moral RG. Role of intrarenal endothelin 1, endothelin 3, and angiotensin II expression in chronic cyclosporin A nephrotoxicity in rats. Exp Nephrol 2000;8:
161-72.
11) Olyaei AJ, de Mattos AM, Bennett WM. Nephrotoxicity of immunosuppressive drugs: new insight and preventive strate- gies. Curr Opin Crit Care 2001;7:384-9.
12) de Mattos AM, Olyaei AJ, Bennett WM. Nephrotoxicity of immunosuppressive drugs: long-term consequences and challe- nges for the future. Am J Kidney Dis 2000;35:333-46.
13) Ling BN, Eaton DC. Cyclosporin A inhibits apical secretory K+ channels in rabbit cortical collecting tubule principal cells.
Kidney Int 1993;44:974-84.
14) Heering P, Degenhardt S, Grabensee B. Tubular dysfunction following kidney transplantation. Nephron 1996;74:501-11.
15) Rob PM, Lebeau A, Nobiling R, Schmid H, Bley N, Dick K, Weigelt I, Rohwer J, Gobel Y, Sack K, Classen HG. Magne- sium metabolism: basic aspects and implications of ciclos- porine toxicity in rats. Nephron 1996;72:59-66.
16) Miura K, Nakatani T, Asai T, Yamanaka S, Tamada S, Tashiro K, Kim S, Okamura M, Iwao H. Role of hypomagnesemia in chronic cyclosporine nephropathy. Transplantation 2002;73:
340-7.
