Protective Effects of Chrysanthemi Indici Flos Extract and Flaxseed Oil Mixture on HCl/ethanol-induced Acute Gastric Lesion Mice

급성 위염 동물 모델에서 甘菊 추출물과 亞麻仁油 혼합물의 위 점막 보호 효과

이진아^1#, 김수현¹, 김민주¹, 안정현², 박해진³, 이우락², 노성수^1*

1 : 대구한의대학교 한의과대학 본초약리학교실, 2 : ㈜ 농부플러스, 3 : 대구한의대학교 한방식품영양조리학부

Protective Effects of Chrysanthemi Indici Flos Extract and Flaxseed Oil Mixture on HCl/ethanol-induced Acute Gastric Lesion Mice

Jin A Lee

, Soo Hyun Kim

, Min Ju Kim

, Jeong-Hyun Ahn

, Hae-Jin Park

Woo Rak Lee

, Seong-Soo Roh

1 : Department of Herbology, College of Korean Medicine, Daegu Haany University, Republic of Korea 2 : 21-7, Bongam 2-gil, Dongmyeong-myeon, Chilgok-gun, Gyeongsangbuk-do, 39862, Republic of Korea

3 : Department of Food Science and Nutrition, Daegu Hanny University, Republic of Korea

ABSTRACT

Objectives : The objective of this study was to investigate the protective effect of Flaxseed oil and Chrysanthemi Indici Flos 50% ethanol extract in an HCl/ethanol induced acute gastritis model.

Methods : ICR mice were divided into 6 groups; normal mice (Nor), gastritic mice with distilled water (Veh), gastritic mice with 10 ㎎/㎏ sucralfate (SC), gastritic mice with 16 g/㎏ Flaxseed oil (FO), gastritic mice with FO + 50 ㎎/㎏

Chrysanthemi Indici Flos (FCL), and gastritic mice with FO + 100 ㎎/㎏ Chrysanthemi Indici Flos (FCH). Then, mice were orally administered with 150 mM HCl/60% ethanol and caused acute gastritis. After 1 hr, mice were sacrificed, and blood and stomach tissue were collected.

Results : Administration of FCL and FCH to mice prior to the induction of gastritis was found to reduce gastric injury.

reactive oxygen species (ROS) and peroxy nitrite (ONOO

) levels of stomach tissues were significantly decreased in FO, FCL, and FCH compared to Veh group. As results of stomach protein analyses, FCL and FCH effectively reduce inflammatory-related factors such as inducible nitric oxide synthase (iNOS), interleukin-6 (IL-6), and interleukin 1 beta (IL-1) in gastric lesion mice. In addition, nuclear factor kappa B p65 (NF-B p65) and phosphorylation inhibitor of nuclear factor kappa Bα (p-IBα ) were down-regulated in FCL and FCH administrated gastric lesion mice.

Conclusions : These results suggest that FCL and FCH has an inhibitory effect against gastric injury. Therefore, FCL and FCH has the potential to be used as a natural therapeutic drug.

1)

Key words : Gastric lesions, Flaxseed oil, Chrysanthemi Indici Flos, anti-oxidative stress, anti-inflammation

Ⅰ. 서 론

위장 질환은 소화기 질환 중 하나로, 세계 인구의 4~5%가 일생 동안 한 번 이상 경험하게 되는 흔한 질환이다

. 위벽은 4

개의 층으로 이루어져 있으며, 첫 번째 층인 위 점막이 손상된 경우를 위염이라 하고, 두 번째 층 이상이 손상된 경우를 위궤 양이라 한다

. 위염은 위 점막을 손상시키는 공격인자와 보호 하는 방어인자 사이의 균형이 깨져 염증이 발생되는 것을 의미

*Corresponding author : Seong-Soo Roh, College of Korean Medicine, Daegu Haany University, 136, Sincheondong-ro, Suseong-gu, Daegu, 42158, Republic of Korea.

·Tel : +82-53-770-2351 ·Fax : +82-53-768-6340 ·E-mail : [email protected]

#First author : Jin A Lee, College of Korean Medicine, Daegu Haany University, 136, Sincheondong-ro, Suseong-gu, Daegu, 42158, Republic of Korea.

·Tel : +82-53-770-2258 ·Fax : +82-53-768-6340 ·E-mail : [email protected] ·Received : 13 September 2018 ·Revised : 01 November 2018 ·Accepted : 25 November 2018

하는데

, 위염이 더 심해지면 위궤양이나 만성적인 위염으로 진행하며 만성위염은 위암으로 이어진다

. 주요 발병 원인으로 는 소염제 등의 약물 과다복용, Helicobacterpylori균 감염, 불 규칙한 식습관, NSAID (non-steroid anti-inflammatory drugs), 스트레스, 알코올 등이 있다

.

현재 알려진 위염 치료제는 위산분비를 억제시키는 PPI (proton pump inhibitor)와 H2 receptor antagonist 등이 있 으며 그 효과는 충분히 입증되었지만, 부작용 또한 나타나고 있 다

. 천연물은 현재 비교적 많이 사용되고 있는 안전성이 높 은 약물로 알려져 있으며, 위염 및 위궤양의 원인을 차단하여 좋은 치료제 또는 첨가제로 쓰일 것이라 기대하고 있다

.

甘菊 (

)은 국화과 (Compositae) 국화속 (

)의 다년생 초본으로 10), 우리나라 중부 이남의 산지에 분포하는 야생국화이다

. 주요성분으로는 luteolin, apigenin, apigenin 7-O--D- glucoside 및 luteolin 7-O--D-glucoside 등의 플라보노 이드 화합물과 cumambrin A, cumambrin B, arteglasin A 및 angeloyljadin 등이 알려져 있으며

, 甘菊은 濕疹 등의 피 부질환, 동맥경화, 高血壓 등에 효과적일 뿐 아니라 위염과 안 질환에도 좋은 효능을 나타내는 것으로 알려져 있다

.

亞麻仁 (

L., Flaxseed)는 아마과 (Linaceae) 식물의 종자로써 중앙아시아의 고산지대에 분포한 다. 국내 동의보감에 따르면 뼈 및 피부질환, 염증, 대변 장애, 부인병 등에 탁월하다고 전해지며

, 식물성 에스트로겐인 리 그난을 함유하고 있어 항산화 및 항암효과가 있으며 종양을 강 력하게 억제하는 등의 효과가 보고되고 있다. 뿐만 아니라, 대 사증후군, 당뇨, 면역계 관련 질병을 치료 및 예방에 도움을 주 며, 오메가-3 지방산, 미네랄 및 토코페롤 등의 다양한 성분을 함유하고 있다고 알려져 슈퍼 푸드로 관심을 받고 있다

.

甘菊과 亞麻仁의 항산화 및 항염증 효능은 많이 알려져 있지 만, 위염 및 위 점막 손상에 대한 억제 연구는 이루어지지 않고 있다. 이에 본 연구에서는 천연 소재인 甘菊 추출물과 亞麻仁油 를 이용하여 급성 위염 동물 모델에서의 위 점막 손상 억제 효 능을 평가하였으며, 유의성 있는 결과를 얻었기에 이를 보고하 는 바이다.

Ⅱ. 재료 및 방법

1. 재료

본 실험에서 사용한 甘菊은 담아온약초 (경북, 한국)에서 구 입한 것을 생약규격집에 맞추어 관능검사 후, 약전규격에 적합 한 것만을 정선하여 사용하였다. 甘菊 200 g을 분쇄한 후, 10 배 용량의 50% ethanol을 이용하여 24시간 냉침하여 추출하였 다. 얻어진 추출물은 감압 추출장치로 농축 후, 동결 건조기를 이용해 완전 건조시켜 파우더를 얻었으며 (CIL : 35.2%) –8 0℃에서 보관하였다. 亞麻仁油는 다온푸드 (경기, 한국)에서 구 입한 것을 사용하였으며, 상온 보관 하였다.

2) 시약

본 실험에 사용된 2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), 7 mM 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS), gallic acid, Folin-Ciocalteu’s phenol reagent, sodium carbonate, naringin, diethylene glycol, sodium hydroxide, potassium phosphate monobasic, potassium phosphate dibasic, Sucrose octasulfate aluminum complex (Sucralfate)는 Sigma aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였으며 Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. Nitrocellulose membranes는 Amersham GE Healthcare (Little. Chalfont, UK)에서 구입하였고, phosphorylation of nuclear factor-kappa B p65 (NF-B p65), inhibitor of nuclear factor kappa B alpha (IB), phosphorylation inhibitor of nuclear factor kappa B alpha (p-IB), inducible nitric oxide synthase (iNOS), interleukin-6 (IL-6), interleukin-1 beta (IL-1), nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2), heme oxygenase-1 (HO-1), super oxide dismutase (SOD), catalase, histone, -actin과 2차 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA) 로부터 구입하였으며, Protease inhibitor mixture, DMSO, ethylenediamine- tetraacetic acid (EDTA)는 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (Osaka. Japan)에서 구입하였다. 또한 2', 7' Dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA)와 Dihydrorhodamine 123는 Molecular Probes (Eugene, OR, U.S.A.)에서 ECL Western Blotting Detection Reagents는 GE Healthcare로부터 구입하여 사용하였으며, 단백질 정량을 위한 BCA protein assay kit는 Thermo Scientific (Rockford, IL, USA)에서 구입하였다.

3) 실험동물

ICR 마우스 6주령 수컷 48마리를 오리엔트 (경기, 한국)에서 구입하여 1주일 동안 실험실 환경에 적응시킨 후 실험에 사용 하였다. 동물 사육실의 조건은 conventional system으로 온도 22 ± 2℃, 습도 50 ± 5%, 명암주기 (light : dark cycle)는 12시간 주기로 조절하였다. 사료는 고형사료 (조단백질 22.1% 이상, 조지방 8.0% 이하, 조섬유 5.0% 이하, 조회분 8.0% 이하, 칼슘 0.6% 이상, 인 0.4% 이상, 삼양사, 항생제 무첨가)와 물을 충분히 공급하였다. 동물실험의 윤리적, 과학적 타당성 검토 및 효율적인 관리를 위하여 대구한의대학교 동물 실험윤리 위원회 (Institutional Animal Care and Use Committee:

IACUC)의 승인 (승인번호:DHU 2018-057)을 받았다.

2. 방법

1) 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량 측정

총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis법

에 의해 측정하였다.

시료 10 ㎕에 증류수 790 ㎕, Folin-Ciocalteu’s phenol reagent 50 ㎕를 혼합하여 실온에서 1분간 반응시킨 후 150

㎕의 20% sodium carbonate를 첨가하였다. 실온에서 2시간

동안 반응시킨 후 UV 분광광도계 (Infinite M200, Tecan, Salzburg, Austria)를 이용하여 765 ㎚에서 흡광도를 측정한 다음, 표준물질 gallic acid를 사용하여 표준 검량선을 구하고 시료 추출물의 총 폴리페놀 함량을 산출하였다.

총 플라보노이드 함량은 Lister 등

의 방법에 의해 구하였 다. diethylene glycol 1 ㎖와 시료 추출물 100 ㎕와 1 N NaOH 10 ㎕를 잘 혼합시켜 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 420 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로는 naringin을 사용하였으며, 표준 검량선을 구하여 추출물의 총 플라보노이 드 함량을 산출하였다.

2) DPPH 라디칼 소거 활성 측정

추출한 시료의 free radical 소거능 측정을 위해 2-Diphenyl -1-picrylhydrazyl (DPPH) free radical 소거법을 이용하였 다. 0.2 mM DPPH용액 100 ㎕와 시료를 농도별로 희석한 용 액 100 ㎕를 혼합하여 37℃에서 30분간 암소상태로 방치한 후 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였으며, 양성대조군으로 L-ascorbic acid를 사용하였다. 흡광도는 아래의 식 (a)에 따라 계산하여 산출하였다.

식 (a)

DPPH Radical scavenging activity (%)

= {(OD

– OD

)/OD

}×100

OD

: 시료가 들어가지 않은 경우(대조군) 흡광도,

OD

: 시료가 들어간 경우 흡광도.

3) ABTS 라디칼 소거 활성 측정

추출한 시료의 항산화 효능을 알아보기 위해 2,2'-azino- bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS) free radical 소거능을 측정하였다. 7 mM ABTS 용액과 2.4 mM의 potassium persulfate를 혼합하여 실온의 암소 상태에 서 약 16시간 이상 방치하여 ABTS+을 형성시킨 후 415 ㎚에 서 흡광도 값이 0.70 ± 0.02이 되게 ethanol로 희석하였다.

희석된 용액 95 ㎕에 시료 5 ㎕를 가하여 15분 동안 방치한 후 415 ㎚에서 흡광도를 측정하였으며, 양성대조군으로 L-ascorbic acid를 사용하였다. 흡광도는 아래의 식 (b)에 따라 계산하여 산출하였다.

식 (b)

ABTS Radical scavenging activity (%)

= {(OD

– OD

)/OD

}×100

OD

: 시료가 들어가지 않은 경우(대조군) 흡광도,

OD

: 시료가 들어간 경우 흡광도.

4) 위 점막 손상 유발 및 동물 처치

실험동물은 군당 8마리씩 6그룹으로 구분하여 실험을 실시 하였다. 실험 전 날까지 고형사료와 물을 충분히 공급하였고, 실험 24시간 전부터 절식하였으며 물은 제공하였다. 실험 전, 정상군 (Nor)은 아무런 처치를 하지 않았으며, 대조군 (Veh)은 증 류수 경구 투여 후 위염을 유발하였고, 양성대조군인 sucralfate

투여군 (SC) (Sigma Aldrich)은 10 ㎎/㎏ body weight의 농 도로 경구 투여하였다. 亞麻仁油 단독 투여군 (FO, 16 g/㎏

body weight)과 亞麻仁油 (16 g/㎏ body weight) + 甘菊 50% EtOH (50 ㎎/㎏ body weight) 혼합 투여군 (FCL) 및 亞 麻仁油 (16 g/㎏ body weight) + 甘菊 50% EtOH (100 ㎎/

㎏ body weight) 혼합 투여군 (FCH)은 각 농도에 맞게 경구 투여 하고 1시간 후 150 mM HCl/60% ethanol을 각 0.55 ㎖ 씩 경구 투여하였으며, 1시간 후 isoflurane (Sigma Aldrich)으 로 흡입 마취하여 위 조직을 적출하였다.

5) 조직학적 관찰

적출한 위 조직을 고정한 다음, 광학 디지털 카메라 (DSCHX50V, Sony, Tokyo, Japan)를 이용하여 촬영하였다.

손상된 위 점막 측정은 I-Solution lite (Innerview Co., Gyeonggido, Korea) 프로그램을 이용하여 실제 손상 부위의 면적을 측정한 후, 위 전 체 면적과 비교하여 비율로 표시하 였다.

6) 산화적 스트레스 바이오마커 측정

산화적 스트레스 바이오 마커인 ROS 값은 위 조직을 1 mM EDTA-50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.4)를 이용 하여 분쇄한 후 25 mM DCFH-DA를 혼합하여 형광 광도계를 이용해 0분부터 매 5분씩 emission 파장 530 ㎚와 excitation 파장 485 ㎚를 이용하여 30분간 측정한 값을 계산하였다.

ONOO

는 DHR123 buffer (rodamin buffer, 5 mM DTPA, 10mM DHR123)와 분쇄한 위 조직을 혼합한 후, 37℃

에서 5분간 교반하였다. 그 다음 형광 광도계를 이용해 0분부 터 매 5분씩 emission 파장 535 ㎚와 excitation 파장 480 ㎚ 에서 30분간 측정한 값을 계산하였다. ROS 및 ONOO

의 실험 방법은 각각 Ali et al 과 Kooy et al의 방법을 이용하여 시행 하였다

.

7) 위 조직 western blotting

위의 세포질을 얻기 위해 100 mM Tris-HCl (pH 7.4), 5 mM Tris-HCl (pH 7.5), 2 mM MgCl2, 15 mM CaCl2, 1.5 M sucrose, 0.1 M DTT, protease inhibitor cocktail을 첨가 한 buffer A를 넣고 조직 분쇄기 (tissue grinder) (Biospec Product, Bartlesville, OK, USA)로 분쇄한 후 10% NP-40 용액을 첨가하였다. 아이스 위에서 20분간 정치시킨 후 12,000 rpm으로 2분간 원심분리 하여 세포질을 포함하고 있 는 상층액을 분리하였다. 핵을 얻기 위해 10% NP-40가 더해 진 buffer A에 두 번 헹구고 100 ㎍의 buffer C (50 mM HEPES, 50 mM KCl, 0.3 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.1 mM PMSF, 10% glycerol)를 첨가해 재부유시 킨 후 10분마다 vortex를 3번 하였다. 4℃에서 12,000 rpm으 로 10분간 원심 분리 한 후 핵을 포함하고 있는 상층액을 얻어

−80℃에서 각각 냉동 보관하였다. 위 조직 세포질의 IB,

p-IB, iNOS, IL-6, IL-1, HO-1, SOD, catalase, 

-actin 단백질과 핵에서의 NF-kBp65, Nrf2, histone 단백질

발현을 측정하기 위하여 10㎍의 단백질을 8-15% SDS

Herb Latin name Total polyphenol (㎎/g) Total flavonoid (㎎/g)

甘菊 Chrysanthemi Indici Flos 40.73 ± 0.53 66.99 ± 0.30

All values are mean ± SD of three replications

Table 1. Total Polyphenol and Total Flavonoid Contents of Chrysanthemi Indici Flos

0 20 40 60 80 100

5 10 25 50 100 250 500 1000

DPPH (% of inhibition)

Concentration (µg/mL)

0 20 40 60 80 100

2.5 5 10 25 50 100 250 500

ABTS (% of inhibition)

Concentration (µg/mL) 0

20 40 60 80 100

1 2.5 5 10 25 50 100 250 500 1000

DPPH (% of inhibition)

Concentration (µg/mL)

(A) (B)

(C) (D)

0 20 40 60 80 100

2.5 5 10 25 50 100 250 500 1000

ABTS (% of inhibition)

Concentration (µg/mL)

Fig. 1. Scavenging activity of CIL on DPPH and ABTS free radical.

Scavenging acitivity of L-ascorbic acid against DPPH free radical; (A), Scavenging acitivity of CIL against DPPH free radical; (B), Scavenging acitivity of L-ascorbic acid against ABTS free radical; (C), Scavenging acitivity of CIL against ABTS free radical; (D).

polyacrylamide gel을 이용하여 전기연동 후, acrylamide gel을 nitrocellulose membrane으로 이동시켰다. 준비된 membrane에 각각의 1차 antibody를 처리하여 4℃에서 overnight 시킨 다음 PBS-T로 6분마다 5회 세척하고, 각각 처리된 1차 항체에 사용되는 2차 항체 (PBS-T로 1:3000로 희 석해서 사용)를 사용하여 상온에서 1시간 반응시킨 후, PBS-T 로 6분마다 5회 세척하였다. 그리고 membrane을 enhanced chemiluminescence (ECL) 용액에 노출시킨 후, Sensi- Q2000 Chemidoc (Lugen Sci Co., Ltd., Seoul, Korea) 에 감광시켜 단백질 발현을 확인한 후, 해당 band를 ATTO Densitograph Software (ATTO Corporation, Tokyo, Japan) 프로그램을 사용하여 정량하였다.

8) 통계분석

In vitro

의 수치는 평균과 표준편차로,

의 수치는 평 균과 표준오차로 표시하였으며, SPSS (Version 22.0, IBM, Armonk, NY, USA)를 사용하여 one-way analysis of variance (ANOVA) test를 실시한 후 least-significant differences (LSD) test로 사후검증을 실시하여 각 군의 평균 차이에 대한 통계적 유의성을

P<0.05,

P<0.01,

P<0.001

에서 검증하였다.

Ⅲ. 결 과

1. 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량 측정 결과

CIL의 총 폴리페놀 및 플라보노이드를 측정한 결과, 총 폴리 페놀 함량은 40.73 ± 0.53 ㎎/g으로 나타났으며, 총 플라보노 이드 함량은 66.99 ± 0.30 ㎎/g으로 높은 총 폴리페놀 및 플 라보노이드 함량을 나타냈다 (Table 1).

2. DPPH 및 ABTS 라디칼 소거 활성 측정

CIL의 항산화 활성을 측정하기 위하여 DPPH, ABTS 자유 라디칼 소거 활성을 측정하였다. DPPH 자유 라디칼 소거 활성 을 측정한 결과, 표준물질인 L-ascorbic acid의 IC

값은 1.21

± 0.03 ㎍/㎖으로 나타났고, 甘菊 추출물의 IC

값은 18.51

± 0.20 ㎍/㎖으로 나타났다. ABTS 자유 라디칼 소거 활성을

측정한 결과, 표준물질인 L-ascorbic acid의 IC

값은 3.52 ±

0.02 ㎍/㎖으로 나타났고, 甘菊 추출물의 IC

값은 22.95 ±

0.18 ㎍/㎖으로 나타났다 (Fig. 1).

(A) (B) (C)

(D) (E) (F)

0 5 10 15 20 25 30

Nor Veh SC FO FCL FCH

Gastric lesion area (AU)

***

***

***

*** ***

Fig. 2. Optical change stomach tissues of HCl/ethanol-induced acute gastritic mice. All data are expressed means ± SEM (n=8). Normal mice (Nor); (A), gastritic lesion mice with distilled water (Veh); (B), gastritic lesion mice with 10 ㎎/㎏ sucralfate (SC); (C), gastritic lesion mice with 16 g/㎏ Flaxseed oil (FO); (D), gastritic lesion mice with 16 g/㎏ flaxseed oil + 50 ㎎/㎏

CIL (FCL); (E), gastritic lesion mice with 16 g/㎏ flaxseed oil + 100 ㎎/㎏ CIL (FCH); (F). Significance: ***p < 0.001 vs.

treated gastric lesion mice.

3. 위 점막 손상도 변화

위 점막 손상 정도를 육안으로 관찰한 결과, 아무런 처치를 하지 않은 정상군 마우스의 위 점막에서는 손상이 발견되지 않 았으나 증류수를 처리한 대조군 (B)에서는 150 mM HCl/60%

ethanol에 의해 위 점막이 손상을 받아 출혈 및 부종이 발생된 것을 관찰할 수 있었다. 대조군 (B)의 손상 부위 면적 비율은 23.28 ± 1.05%로 정상군 (A)에 비해 매우 높게 나타났으며, FO군 (D)은 17.65 ± 1.67% (p<0.001)로 대조군 (B)에 비해 유의적으로 낮은 손상율을 나타났다. SC군 (C) 또한 10.57 ± 0.96% (p<0.001)로 대조군 (B)에 비해 손상 정도가 유의하게 감소하였으며, FCL군 (E) (11.79 ± 0.85%) 및 FCH군 (F) (10.57 ± 0.45%)의 경우에도 SC군 (C)과 유사하게 손상정도 가 유의적으로 (p<0.001) 감소되었다 (Fig. 2).

4. 위 조직의 산화적 스트레스 바이오마커 변화

본 연구에서는 급성 위염 유발 동물 모델의 위 조직을 이용 하여 산화적 스트레스 마커인 ROS와 ONOO

를 측정하였다.

ROS를 측정한 결과, 대조군 (168828.6 ± 16602.4 fluorescence

/min/㎎ protein)에 비하여 정상군 (151228.6 ± 9749.7 fluorescence/min/㎎ protein)은 수치가 낮게 나타났으며 양 성대조군인 SC군 (164129.5 ± 5393.1 fluorescence/min/

㎎ protein) 또한 감소하였다. FO군 (143616.2 ± 7229.8 fluorescence/min/㎎ protein)과 FCL군 (146175.2 ± 15291.0 fluorescence/min/㎎ protein)에서도 감소한 것을 확인할 수 있었으며 FCH군 {137087.6 ± 6532.2 fluorescence /min/㎎ protein (p<0.05)}도 유의적으로 감소하였다. ONOO

를 측정한 결과, 대조군 (20663.00 ± 2781.04 fluorescence/

㎎ protein)은 정상군 {13052.00 ± 1037.77 fluorescence/

㎎ protein (p<0.001)}에 비하여 유의적으로 수치가 증가하였고, 양성대조군인 SC군 {16047.18 ± 618.21 fluorescence/㎎

protein (p<0.05)}과 FO군 {16031.33 ± 646.31 fluorescence /㎎ protein (p<0.05)}에서는 대조군 대비 유의성 있게 감소하 였으며, FCL군 {12678.00 ± 482.07 fluorescence/㎎ protein (p<0.001)}과 FCH군 {11793.60 ± 770.87 fluorescence/㎎

protein (p<0.001)}에서 또한 유의하게 수치가 감소하였다

(Fig. 3).

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

Nor Veh SC FO DL DH

(fold of N)

***

* * *

Nrf2 Histone

FCL FCH

(A)

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

Nor Veh SC FO DL DH

(fold of N)

FCL FCH

***

* ** **

b-actin HO-1

(B)

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

Nor Veh SC FO DL DH

(fold of N)

FCL FCH

* * *

SOD b-actin

(C)

b-actin Catalase

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

Nor Veh SC FO DL DH

(fold of N)

FCL FCH

** *

(D)

Fig. 4. Expression of anti-oxidant enzyme of stomach tissues in HCl/ethanol induced acute gastritis mice. All data are expressed means ± SEM (n=8). Normal mice; Nor, gastritic lesion mice with distilled water; Veh, gastritic lesion mice with 10 ㎎/㎏ sucralfate; SC, gastritic lesion mice with 16 g/㎏ flaxseed oil; FO, gastritic lesion mice with 16 g/㎏ flaxseed oil + 50 ㎎/㎏ CIL; FCL, gastritic lesion mice with 16 g/㎏ flaxseed oil + 100 ㎎/㎏ CIL; FCH. nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2); (A), heme oxygenase-1 (HO-1); (B), super oxide dismutase (SOD); (C), catalase; (D). Significance:

*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 vs. treated gastric lesion mice.

0 5,000 10,000 15,000 20,000 25,000

Nor Veh SC FO DL DH

ONOO (fluorescence/mg protein

*** *** ***

* *

FCL FCH

0 40,000 80,000 120,000 160,000 200,000

Nor Veh SC FO FCL FCH

ROS (fluorescence/min/mg protein)

*

Fig. 3. Oxidative stress biomarker in stomach tissues. Oxidative stress biomarker reactive oxygen species (ROS) and produces peroxynitrite (ONOO-) in stomach tissues. All data are expressed means ± SEM (n=8). mice per group. Normal mice; Nor, gastritic lesion mice with distilled water; Veh, gastritic lesion mice with 10 ㎎/㎏ sucralfate; SC, gastritic lesion mice with 16 g/㎏ flaxseed oil; FO, gastritic lesion mice with 16 g/㎏ flaxseed oil + 50 ㎎/㎏ CIL; FCL, gastritic lesion mice with 16 g/㎏ flaxseed oil + 100 ㎎/㎏ CIL; FCH. Significance: *p < 0.05, ***p < 0.001 vs. treated gastric lesion mice.

5. 위 조직 항산화 단백질 발현량 분석

위 조직에서 western blot을 실시하여 항산화 단백질인 Nrf2, HO-1, SOD, catalase의 발현을 확인하였다. Nrf2의 발현을 확인한 결과, 대조군 대비 정상군은 87% (p<0.001) 유 의적으로 높게 나타났으며 양성대조군인 SC군과 FO군 에서는 각각 44%, 35% 유의적으로 (p<0.05) 높게 나타났고, FCL군 및 FCH군은 각각 17%, 39% (p<0.05) 농도 의존적으로 증가 하였다. HO-1의 발현은결과, 대조군 대비 FO군은 7% 낮게 나타났지만, 정상군 및 SC군은 각각 58% (p<0.001), 29%

(p<0.05) 유의적으로 높게 나타났고, FCL군과 FCH군 또한

39% (p<0.01))씩 유의적으로 높게 나타났다. SOD의 경우, 대

조군에 비해 정상군 및 SC군은 25% (p<0.05), 20% (p<0.05)

유의적으로 높게 나타났고, FO군도 9% 높게 나타났으며 FCL

군과 FCH군에서도 각각 7%, 29% (p<0.05) 농도 의존적으로

높게 나타났다. catalase의 발현은 대조군에 비해 정상군과 FO

군에서 30%, 3% 높게 나타났고, 양성대조군인 SC군에서도

43% (p<0.01) 유의적으로 높게 나타났으며 FCL군과 FCH군에

서 또한 각각 9%, 35% (p<0.05) 농도 의존적으로 높게 나타났

다(Fig. 4).

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

Nor Veh SC FO DL DH

(fold of N)

* Histone

NF-kBp65

FCL FCH

(A)

p-IkBa IkBa

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

Nor Veh SC FO DL DH

(fold of N)

FCL FCH

(B)

Fig. 5 Expression of inflammtion-related proteins of stomach tissues in HCl/ethanol induced acute gastritis mice. All data are expressed means ± SEM (n=8). Normal mice; Nor, gastritic lesion mice with distilled water; Veh, gastritic lesion mice with 10 ㎎/㎏ sucralfate; SC, gastritic lesion mice with 16 g/㎏ flaxseed oil; FO, gastritic lesion mice with 16 g/㎏ flaxseed oil + 50 ㎎/㎏ CIL; FCL, gastritic lesion mice with 16 g/㎏ flaxseed oil + 100 ㎎/㎏ CIL; FCH. nuclear factor-kappa B p65 (NF-B p65); (A), phosphorylation inhibitor of nuclear factor kappa B alpha (p-IB); (B). Significance: *p < 0.05 vs.

treated gastric lesion mice.

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5

Nor Veh SC FO DL DH

(fold of N)

** **

b-actin iNOS

FCL FCH

(A)

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

Nor Veh SC FO DL DH

(fold of N)

* * *

b-actin IL-1b

FCL FCH

(C)

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

Nor Veh SC FO DL DH

(fold of N)

*

*** ** **

b-actin IL-6

FCL FCH

(B)

Fig. 6. Expression of inflammtion-related proteins of stomach tissues in HCl/ethanol induced acute gastritis mice. All data are expressed means ± SEM (n=8). Normal mice; Nor, gastritic lesion mice with distilled water; Veh, gastritic lesion mice with 10 ㎎/㎏ sucralfate; SC, gastritic lesion mice with 16 g/㎏ flaxseed oil; FO, gastritic lesion mice with 16 g/㎏ flaxseed oil + 50 ㎎/㎏ CIL; FCL, gastritic lesion mice with 16 g/㎏ flaxseed oil + 100 ㎎/㎏ CIL; FCH. inducible nitric oxide synthase (iNOS); (A), interleukin-6 (IL-6); (B), interleukin 1 (IL-1); (C). Significance: *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 vs. treated gastric lesion mice.

6. 위 조직 염증성 단백질 발현량 분석

1) NF-Bp65, p-IB 염증성 단백질 발현량 분석

위 조직에서 염증성 매개인자인 NF-Bp65, p-IB의 발 현을 확인하였다. 그 결과, NF-Bp65는 대조군 대비 정상군 에서 24% 감소하였고 양성대조군인 SC군은 20% (p<0.05) 유 의적으로 감소하였으며 FO군, FCL군 및 FCH군에서 각각 9%, 15%, 17% 발현이 감소하였다. p-IB의 경우 대조군 대비 정상군은 18% 감소하였으며 양성대조군인 SC군은 21% 감소 하였고, FO군, FCL군 및 FCH군은 각각 5%, 10%, 16% 감소

하였다 (Fig. 5)

2) iNOS, IL-6, IL-1 염증성 단백질 발현량 분석

염증성 매개인자인 iNOS, IL-6, IL-1의 발현을 확인한 결과, iNOS의 발현의 경우 대조군 대비 정상군은 48% (p<

0.01) 유의적으로 감소하였으며 양성대조군인 SC군에서도 46% (p<0.01) 유의적으로 감소하였고, FO군, FCL군 및 FCH 군에서도 각각 11%, 17%, 27% 농도 의존적으로 감소하였다.

IL-6의 발현은 대조군 대비 정상군과 SC군에서 각각 29%

(p<0.05), 52% (p<0.001) 유의적으로 감소하였고, FO군에서 도 16% 감소하였고 FCL군과 FCH군에서도 각각 46%

(p<0.01), 36% (p<0.01) 유의적으로 감소하였다. IL-1의 발 현 확인결과, 대조군 대비 정상군과 SC군은 각각 11%, 8% 감 소하였으며 FO군, FCL군 및 FCH군 또한 각각 21% (p<0.05), 21% (p<0.05), 24% (p<0.05) 유의적으로 감소하였다(Fig. 6).

Ⅳ. 고 찰

위염은 위 점막에 발생하는 염증성 질환중 하나로 술, 산, 비 스테로이드성 약물, 산화적 스트레스 등의 유해인자로 인해 정 상적으로 균형을 이루고 있는 공격인자와 방어인자가 불균형하 게 되어 발생 한다

. 위에서 발생한 자유라디칼은 여러 효소들 이 반응함으로써 신속하게 제거되지만 과도한 양의 자유라디칼 은 독성을 일으켜 위 점막에 손상을 준다

. 본 실험에서는 甘 菊 추출물과 亞麻仁油 혼합물 처리 후, 150 mM HCl/60%

ethanol를 이용해 급성 위염을 유발하였는데, ethanol은 위 점 막을 자극해 출혈과 손상을 일으키고 HCl은 위 운동을 증가시 켜 손상을 더욱 악화시키는 것으로 알려져 있다

. 유발 1시간 뒤, 부검하여 얻은 위 조직을 이용해 산화적 스트레스 개선 효 과, 항산화 관련 인자 및 염증 관련 인자의 발현을 측정하여 위 점막 보호 효과를 평가하였다.

부검 뒤 얻은 위 조직을 육안적으로 관찰한 결과, 아무런 처 치를 하지 않은 정상군은 위 점막 손상이 발견되지 않았으나, 증류수를 처리한 후 급성위염을 유발한 대조군은 위 점막이 손 상을 받아 출혈 및 부종이 발생하였고, 반면에 약물 처리군인 FCL군과 FCH군은 농도 의존적으로 위 점막의 손상이 억제된 것을 확인할 수 있었다. 위 점막 손상도를 측정한 결과, 대조군 은 정상군에 비해 유의적으로 손상도가 높게 나타났으며, 약물 처 리군인 FCL군과 FCH군은 유의적으로 손상 정도가 감소하였다.

알코올에 의해 위염을 일으키는 중요한 인자로 산화적 스트 레스가 작용한다고 Olaleye 등

의 연구에 의해 보고되어 졌 다. 체내에 축적되어 정상적으로 소거되지 않은 ROS는 세포를 산화적 스트레스 상태에 이르게 하며, 과도하게 축적된 산화적 스트레스 상태에서의 ONOO

는 염증반응 및 여러 만성질환 발 생에 관여하며, 또한 protein과 DNA 등과 반응하여 세포의 손 상을 야기한다

. 위 조직에서 산화적 스트레스 바이오 마커인 ROS와 ONOO

를 측정한 결과, 정상군에 비해 대조군에서는 수치가 증가한 것을 확인할 수 있었으며, FO군 뿐만 아니라 FCL군과 FCH군도 농도 의존적으로 수치가 감소하였다.

부검 뒤 얻은 위 조직을 이용하여 항산화 관련 단백질인 Nrf2, HO-1, SOD, catalase의 발현을 측정하였다. 산화적 스트레스 는 세포 보호 유전자의 발현을 유도하는데, Nrf2는 산화적 스 트레스가 발생할 경우 활성친전자체를 중화시키는 핵심 전사인 자로써 HO-1 등 항산화 효소들의 발현을 증가시키며

, 항산 화 효소들은 생체 내의 방어기전으로 생성된 활성산소종을 소 거하거나 생성을 억제 시킨다

. 실험 결과 Nrf2, HO-1, SOD, catalase는 정상군에 비해 대조군에서 발현이 감소하였 으며, 약물 처리군인 FO군, FDL군 및 FCH군에서의 발현이 증 가하였다.

또한, 산화적 스트레스에 의한 염증반응을 확인하기 위하여 염증 관련 단밸질인 NF-Bp65와 p-IB의 발현을 측정하 였다. NF-Bp65는 면역기능 등 다양한 세포 활동을 조절하는 전사인자로 알려져 있으며, 염증 및 암의 발생에 중요한 역할을 하는데, IB가 인산화 되면서 NF-Bp65를 핵 안으로 이동 시켜 염증성 매개인자와 염증성 사이토카인의 발현을 유도 한 다

. iNOS는 혈관확장, 숙주 방어 등에 관여하며 암과 관련된 여러 질병의 병인 되는 NO를 생성하는 염증성 매개인자로 알 려져 있다

. IL-6는 염증반응을 촉진하는 사이토카인으로 알 려져 있으며, IL-1는 염증 초기에 작용하며 염증 매개체를 활성화 시킨다

. 따라서 염증성 인자인 NF-Bp65, p-IB, iNOS, IL-6, 및 IL-1의 발현을 측정한 결과, 대조군이 정상 군 보다 발현량이 높게 나타났으며 FO, FCL 및 FCH의 약물 처리에 따라서 염증관련 단백질이 유의적으로 억제되었고, 특 히 FCH 처리에서 높은 감소효과가 나타났다.

Ⅴ. 결 론

본 연구에서는 甘菊 50% EtOH 추출물와 亞麻仁油 혼합물을 경구 투여하여 급성 위염 동물모델에서의 위 점막 보호 효과를 확인하였으며 다음과 같은 결과를 얻었다.

1. 亞麻仁油의 섭취는 150mM HCl/60% ethanol로 유발된 위 점막 손상 동물모델에서 위 조직의 손상을 감소시켰으 며, 甘菊 50% EtOH 추출물과 亞麻仁油 혼합물 또한 농 도 의존적으로 위 점막의 손상을 감소시켰다.

2. 甘菊 50% EtOH 추출물과 亞麻仁油 혼합물을 경구 투여 함으로써 산화적 스트레스 관련 인자인 ROS, ONOO

의 수치를 효과적으로 감소시켜 위 점막 손상을 개선시킨 것 으로 나타났다.

3. 甘菊 50% EtOH 추출물과 亞麻仁油 혼합물을 경구 투여 함으로써 Nrf2와 항산화 효소인 HO-1, SOD, catalase 의 발현을 유의적으로 증가시켰다.

4. 甘菊 50% EtOH 추출물과 亞麻仁油 혼합물을 경구 투여 함으로써 IB의 인산화를 감소시켜 NF-Bp65의 발 현을 농도 의존적으로 감소시켰다.

5. 甘菊 50% EtOH 추출물과 亞麻仁油 혼합물을 경구 투여 함으로써 염증성 매개인자인 iNOS와 염증성 사이토카인 인 IL-6와 IL-1의 발현을 억제시켰다.

따라서 급성 위염 동물 모델에서 甘菊 50% EtOH 추출물과

亞麻仁油 혼합물은 항산화 경로를 통하여 산화적 스트레스를

감소시키고 염증 관련 매개인자 및 사이토카인의 발현을 억제

시킴으로써 위 점막 보호 효과가 있다고 사료된다.

감사의 글

본 연구는 2017년도 산학연협력 기술개발사업 첫걸음 과제 (C0565067)의 지원을 받아 수행되었습니다.

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