Chapter 5

Chapter 5

Nucleic Acid Technology

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DNA isolation methods

1. Bacterial viruses

protein coat is extracted by phenol

– DNA is ethanol precipitated

(DNA는 aqueous 지역에 존재하며 ethanol에 의하여 침전이 된다)

5.1 nucleic acid isolation

Organism의 구조와 구성이 모두 다르기

때문에 DNA의 분리 방법은 organism에 따라 조금씩 다르다.

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2. Bacteria

박테리아는 cell membrane과 cell wall등이 다양하다 이들은 phenol에 의해서 간단히 제거가 안된다.

– treatment with lysozyme removes the cell wall and detergent releases the cell contents

– RNase treatment degrades RNA – proteins are extracted by phenol – DNA is ethanol precipitated

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3. Plasmids

– cell wall is digested by lysozyme treatment

– suspension in SDS-sodium hydroxide solution cleaves RNA and separates chromosomal DNA strands

– neutralization with acid results in formation of insoluble chromosomal DNA aggregates that are removed by centrifugation

– plasmid DNA is precipitated by ethanol

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4. Yeast and fungi

– cell walls are removed enzymatically

– cell contents are released by detergent treatment – RNase treatment degrades RNA

– proteins are extracted by phenol – DNA is ethanol precipitated

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5. Higher eukaryotes

– isolate nuclei

chloroplast로부터의 DNA의 오염을 막을 수 있다)

– break nuclei open

– digest RNA and protein – ethanol precipitate DNA

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RNA isolation

RNA는 분리 과정에서 RNase에 의하여 쉽게 파괴된다

• freeze cells in liquid nitrogen and grind with pestle

• suspend ground cells in lysis reagent that contains guanidinium and phenol

– denatures proteins (RNase등을 포함) and dissociates nucleoprotein complexes

• chloroform treat mixture and separate phased by centrifugation

• ethanol precipitate RNA

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1. Metal shadowing in electron microscopy

Figure 5.1

5.2 Electron Microscopy

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Negative staining in electron microscopy

Figure 5.3

보다 더 복잡한 구조를 볼 수 있다. Sample을 phosphotungstic acid나 uranium salts (전자를 강하게 흡수 할 수 있는 atom을 포함함) 와 섞는다. 이를 film 위에 놓으면 sample이 있는 곳의 metal ion의 두께가 적어 전자 beam이 더 잘

통과되어 sample이 없는 다른 부위에 비하여 밝게 보인다. Protein 이나 virus particle의 negative image를 볼 수 있다.

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2. Negative staining in electron microscopy

Figure 5.4a

Figure 5.4b

Negaively stained Bacteriophage T7 helicase/

primase

Tomato bushy stunt virus particles (particle을 구성하고 있는 개개의 단백질이 관찰됨) ₁₀

3. Cryo-electron microscopy

Figure 5.5

RNA polymerase나 ribosome 등과 같이 커다란 protein complex를 보는데 효과적이다.

Sample을 포함한 buffer를 갑자기 얼리면 sample을 잡고 있는 비결정의 얼음 층이 형성되고 이를 전자 현미경으로 관찰한다. 위의 그림은 박테리아의

ribosome임 ¹¹

Velocity sedimentation

• Sedimentation velocity depends on two properties:

- molecular mass

• as mass increases, so does sedimentation velocity

- shape

• friction impedes motion of a particle through a fluid

• more extended molecules move less rapidly

(polymer 처럼 덜 extended된 분자는 더 빠르게 이동)

5.3 Centrifugal Techniques

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Sedimentation coefficient

• s = velocity/centrifugal force

• one Svedberg (S) = 10 ^-13 sec

대부분 macromolecular의 S 값은 1X 10^-13 - 100X 10^-13 이며 Thredor Svedverg (원심분리기의 창시자)를 기념하여 10^-13 를

1S라고 한다. 두 개의 적은 분자가 합쳐진 한 분자의 S 값은 단순히 그 둘의 S 값을 합한 것이 아니다)

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1. Zonal centrifugation

Figure 5.6

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Alkaline sucrose gradient centrifugation

Figure 5.7a

Separates covalently closed circular DNAs from linear duplexes and nicked circles

Figure 5.7b

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2. Equilibrium density gradient centrifugation

Figure 5.8

Separates particles according to density

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Ethidium bromide allows separation of DNA topoisomers

Figure 5.10

Ethidium intercalates between base pairs to change the relative densities of different DNA forms

Ethidium bromide intercalation을 만듬;

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Figure 5.11a

DNA migration rate depends on total charge, shape, and molecular mass

Figure 5.11b

5.4 Gel Electrophoresis

핵산이나 단백질처럼 전하를 갖는 분자가 agarose나 polyacrylamide로 이루어진 electric field에서 이동하는 현상을 전기 영동 (gel electrophoresis)이라고 함

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Agarose vs polyacrylamide

• Polyacrylamide

– separates small single-stranded DNAs from 5 to 750 nucleotides

– can resolve DNAs that differ in size by one nucleotide

• Agarose

– lower resolving power than polyacrylamide – separates DNA molecules ranging in size

from 200 bp to 50,000 bp

DNA는 gel을 ethidium bromide로 염색한 후 254 UV로 보면 관찰 가능하며 0.1 ug의 DNA도 충분히 보인다. 그러나 이 방법은 세가지의 문제점을 갖음 1) 느리며 2) 자동화가 어려우며 3) 정량 분석이 어렵다.

이러한 문제점을 해결한 것이 capillary gel electrophoresis임

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Capillary gel electrophoresis

Figure 5.12a; 20-100um의 tube를 사용하기 때문에 열을 쉽게 발산하여 높은 전압에서 실험이 가능. 즉 sample이 짧은 시간에 분리됨

Low loading capacity means this technique is usually used for analytical rather than preparative work

Figure 5.12b; 하나의 gel에서 40-60개의 단일가닥의 polyadenylic acid를 분리한것

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DNA size determination by electrophoresis

Figure 5.13a

Figure 5.13b

Adapted from an illustration by Michael Blaber, Florida State University

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Protein gel electrophoresis

• sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)

• separates proteins on the basis of size alone

– SDS (detergent) and mercaptoethanol (disulfide bond breaking) denature proteins

Denature 되면 막대모양이 되고 negatively charged된 SDS에 의하여 coating되어 단지 mass에 의해서만 분리가 된다.

단백질은 전하도 다양하고 모양도 다양하기 때문에 DNA 처럼 단지 molecular mass에 의해서만 분리 될 수 없다. 이를 해결하기 위하여 SDS-PAGE를 사용함

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Pulsed field gel electrophoresis separation of chromosomes from a diploid yeast cell.

커다란 DNA 분자를 분리하는 방법; 일정한 간격으로 electric field의 방향을 바꿔주어 DNA의 이동 방향을 바꾸어서 분리가 되게한다. Reorientation시 작은 DNA 분자는 커다란 DNA 분자 보다 새로운 방향으로 쉽게 움직인다.

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• digest

polynucleotides

• DNases - digest DNA

• RNases - digest RNA

• endonucleases - digest within a strand

• exonucleases - digest end of a strand

5.5 Nucleases and Restriction Maps

Nucleases

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Restriction endonucleases

Table 5.2

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Cleave DNA at specific sites

Table 5.3

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Restriction maps

Photo courtesy of FOTODYNE Incorporated.

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5' end labeling DNA

Figure 5.20

특정 fragmemt가 너무 적어서 관찰이 어렵거나 여러 개의 비슷한 크기의 fragment가 있을때는 5’ end labeling를 사용

Autoradiography; ³²P에서 β particle이 방출되어 photographic film에서 silver ion을 감소시켜 검은 band가 생기게함

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Plasmids are excellent cloning vectors

Figure 5.21

5.6 Recombinant DNA technology

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Southern blotting is used to detect specific DNA fragments

Figure 5.22

Figure 5.23: Southern blot of genomic DNA from normal tissue (N) and from a tumor (T) from a patient with breast cancer.

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DNA polymerase I polymerizes DNA

Figure 5.24

Moleclular biologist에게 가장 중요한 효소중에 하나. 1956년 Arthur Kornberg가 E.

coli에서 분리함. Pre-formed DNA의 존재하에 deoxynucleoside triphosphate를 DNA로 합성함 (5’ – 3’ 방향으로 합성)

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Figure 5.25

DNA polymerase I은 하나의 single polypeptide (928개의 아미노산, 103 kDa)이며 3가지의 기능을 갖는 domain으로 구성됨

1) Polymerase activity

2) 3’-5’ exonuclease activity; proofing reading 3) 5’-3’ exonuclease activity; DNA 합성시 editing

기능을 함

1970년 Hans Klenow가 klenow fragment를 분리

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Klenow fragment의 구조. 오른손 모양으로 3개의 domain으로 됨

Polymerase activity는 손바닥에 위치함 Thumb domain; primer-template의 minor groove에 위치

Finger domain; uncopied template strand에 위치

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DNA polymerase I는 single break (nick)이 있는 경우 DNA를 아주 잘 합성한다.

5’-3’ exonuclease가 있는 경우 풀어진 5’ 쪽은 없어지면서 계속 nick이 발생하면서 새로운 DNA가 합성된다. 이를 nick translation이라고 함

Radioactive, fluorescent, 혹은 chemical tag을 갖는 DNA를 합성하는데 사용됨

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Polymerase chain reaction (PCR)

Figure 5.31

1983년 Kary B. Mullis가 발견함. PCR cycle에 대하여 만들어지는 DNA는 2ⁿ 임. 그러므로 30 cycle을 하면 target DNA가 10⁹ copy가 생김. (실제는 60%-85%)

Taq DNA polymerase를 많이 사용하나 요즈음은 Pfu 나 Vent polymerase를 많이 사용.

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Site-directed mutagenesis

Figure 5.32

1970년 중반에 Michael Smith가 발견한 방법으로 특정 아미노산이 바뀌었을 때 단백질의 기능에 어떠한 영향을

주는가를 조사 할 때 사용된다

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Sanger의 Sequencing 방법

Deoxynucleoside triphosphate

Dideoxynucleoside triphosphate

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cDNA synthesis by reverse transcriptase

Figure 5.35

RNA로부터 DNA를 합성하는 방법. 1970년 Howard Temin과 David Baltimore가

retoviruses에서 발견함 ₃₈

DNA chip or microarray technology

특정 서열을 갖고 있는 DNA를 찾거나 하나의 base가 바뀐 DNA 분자를 감지할때 사용 DNA chip은 DNA fragment 가 붙어있는 solid surface 를 이용하며 이들 DNA fragment가 Probe로 작용하며 용액내에 있는 상보적인 DNA나 RNA와 교잡을한다.

DNA chip를 만드는데는 두가지 방법이 존재

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Using a DNA microarray

Figure 5.37

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