Molecular Authentication and Phylogenetic Relationship of Bupleurum Species by the rDNA-ITS Sequences

rDNA-ITS 염기서열 분석을 통한 시호 종 감별용 유전자 마커 개발 및 유연관계 분석

문병철, 추병길, 지윤의, 윤태숙, 이아영, 전명숙, 김보배, 김호경^*1)

한국한의학연구원 한약자원연구센터

Molecular Authentication and Phylogenetic Relationship of Bupleurum Species by the rDNA-ITS Sequences

Byeong Cheol Moon, Byeong Kil Choo, Yuni Ji, Taesook Yoon, A Young Lee, Myeong Sook Cheon, Bo Bae Kim, Ho Kyoung Kim^*

Center of Herbal Resources Research, Korea Institute of Oriental Medicine

ABSTRACT

Objectives : Bupleuri Radix (

Siho

Bupleurum

Bupleurum

Methods : PCR amplification of rDNA-ITS region was performed using ITS1 and ITS4 primer from 6

Bupleurum

B. falcatum

Siho

B. falcatum

(

Samdo-Siho

B. chinense

Buk-Siho

B. scorzonerifolium

Nam-Siho

B. longiadiatum

Gae-Siho

B. euphorbiodes

Deungdae-Siho

B. latissimum

Seom-Siho

Results : In comparative analysis of the rDNA-ITS sequences, we found specific nucleotides to distinguish Korean (

B. falcatum

B. chinense

B. scorzonerifolium

Bupleurum

B. falcatum

B. chinense

B. scorzonerifolium

B. euphorbioides

B. longiradiatum

B. latissimum

B. latissimum

Bupleurum

* 교신저자 : 김호경, 대전시 유성구 엑스포로 483 한국한의학연구원 한약자원연구센터

․ Tel : 042-868-9502 ․ E-mail : [email protected]

․ 접수^：2009년 ⁸월 ¹⁹일 ^․ 수정^：2009년 ⁹월 ¹⁴일 ^․ 채택^：2009년 ⁹월 ²³일

Conclusions : These marker nucleotides would be useful to identify the official herbal medicines by the providing of definitive information that can identify each plant species and distinguish it from unauthentic adulterant

Bupleurum

Key words : Bupleuri Radix,

Bupleurum

서 론

시호(柴胡)는 ≪신농본초경(神農本草經)≫에 처음 수록 된 이래 2000년 동안 한열왕래(寒熱往來), 흉만협통(胸滿 脇痛), 구고이롱(口苦耳聾), 간울협통유창(肝鬱脇痛乳脹), 두통목현(頭痛目眩), 학질(瘧疾), 하리탈항(下利脫肛), 월 경부조(月經不調), 자궁하수(子宮下垂) 등의 증상을 치료 하는데 이용하는 중요한 한약재 중의 하나이다^1,2). 산형 과(Umbelliferae)의 시호속(Bupleurum) 식물은 전 세계적 으로 약 150여 종이 유럽과 아시아 대륙에 분포하고 있 으며, 일부는 아프리카와 북미에도 분포하고 있는 것으로 알려져 있다³⁾. 국내에 자생하는 시호속 식물로는 시호(B.

falcatum L.), 참시호(=협엽시호, 남시호, B. scorzonerifolium Willd.), 등대시호(B. euphorbioides Nakai), 개시호(B.

longiradiatum Turcz.) 및 섬시호(B. latissimum Nakai) 가 자생하고 있으며⁴⁾, 시호의 변종 삼도시호의 개량종이 주로 강원도 정선, 경북 영천, 전남 고흥 등지에서 재배 되고 있다.

시호(柴胡)의 기원식물로 ≪대한약전≫⁵⁾과 ≪중국약 전≫⁶⁾에서 각각 산형과(Umbelliferae)의 시호(B. falcatum Linne) 또는 그 변종(variety)의 뿌리와 시호(북시호, B.

chinense DC.) 또는 협엽시호(=남시호, 참시호, B. scorzonerifolium Willd.)의 뿌리로 다르게 규정하고 있다. 하지만 독성을 가지는 개시호를 비롯한 20여 종 이상의 시호속 식물의 뿌리가 시호(柴胡)로 생산․유통되어 임상에서 이용되고 있는 실정이다. 시호(柴胡)의 감별은 주로 기원식물의 지 상부나 약용부위 또는 한약재 절편의 형태, 색깔, 조직, 향 기 등에 기초한 관능적 특성분석에 의해 이루어 졌으며, 최근에는 saikosaponin 함량 측정과 같은 이화학 분석법을 이용하고 있다. 그러나 이들 시호속 식물의 건조․절단되 어 가공된 약재 형태가 유사하여 형태적 감별이 어려울뿐 만 아니라 생육환경이나 종에 따라 saikosaponin 함량의 차이가 있어 그 진위를 감별하는데 어려움이 있다⁷⁾. 따라 서 정품 시호(柴胡)의 구별을 통한 한약 표준화를 위해 보다 객관적이고 신뢰성 있는 새로운 감별법의 확립이 요구되고 있다.

Ribosomal RNA 유전자의 internal transcribed spacer (ITS) 부위는 18S rRNA 유전자, 엽록체 게놈의 matK 유전자, rbcL 유전자, atpA 유전자, trnL-F 유전자 등과 함께 식물의 분자계통분류나 한약재 감별에 많이 이용되 고 있는 유전자 염기서열이다⁸⁾. rDNA-ITS 부위는 현재 까지 시호(柴胡)를 비롯한 다양한 식물이나 한약재에 대

한 종 감별이나 유연관계 분석을 위한 유전자 마커로 이 용되어져 왔다^7,9-13). Yang 등¹²⁾은 중국 북서부 지역에 분 포하는 시호류 9종과 그 변종에 대해, Xie 등⁷⁾은 중국지역 의 시호류 20종과 1변종에 대해 유연관계분석 및 염기서열 의 유사도 비교를 통한 종 감별용 분자마커로 rDNA-ITS 부위 염기서열을 제안하였으며, Lin 등¹³⁾은 3종의 시호 rDNA-ITS 부위를 이용한 PCR-SSOP array (Polymerase Chain Reaction-Sequence Specific Oligonucleotide Probes) 방법을 이용한 종 감별법을 보고하였다. 하지만 전자의 경우는 종별 기준이 명확하지 않고 후자의 경우는 과정 이 복잡하고 비용이 많이 소요되어 실질적으로 유통현장 에서의 활용이 어려운 단점을 가지고 있다. 뿐만 아니라 이들의 연구에서는 ≪대한약전≫과 ≪중국약전≫의 기준 을 고려하는 것이 부족하였고, 우리나라 울릉도 특산종인 섬시호를 포함하지 않았다. 국내에서는 주로 외부 형태 연구와 현미경을 이용한 내부형태 관찰를 통한 시호류 분류와 진위 감별에 대한 연구가 진행되었다^3,14). 또한, 한국 특산종인 섬시호의 분류학적 연구를 위해 내․외부형 태, 화분의 형태, 염색체의 수와 핵형 분석을 통한 종간 유 연관계를 분석으로 섬시호는 개시호와 등대시호에 가장 유 연관계가 깊은 것으로 보고하였으나^3,15,16), rDNA-ITS 염기 서열을 이용한 분자계통분류에서는 정확한 유연관계를 밝히지 못했으며¹⁶⁾, 시호속의 rDNA-ITS 염기서열 및 RFLP 분석에서는 섬시호를 포함시키지 않아 국내자생종 전체에 대한 유전자 수준에서의 종간 유연관계를 밝히지 는 못하였다¹⁷⁾. 또한 많은 양의 한약재가 중국에서 수입 됨에 따라 식물분류학적 측면보다는 우리나라와 중국의 약전과 국내자생종 전체를 대상으로 한 시호(柴胡) 기원 정립이 필요할 것으로 판단된다.

본 연구에서는 ≪대한약전≫과 ≪중국약전≫을 기준으 로 본초학적 측면에서 시호(柴胡)의 기원종을 보다 객관 성 높은 분자생물학적인 감별법을 모색하고 이들과 우리 나라에 자생하는 시호류 및 울릉도 특산종인 섬시호와 유전 유연관계를 분석하고자 하였다. 따라서 우리나라 약 전과 중국약전에 시호(柴胡) 기원식물로 규정된 시호(B.

falcatum L.)와 그 변종(B. falcatum L. 변종의 개량종, 본 연구에서는 B. falcatum

-

chinense DC.), 남시호(B. scorzonerifolium Willd.), 그리 고 국내에 자생하는 3종의 시호류인 등대시호(B. euphorbioides Nakai), 개시호(B. longiradiatum Turcz.) 및 섬시호(B.

latissimum Nakai)의 rDNA-ITS 염기서열 분석을 통해 이들의 종간 유연관계를 분석하고, 염기서열 비교를 통해

시호류 종 감별에 활용 가능한 marker nucleotide를 분석 선별하여 혼․오용 방지를 위한 분자마커로 활용하고자 제시하는 바이다.

재료 및 방법

1. 재료

실험에 사용한 시호류는 Table 1에서 나타낸바와 같이 국내는 덕유산, 황악산, 오대산, 설악산 등의 자생지와 경 북 영천, 전남 고흥, 기청산식물원 등의 재배지에서, 국외 는 중국의 사천성, 감숙성 등의 자생지에서 2006년 7월부 터 2008년 8월에 직접 수집하였다. 수집한 시료는 본초 학, 생약학, 식물분류학 등의 전문가로 구성된 분류․동 정 자문회의의 동정을 거쳐 그 종을 확정지어 사용하였 으며, 각 시료의 기원식물은 표본을 제작하여 한국한의학 연구원 표본관에 보관하였다(Table 1).

2. 방법

1) DNA 추출

국내외 자생지 또는 재배지에서 수집하여 -70℃에 보 관중인 기원식물 생체시료 및 약재 시료를 액체질소로 급냉시켜 막자사발을 이용하여 분말상태가 되도록 마쇄 한 후, Plant genomic DNA Prep Kit (Solgent, Korea) 또는 DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN, Germany)을 이 용하여 제작자가 제공한 protocol에 따라 추출․정제하였 다. 정제된 DNA의 순도와 질을 확인하기 위하여 1.5%

agarose gel을 이용하여 전기영동 후, EtBr (Ethidium Bromide)로 염색하여 UV light상에서 DNA band를 확인 하였으며, UV spectrophotometer를 이용하여 260 nm와 280 nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다.

2) rDNA-ITS 부위 PCR 증폭

약 5～20 ng의 genomic DNA와 각 20 pmole의 ITS1 (5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3')과 ITS4 (5'-TCC TCC GCT GAT TGA TAT GC-3’) primer (White et al., 1990¹⁸⁾, 그리고 2 unit의 DNA polymerase를 50 ㎕의 1×반응용액(75 mM Tris-HCL (pH 8.8), 20 mM (NH4)2SO4, 0.1% (v/v) Tween 20, 20 μM dNTP, 200 μM MgCl2)에 각각 첨가하여 DNA Engine Dyad Thermal Cycler (MJ Research, USA)를 이용하여 증폭하였다. 반 응조건은 95℃에서 5분간 predenaturation한 후 95℃에서 30초 denaturation, 51℃에서 40초 annealing, 72℃에서 1 분 extension을 35회 수행하고 마지막으로 72℃에서 10분 간 extension 시켜 증폭하였다.

3) 염기서열 분석

rDNA-ITS부위 증폭산물의 DNA 염기서열 분석을 위 하여 total 증폭산물을 1.5% agarose gel상에서 100bp DNA ladder (Solgent, Korea)와 함께 전기영동하고 EtBr 로 염색하여 관찰한 후, 정확하게 증폭된 ITS 증폭산물 을 agarose gel로부터 회수하여 Agarose Gel Extraction Kit (SolGent, Korea)를 이용하여 정제한 뒤 pGEM-Teasy Vector Systems (Promega, USA)에 삽입하였다. 삽입된 증 폭산물은 XL1-Blue MRF' competent cell (Stratagene, USA)

Table 1. List of Plant Materials and Information of Specimens

Species (Common Korean name) Specimen No. Geographical origin Line Bupleurum falcatum L.

(Siho)

KIOM200601000803 Haenam, Cheonnam 1

KIOM200601000167 Mt. Hwangak, Gimcheom, Gyeongbuk 2 KIOM200601000200 Keychungsan botanical garden, Pohang, Gyeongbuk 3 Bupleurum falcatum-SamDo

(SamDo-Siho, an improved breed of B. falcatum L.)

KIOM200601000083 Yeongcheon, Gyeongbuk 4

KIOM200601000084 Goheong, Cheonnam 5

KIOM200803000019 Suwon, Gyeonggi 6

Bupleurum chinense DC.

(Buk-Siho, Siho)

KIOM200601000138 Rong County, Sichuan, China 7

KIOM200702000507 Li County, Gansu, China 8

KIOM200601000508 Wen County, Gansu, China 9 Bupleurum scorzonerifolium Willd.

(Cham-Siho, Nam-Siho)

KIOM200601000136

Rong County, Sichuan, China

10

KIOM200601000137 11

KIOM200601000135 12

Bupleurum euphorbioides Nakai (Deungdae-Siho)

KIOM200601000168

Mt. Seorak, Inje, Gangwon 13

KIOM200601000169 14

KIOM200701000636 Mt. Seorak, Sokcho, Gangwon 15 Bupleurum longiradiatum Turcz.

(Gae-Siho)

KIOM200601000176 Mt. Gyaebang, Pyeongchang, Gangwon 16 KIOM200601000153 Mt. Sudo, Gimcheon, Gyeongbuk 17 KIOM200601000050 Mt. Jeoksang, Muju, Cheonbuk 18 Bupleurum latissimum Nakai

(Seom-Siho)

KIOM200601000201

Keychungsan botanical garden, Pohang, Gyeongbuk 19

KIOM200601000202 20

KIOM200803000015 21

에 형질전환한 뒤 ampicillin과 X-gal/IPTG가 첨가된 LB agar 배지에 도말하여 약 20시간 배양하였다. 각 시료별 로 선별된 3개의 white colony를 액체배양하고 Plasmid mini preparation kit (SolGent, Korea)를 이용하여 plasmid DNA 를 분리한 후, T7과 SP6 primer를 이용하여 ABI 3730 automatic DNA sequencer (Applied Biosystems, USA)에서 염기서열을 분석하고 각 시료의 rDNA-ITS 부위 염기서 열을 확정하였다.

4) 종간 유연관계 및 marker nucleotide 분석

결과 및 고찰

1. rDNA-ITS 염기서열 분석

rDNA-ITS 부위의 유전자 염기서열을 이용한 시호류 종 분류를 위하여 분류동정 자문회의를의 분류․동정을 거쳐 확증된 종별 3개체 이상의 생체시료로부터 추출한 게놈 유전자를 주형으로 하여 ITS1과 ITS4 primer¹⁸⁾로

PCR 증폭하여 약 700 bp의 증폭산물을 얻었다(Fig. 1). 6 종 1변종 21개 시료의 rDNA-ITS 증폭산물을 pGEM- Teasy vector에 subcloning한 뒤 3개의 colony로부터 염 기서열을 비교 분석하여 각 시료의 rDNA-ITS 염기서열 을 확정하였다. 확정된 각 시료의 염기서열을 분석한 결 과 시호, 삼도시호, 북시호 및 남시호는 694 bp, 개시호는 695 bp, 등대시호와 섬시호는 696 bp의 염기로 구성되어 있었다(Fig. 2, Table 2). 이들 전체 증폭산물의 G+C 함 유량은 섬시호가 가장 낮은 57.47%로 나타났으며 북시호 가 가장 높은 58.65%로 나타나 큰 차이는 보이지 않고 유사하였다(Table 2). 종내 시료간 염기서열의 차이는 대 부분 100% 일치하거나 최대 4 bp로 낮은 변이율을 보이 는 것으로 나타났으며, ClustalW를 이용하여 분석한 염 기서열 유사도는 99.4% 이상으로 나타났다. 다양한 지역 의 서식지나 재배지에서 수집한 시료로부터 확보한 이러 한 결과는 시호류가 종내 변이가 적고 안정적인 유전특 성을 가지는 식물종임을 간접적으로 판단할 수 있다.

우리나라 약전이 규정하고 있는 시호(柴胡)의 기원종 인 시호와 본 연구에서 수집하여 분석한 시호류와의 종 간 염기서열을 분석한 결과, 종간 염기서열 유사도는 시 호의 개량․재배종인 삼도시호와 100% 일치하는 반면, 중국약전의 기원종인 북시호와 남시호는 각각 97.99%와 92.8%로 나타났으며, 국내 자생종인 등대시호, 개시호, 섬 시호는 각각 97.99%, 98.42%와 97.99%로 높게 나타났다.

이러한 결과는 Xie 등⁷⁾이 보고한 시호류의 rDNA-ITS 염기서열을 종간 유사도와 비교하였을 경우 대부분의 종 에서 종간 유사도가 매우 높게 나타난 것과 비슷한 수준 의 결과를 얻었다.

6종 1변종 21개 시료에 대한 전체 염기서열을 ClustalW multiple alignment를 통해 ITS1, 5.8S rRNA gene 및 ITS2 부위를 포함하는 염기서열 비교 결과, 종내 시료

Fig. 1. A Diagram and PCR products of the ribosomal RNA gene and internal transcribed spacer (rDNA-ITS) region of Bupleurum species

(A) A diagram of rDNA-ITS region and the position of primers used for PCR amplification. (B) PCR products of Bupleurum species by primer ITS1 and ITS4. M represent a 1kb plus DNA ladder and corresponding MW were indicated by arrow.

Fig. 2. Comparison of ribosomal RNA gene and internal transcribed spacer (rDNA-ITS) sequences among Bupleurum species The boxes indicate ITS1 and ITS2 primer sequences. A single line, dotted line, and double line indicates the ITS1, 5.8S rRNA gene, and ITS2 region, respectively. Dots (․) indicate the identical sequences with B. falcatum and dashes (-) represent gaps that were introduced to maximize alignment.

Table 2. Sequence Characteristics of the rDNA-ITS Region of Bupleurum Species

Species Length of PCR Product(bp)

G+C Content (%)

ITS 1 5.8S ITS 2 Total

B. falcatum 215 163 227 694 58.36

B. falcatum-SamDo 215 163 227 694 58.36

B. chinense 215 163 227 694 58.36-58.65

B. scorzonerifolium 216 163 226 694 57.78

B. euphorbioides 217 163 227 696 58.33

B. longiradiatum 216 163 227 695 57.70-57.84

B. latissimum 217 163 227 696 57.47

Table 3. Summary of Marker Nucleotides from Comparison of the rDNA-ITS Sequence among 21 Samples of 7 Bupleurum Species

Seq. No. 35 46 47 48 49 72 75 89 93 96 101 103 106 107 117 118 119 121 127 129 129 133

B. falcatum A A A G A G G T C C T A G C T A G C G G C T

B. falcatum-SamDo · · · ·

B. chinense · · · C · · C · · · ·

B. scorzonerifolium G C G A G T A C T · G G A T C G · · T · · C

B. euphorbioides · · · C A · · · ·

B. longiradiatum · · · - T ·

B. latissimum · · · A · T · · · ·

Seq. No. 136 137 142 155 156 157 170 182 186 187 188 197 204 209 212 217 218 219 220 227 247

B. falcatum T T C A C C G G C C G C T G C T G - - T A

B. falcatum-SamDo · · · - - · ·

B. chinense · · · - - · ·

B. scorzonerifolium C C T T A T A · T T · T C T A · · A - G C

B. euphorbioides · · · C · · C · A G · ·

B. longiradiatum · · · A A G · ·

B. latissimum · · · T · · A · · · A G · ·

Seq. No. 373 381 407 411 415 416 428 437 438 439 440 446 447 452 463 489 491 498 512 514 516

B. falcatum C C T T A A A A G C A T A C T C T T C

B. falcatum-SamDo · · · ·

B. chinense · · · A A · · · G · · · A ·

B. scorzonerifolium · T · A A A T G T G · T G A · T · · · · T

B. euphorbioides · · · A · · · G · G · C · · · ·

B. longiradiatum T · · A · · · T · G · · · C · ·

B. latissimum · · T A · · · G · · · · T · · ·

Seq No. 526 527 537 542 547 549 554 555 556 560 568 575 590 597 598 599 601 620 625 627 634

B. falcatum A A T G G A G C A C C T C A A C G C T C G

B. falcatum-SamDo · · · ·

B. chinense · · · · T G · · · · A · T · · A T · · · ·

B. scorzonerifolium T G · · · · T A C · · C · G G A · - · · A

B. euphorbioides · · · T · · · A · · T · · · ·

B. longiradiatum · · · T · · · C · ·

B. latissimum · · C · · · T · · · · A · A ·

사이의 염기 변이는 0～4개의 위치에서 발생함을 확인하 였고 ≪대한약전≫ 기원종인 시호나 삼도시호를 기준으 로 종별 변이의 정도는 총 85개의 위치에서 4개의 삽입/

결실(indel, insertion and/or deletion)과 81개의 염기치 환이 발생함을 확인하였다. 이러한 염기변이는 ITS1 부위에서 43개 위치, 5.8S rRNA gene 부위에서 3개 위치, 그리고 ITS2 부위에서 39개 위치에서 발생하였 다. 종별로는 남시호가 2개의 indel과 53개의 치환 (substitution)을 포함하여 가장 많은 총 55개 위치에서 염기의 차이를 보였으며, 북시호와 국내자생종인 등대

시호와 섬시호는 12～14개로 비교적 적은 차이를 보였 고 개시호의 경우는 11개로 가장 적은 차이를 보였다 (Fig. 2).

2. 종 감별용 marker nucleotide 분석

시호류의 rDNA-ITS 부위 염기서열의 삽입/결실이나 치환을 종별로 분석한 결과, 종내 변이는 특이성을 보이 지 않는 반면 종별 변이는 특정 위치에서 동일한 염기로 치환되는 종 특이성이 있는 것으로 나타났다(Fig. 2). 시

호류 rDNA-ITS 전체 염기서열의 종별 변이 특이성을 분석한 결과, Table 3에 나타낸 바와 같이 시호와 삼도시 호는 2개 위치(411, 447번 염기), 북시호는 6개 위치(101, 514, 547, 549, 568, 601번 염기), 등대시호는 8개 위치 (119, 121, 136, 217, 463, 491, 542, 560번 염기), 개시호는 7개 위치(128, 129, 218, 373, 440, 512, 625번 염기), 그리 고 섬시호는 9개 위치(89, 96, 182, 188, 407, 498, 537, 620, 627번 염기)에서 종 감별이 가능한 marker nucleotide 가 존재함을 확인하였다. 남시호의 경우는 가장 많은 총 49개 위치에서 marker nucleotide가 존재함을 확인하였다 (Table 3). 따라서 이러한 rDNA-ITS 부위 염기서열의 종 특이적 염기 차이는 Yang 등¹²⁾이 제시한 대황류 종 감별용 matK 유전자와 18S rRNA 유전자 염기서열 분 석을 통해 개발한 유전자 마커처럼 국내에 자생하는 시 호류의 동정이나 유통되는 한약재의 진위를 감별을 각 시료의 rDNA-ITS 부위 증폭과 염기서열 분석을 통해서

간편하고 객관적으로 수행 할 수 있는 유전자 마커로 유 용할 것으로 판단된다. 하지만 보다 빠르고 간편한 시호 류 감별을 위해서는 황기와 몽고황기의 감별을 위한 SCAR 마커¹⁹⁾나 multiplex-PCR 기법을 적용한 전호류 감별용 다품종동시감별 SCAR 마커²⁰⁾와 같이 PCR을 이 용한 유전자 마커의 개발이 있어야 할 것으로 사료된다.

3. 시호류 종간 유연관계 분석

우리나라 약전 및 중국약전에서 규정하고 있는 시호 (柴胡)의 기원종과 국내 자생 시호류의 종내 유전다양성 과 종간 유전 유연관계를 확인하기 위하여 시호류 6종 1 변종 21 시료의 전체 rDNA-ITS 염기서열을 이용하여 Phylogenetic tree를 작성하고 이들의 유연관계를 분석하 였다. ClustalW법을 이용한 유연관계분석에서 ≪대한약 전≫의 시호(柴胡) 기원종인 시호와 그 변종인 삼도시호

A

B

Fig. 3. Phylogenetic relationship of Bupleurum species

(A) Phylogenetic tree assembled by the ClustalW method. (B) Phylogenetic tree assembled by the Jotun Hein method.

는 동일한 집단으로 분류되었으며, ≪중국약전≫의 기원 종인 북시호와 남시호는 유전적으로 가장 거리가 먼 집 단으로 분류되었다. 또한 등대시호와 개시호가 유전적으 로 가까운 종으로 나타났으며, 우리나라 울릉도 특산종으 로 알려진 섬시호는 북시호나 남시호보다 국내 자생종인 시호, 삼도시호, 등대시호, 개시호에 가까운 유전 유연관 계를 갖는 것으로 분류 되었으며 이들 중 등대시호와 개 시호가 유전적으로 가까운 것으로 나타났다(Fig. 3A). 하 지만 Jotun Hein법을 이용한 유연관계분석 결과에서는 국내 자생종 섬시호가 등대시호와 유전적으로 가장 가까 운 것으로 나타났으며 ClustalW법 결과와 마찬가지로 시 호, 삼도시호, 개시호와 가까운 유전 유연관계를 보이며

≪중국약전≫의 기원종인 북시호와 남시호와 구분되었다.

이상의 결과는 비록 각각의 연구에서 분석대상 종의 범 위가 다르기는 하지만 김 등³⁾의 외부형태 연구, 최 등¹⁷⁾ 의 rDNA-ITS 염기서열 변이 및 RFLP분석에서 개시호 와 등대시호가 가까운 유연관계를 가진다는 보고와 안 등¹⁶⁾의 한국산 시호속의 화분형태 및 외분형태 연구 그 리고 최 등²¹⁾의 해부학적 연구 결과에서 섬시호가 개시 호와 등대시호에 가장 가까운 유연관계를 가지며 이들 두 종으로부터 분화했을 것으로 추정한 결과를 종합하면 한국 특산종 섬시호는 개시호와 등대시호와 깊은 유연관 계를 가지고 있음을 다시 한번 확인 할 수 있었다. 하지 만 개시호와 등대시호 중 어느 종에서 종분화가 이루어 졌는지에 대한 보다 정확한 섬시호의 기원을 밝히기 위 해서는 러시아 지역은 물론 동아시아 지역의 다양한 시 호속 식물종을 대상으로 한 RAPD법이나 AFLP법 등의 전체 게놈분석 수준에서의 분자생물학적 연구가 이루어 져야 할 것으로 판단된다.

결 론

본 연구는 혼․오용 가능성이 있는 한약재 시호의 유 전자 감별법을 개발하고 분자계통분류를 통해 우리나라 특산종인 섬시호의 유전 유연관계를 알아보기 위해 ≪대 한약전≫과 ≪중국약전≫의 시호 기원종과 국내에 자생 하고 있는 시호류의 rDNA-ITS 부위 염기서열 분석하여 다음과 같은 결론을 얻을 수 있었다.

1. 6종 1변종 시호류 rDNA-ITS 염기서열 분석 결과, 694 bp ～ 696 bp의 염기로 구성되어 있었으며, 57.47～58.65%의 G+C를 함유하고 있었다. 또한 이 들의 종내 유사도와 종간 유사도는 각각 99.4～

100%와 92.8～97.99%로 높게 나타났으며, 종간 염 기서열을 비교한 결과, 4개 위치에서 염기서열의 삽 입/결실과 81개 위치에서 염기치환이 발생하였다.

2. 시호류 종간 염기서열 비교 결과, 시호와 삼도시호 는 2개 위치, 북시호는 6개 위치, 등대시호는 8개 위치, 개시호는 7개 위치, 섬시호는 9개 위치, 그리

고 남시호는 49개 위치에서 종 감별이 가능한 marker nucleotide가 존재함을 확인하였으며, 411번 과 447번 위치의 2개 염기와 89, 101, 415 및 599 번 위치의 4개 염기는 나머지 3종으로부터 ≪대한 약전≫과 ≪중국약전≫에 등재된 각각의 기원종을 구별하는 marker nucleotide임을 알 수 있었다.

3. rDNA-ITS 염기서열을 이용한 섬시호의 분자계통 유연관계를 분석한 결과, 이전의 외부형태, 화분 형 태 및 염색체 수와 핵형분석을 통한 종간 유연관계 와 유사하게 섬시호는 개시호와 등대시호와 진화적 으로 가깝다는 것을 확인할 수 있었다.

감사의 글

본 연구는 한국한의학연구원 한의본초활용기반구축사업 (L08020)의 지원에 의해 수행되었으며, 이에 감사드린다.

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