47(10), 957～965(2018) https://doi.org/10.3746/jkfn.2018.47.10.957
3T3-L1 지방세포 및 제2형 당뇨 마우스 모델에서 건지황 열수 추출물의 항당뇨 효능 연구
조 란1․민정란1․정상희1,2
1바이오의과학연구소
2호서대학교 임상병리학과
Anti-Diabetic Effects of Water Extracts of Rehmannia glutinosa Libosch Root in 3T3-L1 Adipocytes and C57BL/KsJ-db/db Mice
Ran Jo1, Jeong-Ran Min1, and Sang-Hee Jeong1,2
1Biomedical Science Research Institute
2Department of Biomedical Laboratory Science, Hoseo University
ABSTRACT Type 2 diabetes mellitus is characterized by a clinical disorder of sugar and fat metabolism caused by cellular insulin resistance. In our study, the anti-diabetic effects of water extract of Rehmannia glutinosa Libosch (RG) root (40, 200, 1,000 μg/mL) were investigated in mature 3T3-L1 adipocytes. RG root was found to increase glucose uptake under insulin (1 μM)-stimulation conditions but had no effects on glucose uptake without insulin in 3T3-L1 adipocytes. Additionally, the anti-diabetic effects of RG root were studied in a diabetes mellitus animal model (C57BL/KsJ-db/db) by oral ingestion of RG for 4 weeks (50, 500 mg/kg bw/d). During the experimental period, food intake, body weight, and fasting blood glucose level were measured every week. At the end of the treatment, oral glucose tolerance, blood glucose level, HbA1c, plasma insulin level, and blood profile parameters, including AST, ALT, TG, total and HDL-cholesterol levels, were measured. Treatment with RG root resulted in a lower blood glucose level, HbA1c, total cholesterol, ALT, oral glucose tolerance, and serum insulin levels. The mRNA expression of glucoki- nase (GCK) and solute carrier family 2 (SLC2A2) was significantly increased in liver tissue were reduced by water extract of RG. These results explains the anti-type 2 diabetic effects of water extract of RG.
Key words: Rehmannia glutinosa Libosch root, type 2 diabetes, C57BL/KsJ-db/db, glucose uptake
Received 11 January 2018; Accepted 21 September 2018 Corresponding author: Sang-Hee Jeong, Biomedical Science Research Institute and Department of Biomedical Laboratory Science, Hoseo University, Asan, Chungnam 31499, Korea
E-mail: [email protected], Phone: +82-41-540-9675
서 론
당뇨병은 전 세계적으로 확대되고 있는 건강 문제로 비만 및 각종 성인병과 밀접한 관련이 있다. 당뇨병에서 고혈당이 조절되지 못하고 만성화될 경우 고지혈증, 고혈압 및 동맥경 화 등의 심혈관성 장애를 비롯한 여러 합병증이 초래되며 지속적인 고혈당으로 인해 신장 기능의 저하, 망막층 출혈로 인한 시력 저하, 족부 궤양, 말초신경병증 등의 발병률도 높 아진다(1). 당뇨병은 체내 인슐린 부족으로 유발된 제1형 당뇨병과 인슐린저항성(insulin resistance)을 보이는 제2 형 당뇨병으로 나눌 수 있다. 전체 당뇨병의 90%에 해당하 는 제2형 당뇨병은 간, 지방조직, 근육에서 인슐린에 대한 반응성 저하로 인해 근육 등 각종 조직으로 흡수되는 포도당 양이 감소하여 식후 고혈당이 유발되며, 이후 간에서의 포도
당 유출(hepatic glucose output, HGO)이 증가하여 공복 혈당치도 상승하여 소변으로 포도당 배출이 증가하는 것이 특징이다(2,3).
혈당의 증가는 glucokinase(GCK) 효소의 활성 감소와 밀접하게 관련되는데 이 효소는 간세포 내에서 포도당 대사 의 첫 번째 반응인 glucose-6-phosphate로의 인산화 반응 을 촉매하여 세포 내 glucose 이용을 증가시키는 역할을 하며, GCK의 활성 감소는 세포로의 당 유입 차단을 유발하 게 된다(4). 또한 혈액으로부터 간세포와 췌장 베타 세포로 포도당을 수송하는 역할을 수행하는 glucose sensor인 glucose transporter 2(GLUT2, coding by solute carrier family 2, SLC2A2)도 혈당 조절에 매우 중요하다. GCK 및 SLC2A2는 당에 대해 높은 기질 특이성을 갖고 있어 혈당의 변화에 따라 포도당의 세포 내 유입속도 및 당인산화 속도를 적절히 변화시킨다(5).
현재 임상에서 사용되고 있는 경구용 혈당강하제는 탄수 화물의 소화 흡수를 제한하는 혈당 조절제로서 α-glucosi- dase 억제제인 acarbose와 인슐린 분비를 촉진하는 sulfo- nylurea, 간에서 포도당 생성을 감소시키는 metformin,
PPAR-γ agonist로서 인슐린 민감성을 증가시키는 thiazo- lidinedione 등의 약물이 있다(6). 그러나 이들 약물은 구토 나 복부 팽만감 등 소화기의 부작용을 유발하며 이러한 부작 용으로 인해 당뇨치료를 중단하는 경우도 많다(7). 따라서 이와 같은 약물 부작용을 최소화하고 일상적으로 복용해도 안전하며 인슐린저항성을 감소시키거나 혈당 수준을 조절 하는 천연자원 식품 소재 개발이 절실하게 요구된다.
한약재는 전통의학의 치료수단이면서 기능성 식품소재로 서도 그 가치가 높다. 우리나라의 대표적인 한의서인 동의보 감, 방약합편에서는 당뇨병과 관련된 주치증상으로 “소갈”
이 명시되어 있으며 이러한 증상을 치료하는 한약재로 지황 (Rehmannia glutinosa Libosch, RG)이 소개되고 있다. 지 황은 현삼과에 속하는 다년생 초목으로 특성은 시원(凉)하 고 맛은 쓰(苦)며, 뿌리와 뿌리줄기를 약으로 사용한다(8,9).
가공 방법에 따라 채취 후 파지에 저장한 생지황, 외피를 죽도로 벗겨서 태양으로 자연 건조시킨 건지황, 생지황을 찌고 말리기를 9회 반복(구증구포)한 숙지황 등 3가지 유형 이 알려져 있다(10). 지황은 보혈, 이뇨, 당뇨병, 고혈압 등의 질환에 효과가 있으며, 특히 빈혈, 하혈 또는 허약병, 결핵에 좋은 것으로 동의보감에 수록되어 있다. 지황의 주성분은 catalpol, phytosterol류, 당류, iridoid glycosides, chrys- oeriol, luteolin 등으로 알려져 있으며(11,12), 생지황과 속 지황 분말에서 지황의 지표 성분으로 알려진 catalpol은 생 지황 분말에서 144.9 mg/mL, 숙지황 분말에서 47.2 mg/
mL로 보고되어 있다(13,14). 수십 년간 이루어진 지황의 약리학적 기능성 연구결과 혈관계 강화, 면역증강, 내분비계 개선, 심혈관계 기능 보호 등 신경보호 효과와 항종양, 항노 화 효과가 있는 것으로 보고되어 있으며(12), 국내에서 건강 기능식품소재의 부원료로 허가되어 있어 식품가공 시 활용 도가 높은 것으로 추정된다. 그러나 제2형 당뇨병 in vivo 질환모델 등을 통하여 당질분해효소 발현 조절 효과 및 혈당 강하 효능에 대한 직접적인 연구는 상대적으로 부족한 실정 이다.
본 연구는 인슐린 민감 물질 탐색 시 널리 사용되고 있는 3T3-L1 지방전구세포에서 국내산 건지황 열수 추출물의 당대사 개선효과와 glucose uptake 효과를 조사하고 제2형 당뇨병 동물 모델에 건지황 열수 추출물을 투여하여 혈당 변화, 간 기능 및 당대사 관련 효소의 변화를 관찰함으로써 건지황 열수 추출물의 항당뇨에 대한 영향을 조사하여 기능 성 소재로서의 가능성을 확인하고자 하였다.
재료 및 방법
건지황 열수 추출물의 제조
본 연구에서 사용한 건지황은 열수 추출하여 제조하였다.
즉 건조된 지황뿌리를 분쇄하여 분쇄시료 20 g에 증류수 200 mL를 넣고 65°C 항온수조에서 24시간 동안 진탕혼합 한 후 원심분리 하여 상등액을 얻었다. 이를 여과지(No.42,
Whatman International Ltd., Delhi, UK)에 감압여과 후 회전진공농축기(EYELA CCA-110, Tokyo Rikakikai Co., Tokyo, Japan)로 4°C에서 농축한 다음 이를 3차 멸균 증류 수로 재용해하여 동결건조기(FD8508, Ilshin, Ilsan, Korea) 를 이용하여 -70°C에서 건조한 후 시료를 냉동보관하면서 적당한 농도로 희석하여 사용하였다.
세포배양
세포주는 한국세포주은행(Seoul, Korea)으로부터 분양 받은 3T3-L1 지방전구세포(KCLB No.10092.1)를 사용하 였으며, 세포를 10% 소태아 혈청(FBS, Gibco BRL, Carls- bad, CA, USA), 1% penicillin-streptomycin(Gibco BRL) 이 함유된 Dulbecco’s modified Eagle media(DMEM, Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)에서 배양하였다. 세 포배양 3일 간격으로 인산완충액 0.01 M(PBS, Gibco BRL) 을 사용하여 세척한 후 75 mL 배양 플라스크당 1 mL의 0.25% trypsin-EDTA(Gibco BRL)를 넣고 실온에서 3분간 처리하여 세포를 탈착하여 원심분리에 의해 세포를 수거한 후 10% FBS가 첨가된 DMEM 배양액 15 mL에 부유시킨 37°C, 5% CO2 조건의 배양기(Sanyo, Osaka, Japan)에서 계대배양 하였다.
3T3-L1 지방세포의 분화유도 및 지방분화세포로의 포도 당흡수능 측정
3T3-L1 전구지방세포를 계대배양과 동일한 방법으로 탈착시켜 1×106 cell/mL의 농도로 96-well plate에 100 μL/well로 분주한 다음 완전한 confluent 상태까지 배양하 였으며, 이로부터 2일 후에 분화유도 물질인 0.25 M dex- amethasone(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA), 인슐린 10 μg/mL 및 0.5 μM 3-isobutyl-1-methylxan- thine(IBMX, Sigma-Aldrich Co.)을 함유한 분화유도배지 로 교환하여 2일간 배양하고, 이후 2일마다 10 μg/mL의 인슐린이 포함된 상기배지로 교환하면서 12일간 분화를 유 도한 후 포도당 흡수시험을 실시하였다.
포도당 흡수시험을 하기 위하여 분화된 지방세포를 se- rum free DMEM media로 14시간 처리하여 starvation 시 킨 후 Krebs-Ringer-Phosphate-HEPES(KRPH) buffer (20 mM HEPES, 5 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4, 136 mM NaCl, 4.7 mM KCl, pH 7.4) 용액으로 3번 washing 하였다 (15). 여기에 KRPH buffer를 넣고 37°C에서 30분간 배양 하고 건지황 열수 추출물 40, 200 및 1,000 μg/mL를 인슐린 1 μM과 함께 또는 인슐린을 함유하지 않은 serum free DMEM media에 복합 또는 단독 처리하여 30분간 반응시켰 다. 포도당 흡수는 Glucose Uptake Assay Kit(ab136955, Abcam, Cambridge, UK)을 이용하여 실행하였다.
실험동물 및 시험물질 투여
본 연구에 사용된 제2형 당뇨동물모델은 8주령 수컷 C57
BL/KsJ-db/db 마우스(Harlan Laboratories, Inc., Houston, TX, USA)로서 온도 23±2°C, 습도 55±10%, 명암주기 12 시간(08:00~20:00) 조건이 자동 설정된 동물사육실에서 2 주일간 순화시킨 후 실험에 사용하였다. 본 동물실험은 호서 대학교 동물실험윤리위원회의 승인을 받은 후(승인번호:
THRC-16-36) 실험동물 관리 및 이에 관한 지침(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, NRC)에 따라 진행하였다. 투여개시 전의 체중을 기준으로 실험군당 5마리씩 정상군(C57BL/KsJ-db/+ mice, Normal Control, NC), 당뇨대조군(C57BL/KsJ-db/db mice,Diabetic Con- trol, DC), pioglitazone 20 mg/kg bw/d를 투여한 양성대조 군(Pio), metformin 300 mg/kg bw/d를 투여한 양성대조군 (Met), 50 mg/kg bw/d의 건지황 열수 추출물 투여군(RG 50), 500 mg/kg bw/d의 건지황 열수 추출물 투여군(RG 500) 등 총 6개군으로 나누어 매일 9~10시 사이에 경구투 여용 존대를 이용하여 4주간 각각의 물질을 투여하였다. 매 일 실험동물의 건강상태 및 일반 임상증상을 관찰하였으며 매주 2회 체중 변화, 사료 및 음수 섭취량을 측정 및 기록하 였다.
경구 내당능 검사(oral glucose tolerance test, OGTT) 각 실험군의 포도당 내성능을 평가하기 위하여 약물 투여 3주째에 16시간 절식시킨 후 50% glucose 용액을 체중 kg 당 glucose 0.01 g이 되도록 경구 투여하였다. 포도당 투여 전(16시간 공복혈당), 포도당 투여 후 30, 60, 90 및 120분 에 꼬리 정맥에서 혈액을 채취하여 혈당측정기(G doctor AGM-4000, Allmedicus, Inc., Suwon, Korea)를 이용하 여 혈당 변화를 측정하였다. 경구 내당능 검사에 따른 혈당 상승폭 면적(area under the curve, AUC)은 trapezoidal formula에 의해 계산하였다.
공복혈당, 당화혈색소 및 인슐린 함량 측정
시험물질을 투여하면서 매주 1회 12시간 절식시킨 후 꼬 리 정맥에서 채혈하여 혈당측정기(G doctor AGM-4000) 를 이용하여 공복혈당을 측정하였다. 또한 실험 종료 시점인 부검 시 채취된 혈청 샘플에서 인슐린 검사용 ELISA kit (MIoBS, Tokyo, Japan)을 사용하여 혈중 인슐린의 농도를 측정하였다. 부검 시 채취된 혈청 샘플에서 혈당 관련 기능 성 지표로 이용되는 당화혈색소의 함량을 Mouse glycated hemoglobin A1c(HbA1c) ELISA Kit(Mybiosource, San Diego, CA, USA)으로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
또한 인슐린저항성의 지표인 HOMA-IR(Homeostasis Model Assessment of insulin resistance)을 산출하였다(16).
HOMA-IR＝[Fasting insulin (μU/mL)×Fasting plasma glucose (mmol/L)]/22.5
혈중 지질 및 AST, ALT 측정
혈중 지질 함량 분석을 위한 혈청은 인슐린 함량 측정 시
사용한 혈청과 동일한 조건으로 준비하였으며, triglycerides 등 지질 함량 및 효소활성도를 Triglyceride Assay Quan- tification assay kit(ab65336, Abcam), HDL and LDL/
VLDL cholesterol assay kit(ab65390, Abcam), aspar- tate aminotransferase(AST) activity assay kit(ab 105135, Abcam)과 alanine transferase(ALT) activity assay kit (ab105134, Abcam)을 사용하여 450 nm에서 흡광도(Hidex Sense, Turku, Finland)를 측정하였다.
혈청 및 간 조직 채취
약물투여 최종 종료 전에 16시간 동안 절식시키고 체중과 공복 혈당을 측정하였으며, 이후 CO2로 마취시켜 복강을 열 어 복대동맥에서 혈액을 채취하여 3,000×g에서 20분 원심 분리 하여 혈청을 분리한 후, -80°C에서 냉동 보관하여 생 화학적 분석에 사용하였다. 또한 간 조직 일부(0.2 g)를 채취 한 후 4°C에서 완전히 분쇄한 다음 -80°C에서 냉동 보관하 여 유전자 발현분석에 사용하였다.
Total RNA 추출 및 cDNA 합성
각 시험물질을 4주간 경구 투여한 후 부검하여 채취한 간 조직을 PBS(pH 7.4) 용액으로 세척한 후, RNeasy Mini Kit(Qiagen, Hilden, Germany)을 이용하여 RNA를 추출하 였다. 각각의 투여군의 개체에서 얻어진 2 μg의 RNA는 cDNA synthesis kit(BIORED, Erkulles, CA, USA)을 이용해 역 전사하여 first strand cDNA를 얻었다.
Real-time PCR을 이용한 GCK 및 SLC2A2 mRNA 발현 분석
RT-PCR은 QPCR Master Mix(2X GreenStar, Bion- eer, Daejon, Korea)를 이용하여 최종 반응 용량을 20 μL로 하여 QPCR System(Mx3000P, Agilent, Santa Clara, CA, USA)에서 SYBR Premix QPCR Master Mix(BioLabs, MA, USA)를 이용하여 진행하였다. PCR 반응의 특이도를 확인하기 위해서 증폭할 때마다 melting curve 분석을 수행 하였고 β-actin을 기준으로 2-ΔCt로 계산하였으며 유전자의 발현량은 대조군을 1.0으로 간주하여 상대적인 값을 측정하 였다. 본 실험에서 사용한 PCR primer는 다음과 같다: GCK Forward: 5’-GCACTGCTGAGATGCTCTTC-3’, Rev- erse: 5’-TGTTCCCTTCTGCTCCTGAG-3’; SLC 2A2 Forward: 5’-ACCAATTCCAGCTACCGACA-3’, Reverse:
5’-GTTTACAGCGCCAACTCCAA-3’; β-actin Forward:
5’-AGAGCTACGAGCTGCCTGAC-3’, Reverse: 5’-AG CACTGTGTTGGCGTACAG-3’.
통계처리
본 실험은 SPSS(Statistical Package for Social Sci- ence, version 23.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 통계프 로그램을 사용하였다. 각 실험군의 측정 항목의 결과는 평균
a
c a
c a
c b
c c c
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
2-Deoxyglucose uptake . (% fold control) .
Insulin (1 μM) Pioglitazone (2 μM) RG (40 μg/mL) RG (200 μg/mL) RG (1,000 μg/mL)
- + - + - + - + - + - - + + - - - - - - - - - - + + - - - - - - - + + - - - - - - - - + +
Fig. 1. Effect of Rehmannia glutinosa Libosch (RG) root water extracts or pioglitazone on glucose uptake in 3T3-L1 adipocytes in the absence (−) or presence (+) of insulin. Serum-starved 3T3-L1 adipocytes were cultured in 96-well plate and treated with 40, 200, and 1,000 μg/mL of RG water extracts or pioglita- zone (2 μM) with or without insulin (1 μM) for 30 min and followed by measurement of 2-deoxyglucose-6-phosphate (2- DG6P) level in cells. Results expressed as mean±SD (n=3). Means with different letters (a-c) are significantly different among groups by ANOVA followed by Duncan’s multiple range test at P<
0.05.
Table 1. Changes of food intake, water intake and body weight gains of each group
Parameters1) NC DC Pio Met RG50 RG500
Food intake (g/d) Water intake (g/d)
Body weight gain for 4 weeks (g)
3.01±0.41a2) 6.37±0.88a 8.05±3.35a
6.27±1.89b 24.12±2.70b 16.25±3.90b
6.43±0.69b 18.26±3.65b 13.67±2.21b
5.18±0.46b 16.32±1.21b 14.43±2.72b
6.11±1.93b 20.45±5.48b 13.00±4.37b
5.55±1.62b 20.56±5.05b 11.88±4.79b
1)NC: normal mice (C57BL/KsJ-db/+) untreated; DC: diabetes mice (C57BL/KsJ-db/db) untreated; Pio: diabetic mice fed pioglitazone (20 mg/kg bw/d); Met: diabetic mice fed with metformin (300 mg/kg bw/d); RG50 and RG500 diabetic mice fed RG water extracts 50 mg/kg bw/d and 500 mg/kg bw/d, respectively.
2)Mean±SD (n=5). Means with different letters (a,b) within a row are significantly different among groups by ANOVA followed by Duncan’s multiple range test at P<0.05.
값±표준편차(mean±SD)로 표시하였으며, 실험군 간 평균 차이를 one-way ANOVA로 확인한 후 그룹 간의 통계적 유의성을 Student’s t-test와 Duncan’s multiple range test를 이용하여 실시하였다. 실험군 간의 유의성을 P<0.05 수준에서 검정하였다.
결과 및 고찰
3T3-L1 지방세포 내 포도당 흡수능 측정
3T3-L1 지방세포에 건지황 열수 추출물을 처리하여 포 도당 흡수능을 측정한 결과는 Fig. 1에 제시한 바와 같다.
건지황 열수 추출물을 인슐린 없이 단독으로 처리하였을 경 우에는 포도당 흡수능이 상승하지 않았으며 건지황 열수 추 출물을 1 μM 인슐린과 병용 처리하였을 때 인슐린을 추가하 지 않는 대조군(91.81±8.99%)에 비하여 포도당 흡수능이 각각 159.48±9.05%(pioglitazone), 187.65±6.52%(RG 40 μg/mL), 193.06±3.82%(RG 200 μg/mL) 및 179.91±
3.81%(RG 1,000 μg/mL)로 증가하였다. Pioglitazone은
PPAR-γ 작용제로 작동하며 말초조직의 포도당 대사를 증 가시키고 간에서의 지질대사를 촉진시키며 지방세포 분화 를 활성화시킴으로써 인슐린저항성을 낮추는 약물로 개발 되었으나 심혈관계 부작용을 증가시키는 문제점을 갖는 약 물이다(15,17). 본 연구에서는 RG40, 200, 1,000 μg/mL 및 pioglitazone(2 μM)은 높은 포도당 흡수능이 관찰되었으 며 이는 인슐린에 대한 감수성을 증가시켜 포도당 흡수능을 향상시킴을 통해 혈당 조절 효과가 있는 것으로 기대되었다.
사료섭취량, 음수섭취량 및 체중 변화
제2형 당뇨동물모델인 C57BL/KsJ-db/db 마우스에 건 지황 열수 추출물을 4주간 경구 투여하면서 실험기간 동안 실험동물의 음수량, 식이섭취량 및 체중 변화를 관찰한 결과 Table 1과 같았다. 당뇨대조군(DC)은 정상대조군(NC)에 비하여 사료 섭취량은 약 2배, 음수량은 약 4배, 증체량은 약 2배 증가하였으며, 음수섭취량은 현저히 증가하는 것을 볼 수 있었다. RG군에서는 평균 음수량은 DC군에 비하여 감소하는 경향이었다. 본 연구에서는 건지황 섭취에 의한 당뇨증상인 음수량, 음수횟수 증가 등이 완화되는 경향이 있는 것으로 사료되었다.
경구 내당능 변화
경구 내당능 검사는 체내 포도당 이용과 인슐린 분비능에 대한 지표로서(18) 본 연구에서 각각의 물질을 3주간 투여 후 포도당(0.01 g/kg bw)을 투여하여 경시별 혈장의 당 함 량을 분석한 결과(Fig. 2A)에서 제시하였다. 포도당 투여 60분 후 RG50군 및 양성대조군(Met 또는 Pio) 혈당이 감소 하였다. 120분 후에는 RG50군과 RG500군의 혈당이 각각 568±37 mg/dL와 608±41 mg/dL였으며 DC군보다는 혈 당이 감소하는 것으로 나타났다. Met군의 혈당은 120분에 서 452±29 mg/dL로 떨어져 가장 우수한 내당능 효과를 보였다. 혈당 상승폭을 AUC로 계산하였을 때 DC군에 비하 여 Met군과 RG50군은 각각 82.23±2.4% 및 93.12±1.7%
로 RG군에서 단시간 내 혈당을 조절하는 효과가 현저히 나 타나지 않음을 알 수 있었다(Fig. 2B).
공복혈당 변화
당뇨쥐에게 4주간 RG를 투여하는 동안 공복혈당 변화는 Fig. 3A에 제시하였다. DC군의 혈당은 4주 동안 지속해서
b
d
e ab a
c b
d b
b
c
a a
c
0 200 400 600 800 1000 1200
0 30 60 120
Time (min)
Blood glucose level (mg/dL) .
NC DC Pio Met RG50 RG500
A
a b c b a
d
0 100 200 300 400 500
NC DC Pio Met RG50 RG500
AUC of blood glucose 120 min . (% of normal control) .
B
Fig. 2. The effect of the oral administration of RG water extracts on the glucose tolerance in C57BL/KsJ-db/db mice. (A) Blood glucose level of each group during oral glucose tolerance test (OGTT). (B) AUCOGTT: the area under curve of glucose (mg/d L･min). Results are from five animals per each group and ex- pressed as mean±SD. Means with different letters (a-e) are sig- nificantly different among groups by ANOVA followed by Duncan’s multiple range test at P<0.05.
a a a
b b a
c c
a a
b b
b b
a
350 400 450 500 550 600
Fasting blood glucose . (mg/dL) . DC Pio Met RG50 RG500
A
a a
a aa
b b
d d
50 150
0 week 1 week 2 week 3week3 week 4 week
⎯○⎯NC
A
b b
c c a
d
0 1 2 3 4
NC DC pio met RG50 RG500
HbA1c (ng/mL) .
B
Pio
Fig. 3. Changes of the fasting glucose levels (A) and serum HbA1c (B) by RG water extract treatment pioglitazone or met- formin orally for 4 weeks. Results are from five animals per each group and expressed as mean±SD. Means with different letters (a-d) are significantly different among groups by ANOVA fol- lowed by Duncan’s multiple range test at P<0.05.
높게 유지되었으나 RG 투여군에서는 3주째부터 당뇨병대 조군에 비해 감소하기 시작하여 투여 4주째에는 RG50 및 RG500군 혈당은 각각 452±16 mg/mL 및 438±19 mg/mL 로 혈당이 유의하게 감소하였다. 간에서 포도당 생성을 감소 시키는 2형 당뇨 치료약물인 metformin을 투여한 Met군에 서는 투여 3주째부터 DC군에 비하여 감소하였으며 4주째에 는 혈당이 373±9 mg/mL로 뚜렷한 혈당 저하 효과가 나타 났다. 공복 혈당과 간의 포도당 대사의 개선에 의한 항고혈 당 작용을 나타내는 지황의 기능성 주성분은 catalpol, phy- tosterol류, 다당류라고 보고된 바 있으며. Ren 등(19)은 지 황 열수 추출물을 급여한 Nrf-2 유발 당뇨질환 생쥐에서 인슐린 민감도가 증가하고 인슐린저항성을 감소시켜 혈중 포도당 농도를 강하시킨다고 보고하였다. 선행 연구에 의하 면 지황의 기능성 성분인 catalpol은 streptozotocin으로 유 발된 당뇨병 쥐에서 췌장의 손상을 감소시키고 장기간 급여 시에는 공복 혈당치가 감소하고 당화혈색소 함량도 감소하 는 것으로 보고되었다(20). Lee 등(21,22)은 C57BL/KsJ- db/db 마우스에서 건지황 열수 추출물을 300 mg/kg bw로 투여 시 혈당감소가 유의적으로 나타났음을 보고한 바 있으 며, 본 연구에서 RG 투여군에서 투여기간에 비례하여 지속
해서 낮아져 혈당 조절능이 기대되는 천연물로 판단되어 단 기간 복용보다는 4주 이상 지속적인 복용 시 혈당 강하효과 가 더 큰 것으로 생각되었다.
당화혈색소 함량 변화
제2형 당뇨병 진행을 나타내는 지표로써 당화혈색소 (HbA1c)는 많이 사용되며 이의 평균 농도가 1% 정도 감소 할 때 심근경색, 뇌졸중 등 합병증 발생률이 14%, 미세혈관 질환 발생 위험이 37% 정도 감소하는 것으로 알려져 있다 (23). 본 연구에서 양성 Pio군과 Met군은 유의한 수준으로 당화혈색소 함량을 감소시켰으며 시험물질 투여 종료 후 혈 청 당화혈색소 함량을 분석한 결과 RG50 및 RG500군에서 각각 2.23±0.19 ng/mL 및 2.22±0.25 ng/mL로 2.95±
0.24 ng/mL인 DC군보다 유의적으로 낮게 측정되었으며, 건지황 열수 추출물을 지속해서 복용 시 혈당조절을 통하여 당뇨 합병증 발생의 위험도 감소시킬 수 있을 것으로 판단된 다(Fig. 3B).
혈청 내 인슐린 함량 및 인슐린저항성 평가
제2형 당뇨병의 병인은 주로 인슐린저항성과 췌장의 베 타세포 기능 저하를 동반한다(24). 정상 상태에서는 인슐린
Table 2. Effects of RG water extract, pioglitazone or metformin on serum total and HDL-cholesterol, TG, AST and ALT level, and HOMR-IR in C57BL/KsJ-db/db mice
Parameters1) NC DC Pio Met RG50 RG500
T-Cho (mg/dL) HDL-Cho (mg/dL) TG (mg/dL) AST (mU/mL) ALT (mU/mL) HOMA-IR
207.01±19.20bc2) 287.25±45.14a 76.99±24.15b 1.35±0.33a 6.21±0.88c 0.71±0.03d
272.89±13.25a 185.53±26.26b 119.74±9.91a 1.90±1.45a 10.66±0.38a 7.53±0.70a
190.13±20.20c 217.78±16.71b 68.14±1.24b 1.13±0.15a 9.38±0.50b 2.83±0.64c
224.25±22.14b 204.65±12.68b 92.93±15.18ab 2.10±1.59a 11.16±1.50ab 5.28±0.09b
215.17±15.39bc 216.69±37.02b 96.47±11.20ab 2.03±0.09a 7.50±1.28b 3.12±0.02c
214.25±18.35bc 222.21±29.07b 106.20±18.28a 1.96±0.23a 7.14±0.75c 2.62±0.28c
1)Groups are the same as in Table 1.
2)Mean±SD (n=5). Means with different letters (a-d) within a row are significantly different among groups by ANOVA followed by Duncan’s multiple range test at P<0.05.
bc b a
bc a
c
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4
NC DC Pio Met RG50 RG500
Plasma Insulin (ng/mL) .
Fig. 4. Changes of the serum insulin levels by RG water extract, pioglitazone or metformin was supplied to mice daily by oral administration for 4 weeks. Results are from five animals per each group and expressed as mean±SD. Means with different letters (a-c) are significantly different among groups by ANOVA followed by Duncan’s multiple range test at P<0.05.
이 증가하면 간에서는 이를 인지하고 당신생을 중지하고 당 분해 과정으로 들어가야 하는데 제2형 당뇨병에서는 인슐린 저항성으로 이러한 작용이 나타나지 않아 이미 높아져 있는 혈당은 더욱 증가하게 된다. 혈당의 증가는 다시 췌장에서 인슐린을 많이 생산하게 하며 상태는 악화되어 베타세포의 기능이 약화된다(25,26). 본 연구에서 혈장 인슐린 함량은 DC군에서는 0.33±0.04 ng/mL였으나, RG50 및 RG500군 에서는 각각 0.16±0.01 ng/mL 및 0.14±0.04 ng/mL로 유 의하게 감소하는 것이 확인되었으며 Pio군의 인슐린 감소 효과와 거의 유사한 정도의 효과를 나타내는 것으로 관찰되 었다. Met군에서는 0.33±0.01 ng/mL로 나타났으나, 유의 적인 차이는 없었다(Fig. 4). 또한, 4주간 투여 후 각 투여군 의 HOMA-IR 수치가 유의하게 감소하는 것을 관찰되었고 Pio군, RG50군 및 RG500은 특히 뚜렷하게 인슐린저항성이 강하되는 것이 확인되었다(Table 2). 따라서 건지황 열수 추출물 투여가 공복혈당을 감소시킴으로써 인슐린 감수성 을 향상시키고 인슐린저항성을 저하시켜 제2형 당뇨병의 원 인이 되는 고인슐린혈증을 개선하는 데 효과를 보여 항당뇨 에 대한 긍정적인 영향을 끼칠 것으로 사료되었다.
혈중 지질 농도 변화
비만은 제2형 당뇨병에서 매우 중요한 위험인자로 작용 하며 특히 복부비만 상태에서는 당뇨병 또는 인슐린저항성 을 촉진하는 매개물질인 유리지방산의 혈중 농도가 높아진 다(27). 지방조직에서 전신 혈액순환으로 유리되는 유리지 방산이 증가하면 말초조직, 근육에서 포도당 이용이 감소하 여 인슐린저항성이 증가하며, 특히 복부비만이 있는 경우 이 과정이 더욱 촉진된다. 또한 제2형 당뇨병은 만성 대사질 환이 합병증으로 나타나 중성지방(TG) 농도 증가와 HDL- 콜레스테롤 농도가 감소하는 특징을 나타낸다(28,29). 췌장 이 고농도의 지방산에 장기간 노출되면 포도당-지방산 사이 클에 의해 지방산 산화가 증가하고 포도당 산화를 감소시켜 췌장 베타세포의 기능 저하가 발생할 수 있으며, 중성지방은 간에 저장된 지질의 축적에 관여하여 제2형 당뇨 환자의 신 진대사 장애를 유발한다(30). 본 연구에서 건지황 열수 추출 물에 의한 이상 지질대사의 개선효과를 조사한 결과는 Table 2에 제시한 바와 같다. RG50군과 RG500군에서는 총 콜레스테롤 함량은 각각 215.17±15.39 mg/dL 및 214.25±18.35 mg/dL로 DC군의 272.89±13.25 mg/dL에 비하여 유의하게 감소하였으며, 이는 기존의 다른 선행연구 와도 유사한 경향을 보였다(31,32). 한편 제2형 당뇨병에서 나타나는 또 다른 혈청 지질 대사 이상으로 HDL-콜레스테 롤 감소가 흔히 나타나는데, HDL-콜레스테롤은 LDL-콜레 스테롤의 생성을 억제하고 혈관에 축적된 콜레스테롤을 감 소시킴으로써 동맥경화의 발생을 억제하는 기능을 한다(33).
본 연구에서 RG50 및 RG500군에서 HDL-콜레스테롤 함량 은 유의한 증가를 보이지 못했지만 DC군(185.53±26.26 mg/dL)에 비하여 높게 나타나는 경향을 보였으며, RG 투여 군은 당뇨대조군에 비하여 혈청 중 중성지방, HDL-콜레스 테롤의 함량이 유의한 차이는 없었지만 개선하는 경향이었 고, 당뇨로 증가된 총 콜레스테롤 함량은 감소시켰다. 따라 서 건지황 열수 추출물은 당뇨로 인하여 발생하는 혈중 지질 이상의 개선을 보여 당뇨의 증상을 완화시키고 합병증인 동 맥경화 등 질환의 위험성을 낮출 수 있을 것으로 기대된다.
간 질환은 당뇨병 진행 정도에 따라 합병증으로 나타나며 간 조직의 괴사에 의한 혈중 AST 및 ALT의 증가가 지표로 이용되고 있다. ALT는 급성 간 손상을 나타내는 민감한 지 표로서 주로 간세포 내에 존재하기 때문에 간, 신장 등 전신
a b b
a
c b
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
NC DC Met Pio RG50 RG500
GCK mRNA relative expression . / β-actin .
A
a b a
b bc c
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0
NC DC Met Pio RG50 RG500
SLC2A2 mRNA relative . expression/ β-actin .
B
Fig. 5. GCK mRNA and SLC2A2 mRNA expression in liver tissues by RG water extract, pioglitazone or metformin was treat- ed to mice by oral administration daily for 4 weeks. (A) Changes of the GCK mRNA expression levels. (B) Changes of the SLC 2A2 mRNA expression levels. Results are from five animals per each group and expressed as mean±SD. Means with different letters (a-c) are significantly different among groups by ANOVA followed by Duncan’s multiple range test at P<0.05.
에 존재하는 AST보다 간질환에 대한 특이도가 높다(34).
건지황 열수 추출물이 당뇨로 인한 간 기능 저하에 대한 개 선 효과가 있는지를 알아보기 위해 혈중 AST 및 ALT 함량 을 조사한 결과 RG50 및 RG500군에서 DC군에 비하여 AST는 차이가 없었으나 ALT는 유의하게 감소하였다. 건지 황 열수 추출물이 천연소재로서 일반 당뇨병 치료 약물보다 간 손상을 억제하는 효과가 있을 수 있으며 당뇨로 인한 간기 능 회복 및 유지에 긍정적인 효과가 있는 것으로 사료되었다.
GCK mRNA와 SLC2A2 mRNA 발현 변화
GCK는 간에서 당대사의 항상성 유지에 필수적인 효소이 며 제2형 당뇨병에서는 GCK 발현 감소가 특징적으로 나타 나고 발현 감소 시 당대사 장애가 발생하여 혈당의 이용률을 저하시킨다(34). 현재 임상에서 많이 사용하고 있는 제2형 당뇨병 치료제인 metformin은 GCK 발현을 증가시키며, 활 성화된 GCK 단백질에 의해 혈당이 에너지 생산을 위해 사 용되거나 간에 glucagon 형태로서 저장을 유도하여 혈당을 감소시킨다(35).
본 연구에서는 건지황 열수 추출물을 투여한 제2형 당뇨 마우스의 간 조직으로부터 GCK mRNA 발현 수준을 측정한
결과를 Fig. 5A에 제시하였다. DC군에서 GCK 발현은 NC 군에 비하여 0.42±0.14배 감소하였으며, Met군 및 Pio군은 DC군에 비하여 유의하게 증가하였으며, RG50군 및 RG500 군에서는 DC군에 비하여 용량 의존적으로 증가함이 확인되 어 그 정도는 Met군과 유사한 정도로 관찰되었다.
SLC2A2는 혈액으로부터 간세포와 췌장 베타 세포로의 glucose 이동통로에 존재하는 glucose sensor로서 혈당을 세포 내로 수송하며 유입된 혈당은 간세포의 GCK의 촉매작 용에 의하여 즉시 glucose-6-phosphate로 인산화되어 당 대사가 진행된다. 또한 SLC2A2 mRNA 발현은 간에서는 증가하는 반면, 베타 세포에서는 감소하는 것으로 보고되어 있다(36-38). Fig. 5B에서 보는 바와 같이 RG50군 및 RG 500군에서는 DC군에 비하여 SLC2A2 mRNA 발현 정도는 유의하게 용량 의존적으로 증가하였다. 특히 RG500군에서 는 Met군(1.93±0.09배)보다는 2.71±0.37배로 뚜렷하게 증가하는 것이 확인되었다. 본 연구에서 건지황 열수 추출물 은 4주간 제2형 당뇨병 동물모델에 투여하였을 때 GCK mRNA 및 SLC2A2 mRNA 발현을 증가시킴이 확인되었으 며 이로서 RG는 포도당을 glucose-6-phosphate로 인산화 하는 과정을 활성화하여 당대사능 개선에 영향을 줄 것이라 사료되었다.
요 약
본 연구에서는 대표적인 한의서인 동의보감 및 방약합편에 수재된 농식품 소재 중 당뇨병과 같은 대표증상에 효과가 있는 것으로 소개된 건지황에 대해 3T3-L1 지방세포와 제 2형 당뇨질환모델인 C57BLKsJ-db/db 마우스에서 항당뇨 효과를 조사하였다. 건지황 열수 추출물을 제조하여 3T3- L1 지방세포에서 포도당 흡수능을 관찰한 결과, 3T3-L1 지방세포의 인슐린 감수성을 향상시켜 세포 내로의 포도당 흡수를 대조군 대비 약 2배 증가시켰다. 제2형 당뇨모델인 C57BLKsJ-db/db 마우스에 양성치료약물인 metformin (300 mg/kg bw/d), pioglitazone(20 mg/kg bw/d)과 건지 황 열수 추출물(50, 500 mg/kg bw/d)을 4주간 각각 경구 투여한 후 항당뇨 효능을 평가한 결과, 체중감소량의 변화 없이 식이섭취량 및 음수섭취량이 감소하는 경향을 나타내 었다. 공복혈당 및 HbA1c 수준은 건지황 열수 추출물을 투 여했을 때 당뇨대조군에 비하여 유의적으로 감소시켰지만 경구 내당능은 당뇨대조군에 비하여 유의한 차이는 없었지 만 개선하는 경향이 있었다. 혈중 인슐린 및 HOMA-IR 수준 은 당뇨대조군에 비해 양성대조군 및 건지황 투여군에서 현 저하게 낮은 수치를 나타내었으며, 혈중 중성지방 및 HDL- 콜레스테롤 함량은 당뇨대조군에 비해 유의한 변화는 없었 지만 총 콜레스테롤 농도는 유의한 감소를 나타내었다. 또한 간 조직에서 GCK mRNA 및 SLC2A2 mRNA 발현 정도가 유의적으로 증가하였으며, 특히 RG 500 mg/kg bw 투여군 에서 제2형 당뇨병의 치료제인 Met 투여군과 비슷한 수준
의 GCK 증가 효과가 확인되었다. 이러한 결과로 건지황 열 수 추출물은 당뇨 증상 중 음수량, 음수횟수 증가 등을 완화 시키고 지질대사 이상을 조절하면서 인슐린저항성을 감소 시켜 혈당을 개선하므로 항당뇨 생리활성을 나타내는 식품 소재로써 당뇨 개발의 가능성이 있을 것으로 사료되었다.
감사의 글
본 결과물은 농림축산식품부의 재원으로 농림수산식품기술 기획평가원의 전통 식약동원 지식의 과학적 인프라 구축 고 부가가치 식품 개발 사업의 지원을 받아 연구되었음(과제번 호 314071-03).
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