44(4) : 344∼ 349 (2013)
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근적외선분광법을 이용한 택사의 산지 판별법 연구
이동영1·김승현2·김효진3·성상현1*
1서울대학교 약학대학, 2연세대학교 약학대학, 3동덕여자대학교 약학대학
Discrimination of Alismatis Rhizoma According to Geographical Origins using Near Infrared Spectroscopy
Dong Young Lee1, Seung Hyun Kim2, Hyo Jin Kim3, and Sang Hyun Sung1*
1College of Pharmacy and Research Institute of Pharmaceutical Science, Seoul National University, Seoul 151-742, Korea
2College of Pharmacy, Yonsei Insitute of Pharmaceutical Sciences, Yonsei University, Incheon 406-840, Korea
3College of Pharmacy, Dongduk Women’s University, Seoul 136-714, Korea
Abstract − Near infrared spectroscopy (NIRS) combined with multivariate analysis was used to discriminate the geographical origin of Alisma orientale from Korea (n=94) and China (n=72). Two-thirds of samples were selected randomly for the training set, and one-third of samples for the test set. Second derivative was used for the pretreatment of NIR spectra. Partial least square discriminant analysis (PLS-DA) models correctly discriminated 100% of the Korean and Chinese A. orientale samples. These results demonstrate the potential use of NIR spectroscopy combined with multivariate analysis as a rapid and accurate method to discriminate A. orientale according to their geographical origin.
Key words − Alisma orientale, Near infrared spectroscopy, Multivariate analysis, Partial least square discriminant analysis
택사(澤瀉, Alismatis Rhizoma)는 택사과(Alismataceae)에 속하는 다년생 식물인 Alisma orientale(G. Samuelsson) Juz.
의 덩이 줄기를 이용한 생약으로, 신농본초경, 동의보감 등 에 수록되어 있으며 성질이 차고 맛은 달고 짜며 독성이 없 고 방광에 몰린 오줌을 잘 나가게 하여 방광의 열을 없앤다 고 알려져 있다.1,2) 택사는 alisol A, alisol B 등의 protostane 계열의 triterpene와 alismol, alismoxide 등의 sesquiterpene 을 주요 이차 대사산물로 함유하고 있으며,3-5) 이들에 의한 이뇨작용, 항알러지 작용, 항염증작용 등의 여러 약리작용 이 보고 되어있다.6-8)택사는 동아시아 지역에 널리 분포하 는 것으로 알려져 있는데,9) 일반적으로 같은 종이라도 토양, 기후와 같은 산지의 특성에 따라 생약의 이차대사산물의 함 량, 비율이 달라지게 되고 이는 곧 약효의 차이로 이어지게 된다. 따라서 산지에 따라 차이가 날 수 있는 생약의 약리 효과의 표준화를 위해서 생약의 산지를 판별할 수 있는 시 스템 개발이 요구된다.
전통적으로 생약의 판별은 외형, 맛, 냄새와 같은 주관적 기준에 의존하는 관능적 평가법에 의해 실시되어 왔다. 하
지만 절편, 분말, 추출물화 된 생약의 경우에는 이러한 관 능적 평가법에 의한 판별이 어렵다. 이러한 전통적 판별기 법의 한계를 극복하기 위해서, 최근 고성능 액체 크로마토 그래피(HPLC), 기체 크로마토그래피(GC), 핵자기 공명 분 광법(NMR) 등의 많은 최신 분석기기들과 다변량분석법 (multivariate analysis), 패턴인식법(pattern recognition)과 같 은 통계적 연산법의 연계를 통한 과학적인 산지 판별법 연 구가 많이 이루어지고 있다. 택사의 경우에도 핵자기 공명 분광법을 이용한 한국산과 중국산의 산지 감별법 연구가 보 고되어 있다.10)하지만 위의 최신 분석기기들은 정확성과 정 밀성은 뛰어나지만 시료 준비 과정이 복잡하거나 시료를 다 시 회수할 수 없거나, 시간과 인력이 많이 소모되고, 분석 에 사용되는 비용이 크다는 등의 단점이 존재한다. 또한 몇 몇 특정 성분을 대상으로 하는 분석법의 경우, 생약 내에 존 재하는 다른 수많은 성분들과의 상호작용과, 이로 인해 발 생하는 약효의 차이를 반영할 수 없다는 단점이 존재한다.11) 그러므로 위의 단점을 보완할 수 있는 새로운 산지 감별법 이 요구되고 있다.
근적외선분광법(near infrared spectroscopy, NIRS)은 시료 를 700~2500 nm(4000 cm-1~14000 cm-1) 영역대의 전자기파
*교신저자(E-mail):[email protected] (Tel):+82-2-880-7859
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인 근적외선을 이용하여 분석하는 것으로 주로 분자 운동 에 의해 중적외선(mid-IR) 영역에서 나타나는 C-H, N-H, O-H 피크의 배음(overtone)과 결합(combination)의 흡수대 가 나타난다.12) 근적외선분광법은 신속, 정밀하고 시료를 비 파괴적으로 검사할 수 있으며 시료의 전처리가 거의 필요 없다는 장점을 가지고 있어, 식품, 농업, 석유, 약학 등의 다 양한 분야에서 품질 관리, 공정 제어 등의 목적으로 널리 사 용되고 있다.13) 최근에는, 작약, 감초, 현삼과 같은 생약의 산지분석, 정량분석과 같은 품질관리를 위하여 근적외선분 광법을 적용한 연구들이 보고되어 있다.14-16)
본 연구에서는 근적외선분광법과 부분최소자승판별분석 법(partial least square discriminant analysis, PLS-DA)을 이 용하여 신속, 정확하게 국산 택사와 중국산 택사의 산지를 판별할 수 있는 분석법을 개발하였다. 산지 판별법 개발을 위해서 전체 시료를 학습집합(training set)과 검증집합(test set)으로 나누고 주성분 분석을 통해 학습집합에서 outlier를 제거하고, 부분최소자승판별분석법을 이용하여 학습집합으 로 산지 판별 모델을 수립한 뒤 검증집합을 통해 산지 판별 모델의 타당성을 확인하는 방법을 사용하였다.
재료 및 방법
식물재료 − 본 실험에 사용한 택사는 총 166종으로 국산 94종, 중국산 72종을 사용하였다. 국산은 중앙대학교 황완 균 교수님, 중국산은 대전대학교 서영배 교수님께서 수집해 주셨다. 표품은 서울대학교 약초원에 보관하였다. 국산 택 사의 경우 전남 순천시에서 41종, 전남 신안군에서 18종, 전 남 여수시에서 35종을 수집하였으며 중국산 72종은 모두 사 천성 지방에서 수집하였다.
시약 및 기기 − 택사 분말의 근적외선분광분석은 MPA NIR system(Bruker optics, Germany)을 이용하여 측정하였 다. 측정프로그램은 OPUS 7.0(Bruker optics, Germany)을 사용하였다. 다변량 분석법에는 SIMCA 13(Umetrics, Sweden)을 사용하였다.
시료 전처리 − 채집한 택사는 통풍이 잘되는 그늘에서 건 조하였다. 건조한 택사를 분쇄기로 30초간 분쇄한 뒤 분쇄 물의 입자 크기를 최대한 일정하게 하기 위해 100호체 (150µm)에 통과시켰다. 체를 통과한 분쇄물을 근적외선분 광분석용 vial에 약 1 g 정도(높이 2 cm 가량) 담고 50oC의 온도에서 12시간 건조시켜 수분에 의한 영향을 최소화 한 후 이를 측정용 시료로 사용하였다.
근적외선 분광분석 − 시료가 담긴 vial을 MPA NIR system을 이용하여 각 시료당 3회 측정한 후 그 평균치를 사용하였다. 측정 모드는 reflectance 모드를 사용하였고, 측 정범위는 10000 cm-1~4000 cm-1였다. 1회 측정에 32회 스캔, resolution은 8 cm-1, scan velocity는 10 kHz였다.
데이터 전처리 방법 − 근적외선분광법을 통해 얻은 스펙 트럼은 시료의 화학적 성질 뿐 아니라 입자의 크기, 밀도와 같은 물리적 성질에 의해서도 영향을 받게 되는데, 이러한 물리적 영향을 감소시키고 보다 나은 산지판별 모델을 개 발하기 위해서는 스펙트럼을 적절히 수학적으로 전처리 하 는 것이 필요하다.17) 일반적으로 많이 사용되는 미분법, MSC(multiplicative scattering correction)법, SNV(standard normal variate)법 등의 여러 전처리 방법 중 본 연구에서는 2차 미분법을 적용하여 스펙트럼을 전처리 하였다. 미분법 은 스펙트럼을 미분하여 흡수대의 변화를 강조하는 기법으 로 스펙트럼의 변화를 증폭시키고 바탕선의 이동과 같은 측 정상의 문제를 제거할 수 있다. 하지만 전처리 과정에서 노 이즈가 증폭될 수 있는데 노이즈의 발생을 줄이기 위해 Savitzky-Golay법을 함께 사용하였다.18)
다변량 분석법 − 근적외선분광법의 측정 결과를 다변량 분석법에 적용하기 위하여, 스펙트럼을 파수(cm-1)에 따른 피크의 강도로 수치화하여 다변량 분석에 사용하였다. 시료 별 기기의 측정조건에 따른 편차를 줄이기 위해서Pareto 방 법을 이용하여 각 데이터를 표준화(scaling)하였다.19) 산지 판별 모델을 수립하기 위해 전체 시료 166종 중 2/3인 111 종을 학습집합으로, 나머지 1/3인 55종을 검증집합으로 무 작위적으로 선정하여 PLS-DA법을 시행하였다. 판별 모델 의 검증은 검증집합을 판별 모델에 대입하여 나오는 산지 판별율(올바르게 판별된 시료 수/검증집합의 시료 수)을 이 용하기로 하였다. 산지 판별은 PLS-DA분석 시 기준값을 국 산 1, 중국산 0으로 놓았을 때 각 산지별로 결과값이 기준 값 대비 ±0.35 이내인 경우에 유의성이 있는 것으로 보고 국산 또는 중국산으로 판명하였다.
결과 및 고찰
근적외선 스펙트럼 − 국산과 중국산 택사의 평균 근적외 선 분광 스펙트럼(Fig. 1)을 살펴보면, 기본적으로 바탕선의 차이 등에 따른 스펙트럼의 변화는 관찰되었으나 전체적인 스펙트럼의 양상은 국산과 중국산이 유사함을 확인할 수 있 었다. 스펙트럼에서 발견되는 피크를 분석해 보면, 8381, 5731 cm-1 에서 –CH3와 –CH2에서의 C-H 결합의 일차 배음 에 의한 피크가 발견되는데, 이는 택사에 존재하는 alisol류 의 triterpene에 의한 것이라 추측된다. 이 밖에도 6857, 6391 cm-1에서 아미드의 N-H 결합의 일차 배음과 4782 cm-1 에서 starch의 O-H결합에 의한 피크가 발견되었다.20) 물질 의 입자의 크기 및 밀도와 같은 물리적 영향에 의해 생기는 바탕선의 변화를 제거하고 보다 나은 판별모델을 만들기 위 해 2차 미분법으로 전처리하여(Fig. 2)와 같은 결과를 얻을 수 있었다. 특히 5000 cm-1부근에서 산지간의 뚜렷한 차이 를 관찰 할 수 있었다.
주성분 분석 − 학습집합으로 구분된 시료의 raw data를 이용하여 주성분 분석을 시행하였다(Fig. 3). 전체 데이터에 서 PC1(Principal component, 주성분)에 의해 93.3%가, PC2 에 의해 5.63%가 설명되었다. 대부분의 시료들은 PC1을 기 준으로 양의 영역에는 국산이, 음의 영역에는 중국산 택사 가 분포하고 있었으나, 국산 택사 한 종(K13)이 중국산의 영역에 존재하고 있음을 확인할 수 있었다. 또한 이 결과에 서 Hotelling’s T2검정의 기준으로 국산 1종과 중국산 3종 (K36, C32, C34, C56)을 outlier로 판단하여 이후의 다변량 분석에서 제외하기로 하였다. Fig. 4에는 outlier로 판명된 4
종의 시료를 제외한 나머지 시료에 대해 2차 미분법으로 전 처리하여 주성분 분석을 시행한 결과를 나타내었다. 전체 데이터에서 PC1에 의해 47.1%가, PC2에 의해 15.3%가 설 명 되었다. PC1과 PC2에 의해 K13을 포함하여 모든 시료 들이 겹침 없이 잘 구분 되는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해 택사의 주성분 분석에 있어 2차 미분법이 효과적인 전 처리 방법임을 확인할 수 있었다.
부분최소자승판별분석 − 2차 미분으로 전처리한 학습집합 의 데이터를 토대로 부분최소자승판별분석을 시행한 결과, 학습집합의 경우 국산 62종, 중국산 45종이 모두 올바르게 Fig. 1. Average NIR spectra of Korean and Chinese A. orientale obtained from raw data.
Fig. 2. Average NIR spectra with second derivative pretreatment.
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Fig. 3. Two dimensional score plot of PCA from raw data.
Fig. 4. Two dimensional score plot of PCA from 2nd derivative data.
Fig. 5. Two dimensional score plot of PLS-DA from 2nd derivative data.
판별되었다. 이는 부분최소자승판별분석의 2D score plot에 서도 확인할 수 있다(Fig. 5). 이렇게 학습집합을 통해 수립 된 판별 모델을 토대로, 검증집합의 데이터를 이용하여 국 산을 1, 중국산을 0으로 기준값을 정하고 산지 판별을 시도 하였다. 각 기준값에서 ±0.35이내인 시료를 각각의 산지로 판별하기로 하였는데, 국산 31종과 중국산 24종 모두 기준 값에서 ± 0.35이내의 값을 나타내며 모두 올바르게 판별 되 었음을 확인할 수 있었다(Fig. 6).
결 론
택사의 산지 판별에 근적외선분광법과 다변량 분석을 도 입하여 보다 빠르고 과학적인 산지판별을 하고자 실험을 수 행하였다. 4000 cm-1~10000 cm-1의 범위에서 택사 분말 166 종의 스펙트럼을 측정하였으며, 이 중 2/3을 학습집합으로, 1/3을 검증집합으로 무작위적으로 나누었다. 학습집합에 대 해 주성분 분석을 토대로 outlier를 제거하고, 2차 미분법을 이용하여 전처리 한 후 부분최소자승판별분석법을 통해 판 별모델을 수립하였다. 그리고 수립된 판별모델에 대해 검증 집합의 시료들을 대입하여 판별모델을 검증한 결과 학습집 합과 검증집합 모두 국산과 중국산 판별율이 100%로 나타 남으로써 수립한 판별 모델이 매우 유효하다는 것을 확인 할 수 있었다. 근적외선 분광법은 분석시간이 짧고, 시료의 전처리 및 조작이 매우 간단하다는 장점을 가지고 있으므 로 기존의 다른 분석 기기를 이용한 분석법과 비교하였을 때, 산지 판별 분석에 있어 근적외선 분광법이 가지는 경쟁 력이 매우 높음을 시사한다. 이번 연구에서 적용한 근적외 선분광법을 이용한 산지 감별법은 향후 택사 이외의 다른 생약에서도 효과적으로 이용될 수 있을 것이라 기대되며,
또한 객관적이고 경제성 있는 산지 판별 시스템을 구축하 는 데에 중요한 근거를 제공 할 것이라 사료된다.
사 사
시료 채집에 큰 도움을 주신 중앙대학교 황완균, 대전대 학교 서영배 교수님께 감사를 전합니다. 본 연구는 산업통 상자원부 바이오의료기기산업융합원천기술개발사업으로 지 원된 결과입니다(GLST-OSP 10039303).
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