새로운 Fluoronaphthyridinone계 항균제 DW286의 그람 양성세균에 대한 항균 활성
곽진환#·박희수·정성지·정지웅·김요셉·최동락*·최응칠**
한동대학교 생명과학부, *동화약품 중앙연구소, **서울대학교 약학대학 종합약학연구소 (Received August 28, 2012; Revised September 24, 2012; Accepted September 26, 2012)
In vitro and In vivo Activity of DW286, an Experimental Fluoronaphthyridione, against Gram-Positive Bacteria
Jin-Hwan Kwak#, Hee Soo Park, Sung Ji Jung, Ji-Woong Jeong, Joseph Kim, Dong-Rack Choi* and Eung-Chil Choi**
School of Life Science, Handong Global University, Pohang 791-708, Korea
*Dong Wha Pharmaceutical Industry Ltd., Yongin 446-902, Korea
**College of Pharmacy and Research Institute of Pharmaceutical Sciences, Seoul National University, Seoul 130-743, Korea
Abstract — In vitro antibacterial activity of DW286 was tested against recently collected clinical isolates of Gram-positive strains by the two fold agar dilution method. In vivo activity of DW286 was also determined against systemic infections in mice caused by Staphylococcus aureus. DW286 showed 16~64-fold more potent in vitro activities than ciprofloxacin against Gram-positive bacteria. Against systemic infection model caused by two S. aureus strains, one being methicillin-susceptible and the other methicillin-resistant, DW286 (ED50s, 0.16 mg/kg and 4.36 mg/kg, respectively) was more potent than gemi- floxacin (1.37 mg/kg, 26.58 mg/kg, respectively).
Keywords □ DW286, fluoroquinolone, MIC, ED50
지금까지 200여종 이상의 항생제들이 개발되어 임상에서 세균 의 감염증 치료에 유용하게 사용되고 있지만, 이들 항생제에 대 해 내성을 가진 세균들이 끊임없이 출현함으로써 인류의 건강에 여전히 큰 위험이 되고 있다. 이러한 내성균들 중에서도 특히 메 치실린 내성 Staphylococcus aureus(MRSA, Methicillin-resistant S. aureus), 메치실린 내성 CNS(MRCNS, Methicillin-resistant coagulase-negative Staphylococcus), 퀴놀론 내성 폐렴구균(QRSP, Quinolone-resistant Streptococcus pneumoniae), 반코마이신 내 성 장내구균(VRE, Vancomycin-resistant Enterococci) 등은 최 근에 대형병원의 중환자실에서 많이 발생하여, 감염질환의 치료 에 있어서 심각한 문제가 되고 있다.1)이러한 이유 때문에 병원 내감염(Nosocomial Infection)의 주 원인이 되는 다제약제 내성 그람양성균을 효과적으로 치료할 수 있는 새로운 항생제 개발이
시급하게 되었다.2-4)
플루오로퀴놀론 항균제는 세균의 DNA 복제와 형태에 관여하 는 DNA gyrase를 저해함으로써 박테리아에 대해 살균작용을 갖 는 항생제로서, 광범위한 항균력과 우수한 약동력학적 특성을 가 지고 있어 중증의 감염질환에 효과적으로 사용할 수 있는 약제 이다.5)특히 국내에서 개발되어 현재 전임상시험 중에 있는 DW286은 지금까지 개발된 어떤 퀴놀론 화합물보다도 우수한 항 균효과를 갖고 있는 새로운 플루오로퀴놀론 항균제이다.6) DW286 은 MRSA와 ciprofloxacin-내성 S. aureus에 대해서 항균활성을 갖고 있으며, 폐렴구균에 대해서도 뛰어난 항균활성을 갖고 있 다.7,8)그러나 DW286 화합물의 항균력 시험 결과들은 대부분 10 여년 전에 분리된 임상균주를 대상으로 한 실험 결과여서, 최근 에 대학병원에서 분리된 임상균주들에 대한 감수성 실험이 필요 하게 되었다.
본 연구에서는 최근 임상에서 분리한 균주 중에서 MRSA, MRCNS, QRSP, VRE 등의 다제내성 병원균을 포함한 438종의 그람 양성 세균에 대한 DW286의 시험관내 항균력을 9종의 대
#본 논문에 관한 문의는 저자에게로 (전화) 054-260-1353 (팩스) 054-260-1925 (E-mail) [email protected]
종설
조약제와 비교 실험을 하였다. 한편, 메치실린 감수성 S. aureus (MSSA)와 메치실린 내성 S. aureus(MRSA)에 대한 생쥐의 전신 감염모델에서의 DW286의 치료 효과도 비교 실험하였다.
실험방법
시약
본 실험에 사용된 DW286은 동화약품 주식회사 R&D 센터에 서 합성한 것을 이용하였다(Fig. 1). Gemifloxacin은 LG 생명과 학에서 제공 받아 사용하였다. Ciprofloxacin, sparfloxacin, moxifloxacin은 commercial tablet을 재결정화 과정을 통해 정제 하여 사용하였으며, HPLC(High-Performance Liquid Chromato- graphy)(Dionex. Inc., Korea)로 99.9% 이상의 순도를 얻었다.
Linezolid와 synercid(Quinupristin-dalporistin)는 CrystalGenomics Inc.에서 제공받아 사용하였으며, oxacillin, vancomycin, erythro- mycin은 Sigma Aldrich사에서 구입하여 사용하였다.
시험균주
본 연구에 사용된 실험균주들은 2008년부터 2010년 사이에 국 내 의료기관에서(삼성의료원, 세브란스병원, 현대아산병원) 임상 적으로 분리한 균주들을 사용하였다. 생쥐 전신감염모델에 사용 된 균주는 S. aureus giorgio(MSA)와 메치실린 내성 S. aureus P197(MRSA)을 사용하였다.9)
시험관내 항균력 시험
실험 균종에 대한 항균물질의 최소 억제 농도(Minimal Inhibitory Concentration, MIC)의 측정은, Clinical Laboratory Standard Institutes(CLSI)의 고체 배지 희석법에 의하여 실시하였다.10)호 기성 세균과 통성혐기성 세균의 배양을 위해서 Mueller-Hinton agar medium(Difco, USA)를 사용하였다. S. pneumoniae와 Streptococcus pyogenes 배양을 위해서는 Mueller-Hinton agar 배지 에 5% defibrinated sheep blood(Hankuk Media Ltd., Korea)을 첨가하여 사용하였다. 시험 균주는 Mueller-Hinton agar medium 에 접종하여 35oC에서 18시간 배양하였고 이후 배양액을 새로운 액체 배지를 이용하여 균액의 농도가 107CFU/ml이 되도록 희석 하여 사용하였다. Multipin inoculator를 이용하여 단계 희석된 항
균물질을 함유하고 있는 배지에 104CFU의 균이 접종되도록 하 였다. 균을 접종한 배지는 35oC에서 18시간 배양하였고 균의 성 장을 관찰할 수 없는 최소 농도를 MIC로 결정하였으며, 모든 시 험 물질의 항균력은 CLSI에서 권장하는 표준 균주를(S. aureus ATCC 25923, S. pneumoniae ATCC 6305, Enterococcus faecalis ATCC 29212) 이용하여 정도 관리(quality control) 하였다.
마우스의 전신감염모델에서의 약효 평가
DW286의 생체 내 약효는 생쥐의 전신감염모델을 이용하여 측 정하였다.9)전신감염모델에 사용된 생쥐(Daehan Bio Link Co., Ltd., Korea)는 체중 18~22 g의 4주령 수컷을 사용하였다. 감염 에 사용한 균주는 Tryptic Soy Agar Medium(Difco, USA) 배지 를 사용하여 35oC에서 18시간 배양하였다. 모든 균주는 5%의 돼지 유래 뮤신(Mucin from porcine stomach, Sigma)이 첨가된 0.9% 생리식염수에 현탁하여 사용하였다. 각각 6마리씩 실험군 으로 나눈 생쥐는 복강 내에, 최소치사농도(MLD, Minimal Lethal Dose)의 10~100배에 해당하는 생균을 함유하고 있는 0.5 ml의 감염 균액을 주사하였다. 약물 투여 농도는 시험균주에 대한 약물의 시험관내 항균력을 바탕으로 4단계의 용량을 사용 하였다. 감염 후 1시간과 4시간 후에 각 약물을 생쥐에 경구 투 여하였다. 71일간 생쥐의 생존률을 관찰하였으며, 프로빗 분석법 (Probit analysis)으로 50%의 생쥐를 생존시킬 수 있는 약물의 농 도를(ED50, Effective Dose) 측정하였다.11)약물을 처치하지 않 은 생쥐군은 감염 후 24시간 안에 모두 사망하였다. 모든 동물 실험은 한동대학교 실험동물 윤리 위원회의 인허를 받아서 진행 하였다.
실험결과
시험관내 약효 평가
그람 양성 세균에 대한 DW286의 시험관내 약효는 Table I에 요약하였다. DW286은 메치실린 감수성 S. aureus(MSSA), 퀴놀론 감수성 메치실린 내성 S. aureus(QS-MRSA, quinolone-susceptible methicillin-resistant S. aureus), S. pneumonia, 메치실린 감 수성 CNS(MSCNS, methicillin-susceptible coagulase-negative Staphylococci), 메치실린 내성 CNS(methicillin-resistant coagulase- negative Staphylococci)에 대해서 우수한 항균력을 보여주었다.
특히 DW286은 대조약제로 사용된 다른 퀴놀론계 항균제보다 약 제내성 staphylococci에 대해 탁월한 항균력을 보여주었다.
DW286의 MIC90(전체 시험균주의 90%에 해당하는 균주들에 대 해 저해 활성을 갖는 농도)은 MSSA, QS-MRSA, MSCNS, MRCNS에 대해 각각 0.015 µg/ml, 0.03 µg/ml, 0.25 µg/ml, 0.25µg/ml으로 대조약제인 ciprofloxacin보다 16~64배 정도 우 수한 항균 효과를 보여 주었다. 또한 퀴놀론 내성 MRSA에 대 Fig. 1− Chemical structure of DW286.
한 DW286의 MIC90은 4 µg/ml으로 다소 높았지만, 다른 퀴놀론 계 항균제들보다는 16배 이상 우수한 항균력을 보여주었고,
vancomycin, linezolid, synercid 보다는 2~4배 활성이 낮았다.
Streptococci에 대한 DW286의 항균활성도 대조약제들보다 우수 Table I− In vitro antibacterial activities of DW286 against Gram-positive bacteria
Microorganisma (no. of isolates)
Antimicrobial agent
MIC (µg/ml) Microorganisma (no. of isolates)
Antimicrobial agent
MIC (µg/ml)
Range 50% 90% Range 50% 90%
MSSA DW286 0.004-0.03 0.008 0.015 QRSP DW286 0.015-0.25 0.06 0.125
(n=64) Ciprofloxacin 0.06-1 0.25 0.5 (n=19) Ciprofloxacin 2-64 16 32
Sparfloxacin 0.015-0.125 0.06 0.06 Sparfloxacin 0.25-32 4 16
Moxifloxacin 0.015-0.25 0.06 0.125 Moxifloxacin 0.125-4 2 4
Gemifloxacin 0.008-0.06 0.015 0.03 Gemifloxacin 0.03-1 0.125 0.5
Oxacillin 0.06-0.5 0.25 0.25 Oxacillin 0.03-8 0.5 8
Erythromycin 0.125->64 0.25 64 Erythromycin 0.015-64 0.03 16
Vancomycin 0.25-2 1 1 Vancomycin 0.125-0.5 0.25 0.25
Linezolid 2 2 2 Linezolid 0.25-2 1 2
Synercid 0.125-0.5 0.25 0.5 Synercid 0.125-2 1 2
MRSA & QSSA DW286 0.008-0.06 0.008 0.03 S. pyogenes DW286 0.008-0.125 0.015 0.03
(n=12) Ciprofloxacin 0.125-2 0.5 1 (n=47) Ciprofloxacin 0.5-4 1 2
Sparfloxacin 0.06-0.5 0.06 0.25 Sparfloxacin 0.125-1 0.25 0.5
Moxifloxacin 0.03-0.5 0.06 0.25 Moxifloxacin 0.125-0.5 0.125 0.25
Gemifloxacin 0.008-0.25 0.03 0.03 Gemifloxacin 0.015-0.125 0.03 0.06
Oxacillin 4->64 16 >64 Oxacillin 0.03-32 0.5 8
Erythromycin 0.25->64 0.5 >64 Erythromycin 0.008-8 0.06 2
Vancomycin 1 1 1 Vancomycin 0.5-1 1 1
Linezolid 2 2 2 Linezolid 1-2 2 2
Synercid 0.125-0.5 0.25 0.5 Synercid 0.25-2 1 2
MRSA & QRSA DW286 0.015-8 0.5 4 E. faecalis DW286 0.015-1 0.06 0.25
(n=159) Ciprofloxacin 8->64 32 >64 (n=50) Ciprofloxacin 0.06-4 0.5 1
Sparfloxacin 2->64 16 >64 Sparfloxacin 0.25-32 0.5 1
Moxifloxacin 1->64 8 64 Moxifloxacin 0.06-4 0.5 1
Gemifloxacin 0.25->64 2 64 Gemifloxacin 0.008-2 0.06 0.125
Oxacillin 64->64 >64 >64 Oxacillin 8->64 16 32
Erythromycin 16->64 >64 >64 Erythromycin 0.125->64 32 >64
Vancomycin 0.5-2 1 2 Vancomycin 0.5-2 1 2
Linezolid 2 2 2 Linezolid 1-2 2 2
Synercid 0.125-1 0.5 1 Synercid 0.25-16 4 8
MSCNS DW286 0.008-0.25 0.008 0.25 E. faecium DW286 0.03-16 2 4
(n=23) Ciprofloxacin 0.06-8 0.125 4 (n=20) Ciprofloxacin 1-8 4 8
Sparfloxacin 0.03-8 0.125 4 Sparfloxacin 0.5-32 4 8
Moxifloxacin 0.03-4 0.125 2 Moxifloxacin 0.25-32 4 16
Gemifloxacin 0.008-0.5 0.015 0.5 Gemifloxacin 0.03-8 2 4
Oxacillin 0.03-2 0.25 2 Oxacillin 16->64 >64 >64
Erythromycin 0.06->64 8 >64 Erythromycin 2->64 >64 >64
Vancomycin 1-2 2 2 Vancomycin 0.5-2 1 2
Linezolid 1-2 1 1 Linezolid 1-2 2 2
Synercid 0.125-1 0.25 1 Synercid 0.25-4 0.5 4
MRCNS DW286 0.008-1 0.125 0.25 VRE DW286 0.03-2 0.5 2
(n=28) Ciprofloxacin 0.06-64 16 32 (n=16) Ciprofloxacin 0.5-4 4 4
Sparfloxacin 0.03-32 4 8 Sparfloxacin 0.25-4 4 4
Moxifloxacin 0.06-16 2 8 Moxifloxacin 0.25-4 2 4
Gemifloxacin 0.008-8 0.5 1 Gemifloxacin 0.015-2 0.5 2
Oxacillin 4->64 >64 >64 Oxacillin 32->64 >64 >64
Erythromycin 0.06->64 >64 >64 Erythromycin >64 >64 >64
Vancomycin 1-2 2 2 Vancomycin >64 >64 >64
Linezolid 1-2 1 1 Linezolid 2 2 2
Synercid 0.125-2 0.25 1 Synercid 0.5-2 2 2
aMSSA, methicillin-susceptible S. aureus; MRSA, methicillin-resistant S. aureus; MSCNS, methicillin-susceptible coagulase-negative staphylococci; MRCNS, methicillin-resistant coagulase-negative staphylococci; QRSP, quinolone-resistant S. pneumoniae; VRE, vancomycin-resistant enterococci.
한 결과를 나타내었다. 퀴놀론 내성 S. pneumoniae(QRSP, quinolone-resistant S. pneumonia)에 대한 DW286의 MIC90은 0.125µg/ml로서, anti-pneumococcal fluoroquinolone 중에서 가 장 우수한 약효를 가지는 것으로 알려진 gemifloxacin 보다도 4 배 우수하였다. Streptococcus pyogenes에 대해서도 DW286 (MIC90, 0.03µg/ml)은 gemifloxacin(MIC90, 0.06µg/ml), moxi- floxacin(MIC90, 0.25µg/ml), sparfloxacin(MIC90, 0.5µg/ml), ciprofloxacin(MIC90, 2µg/ml)에 대해서 각각 2배, 8배, 16배, 64 배 우수한 항균력을 보였다. Enterococcus faecalis에 대한 DW286 의 MIC는 ciprofloxacin, sparfloxacin, moxifloxacin보다 16배 정 도 우수한 항균력을 보였다. DW286의 E. faecium에 대한 항균 력은 다른 퀴놀론에 비해 우수한 효과를 보여주었지만, vancomycin, linezolid, synercid 보다는 낮은 항균력을 나타내었 다. VRE에 대해서도 다른 퀴놀론 항균제들보다는 2배 정도 우 수한 항균력을 보여 주었다.
마우스의 전신감염모델에서의 약효 평가
S. aureus로 감염시킨 생쥐의 전신감염모델에서의 DW286의 치료 효과는 Table II에 요약하였다. S. aureus giorgio 균주 (MRSA)의 감염에 대한 DW286 및 ciprofloxacin, moxifloxacin, gemifloxacin의 ED50은 각각 0.16 mg/kg, 16.52 mg/kg, 1.78 mg/kg, 1.37 mg/kg으로, DW286은 다른 퀴놀론 항균제들에 비해 월등히 우수한 치료 효과를 보여주었다. 메치실린 내성 S. aureus P197 균주(MRSA)에 의한 생쥐의 전신감염에 대해서도 DW286 (ED50, 4.36 mg/kg)는 ciprofloxacin(ED50, >40 mg/kg), moxi- floxacin(ED50, 35.35 mg/kg), gemifloxacin(ED50, 26.58 mg/kg) 보다 우수한 치료효과를 보여주었다. DW286 및 대조약물로 사 용한 다른 퀴놀론 항균제의 실험동물에서의 치료 효과는 시험관 내에서의 항균력과 서로 비례하는 결과를 보여주었다.
고찰 및 결론
DW286은 그람양성 세균과 그람음성 세균에 대해 광범위한 항
균력을 갖고 있는 새로운 퀴놀론 항균제이다.4)특히 본 연구에 서는 DW286이 최근에 분리된 staphylococci, streptococci, enterococci와 같은 그람양성 임상세균에 대해서 우수한 항균 활 성이 있음을 보여주었다. DW286은 그람양성 세균에 대해서 대 조약제로 사용된 퀴놀론 항균제들 중에서 가장 우수한 시험관 내 항균력과 실험동물에서의 치료 효과를 보여주었다. 지금까지 퀴 놀론계 항균제가 그람음성 세균 및 일부 그람양성 세균에 의한 감염증 치료에 매우 효과적인 사용되고 있지만, 임상에서 퀴놀 론 항균제의 사용이 증가됨에 따라 그람양성 세균 중에서 특히 폐렴구균 및 MRSA 등에서 내성 균주의 발현이 급격히 증가되 고 있는 추세이다. 그러나 현재 사용 중인 퀴놀론 항균제들은 폐 렴구균을 포함한 그람양성 세균에 대한 항균력이 낮기 때문에, 이들 내성균들에 의한 감염 질환의 치료에는 사용되지 못하고 있 는 실정이며,12)따라서 최근의 연구 동향은 이들 그람 양성 내성 균에도 효과적인 새로운 퀴놀론 항균제의 개발에 관심이 집중되 고 있다.13,14)
DW286는 그람음성 세균에 대한 우수한 항균력을 그대로 유 지하면서, MRSA, MRSE, 폐렴구균, S. pyogenes, 장구균 등의 그람양성 세균에 대해서도 우수한 항균력을 가지고 있다는 점에 서 기존의 퀴놀론 항균제에 비해 장점이 있음을 보여준다. 특히 DW286은 기존의 퀴놀론 항균제에 대해 내성인 폐렴구균에 대 해서도 매우 우수한 항균 효과를 갖고 있어서, 퀴놀론 항균제로 서는 치료가 불가능하였던 중증의 호흡기 감염에 대해서도 효과 적으로 사용될 수 있다는 점에서 매우 유망한 신약 후보물질이 될 수 있다. 실험동물에서의 우수한 항균력과 이와 관련된 약동 학적 특성들을 고려해 볼 때, 앞으로 체계적인 전임상 시험 및 임상시험이 성공적으로 수행된다면, DW286은 인체의 다양한 감 염질환의 치료에 매우 유용하게 사용될 수 있을 것으로 판단된다.
감사의 말씀
본 연구는 2011년도 한동대학교 교내연구지원사업에 의해 수 행되었으며, 이에 감사 드립니다.
Table II− Comparative in vivo activities of DW286 against systemic infections in micea
Microorganism (inoculum) Antimicrobial agenta MIC (µg/ml) ED50 (mg/kg) (95% confidence limits)
S. aureus giorgio (MSSA) DW 286 <0.008 0.16(0.04~0.42)
(1×108CFU/mouse) Gemifloxacin 0.008 1.37(0.27~7.67)
Ciprofloxacin 0.125 16.52(1.27~18.99)
Moxifloxacin 0.03 1.78(0.33~7.66)
S. aureus P197 (MRSA) DW 286 0.06 4.36(2.55~6.89)
(5×108CFU/mouse) Gemifloxacin 0.25 26.58(15.03~47.28)
Ciprofloxacin 8 >40
Moxifloxacin 1 35.35(20.38~61.33)
MIC, minimum inhibitory concentration; ED50, median effective dose needed to protect 50% of the mice; CFU, colony-forming units.
aAntimicrobial agents were orally administrated twice at 1 and 4 h after infection.
참고문헌
1) Levy, S. B. and Marshall, B. : Antibacterial resistance worldwide: causes, challenges and responses. Nat. Med. 10, s122 (2004).
2) Livermore, D., M. : The need for new antibiotics. Clin.
Microbiol. Infect. 10, 1 (2004).
3) Wise, R. : BSAC working party on the urgent need:
Regenerating antibacterial drug discovery and development. J.
Antimicrob. Chemother 66, 1939 (2011).
4) Jabes, D. : The antibiotic R&D pipeline: an update. Curr. Opin.
in Microbiol. 14, 564 (2011).
5) Hooper, D. C. and Rubinstein, E. : Quinolone antimicrobial agents. ASM Press (2003).
6) Yun, H. J., Min, Y. H., Lim, J. A., Kang, J. W., Kim, S. Y., Kim, M. J., Jeong, J. H., Choi, Y. J., Kwon, H. J., Jung, Y. H., Shim, M. J. and Choi, E. C. : In vitro and in vivo antibacterial activities of DW286, a new fluoronaphthyridone antibiotic.
Antimicrob. Agents Chemother. 46, 3071 (2002).
7) Yun, H. J., Min, Y. H., Jo, Y. W., Shim, M. J. and Choi, E. C. : Increased antibacterial activity of DW286, a novel fluoron- aphtyridone antibiotic, against Staphylococcus aureus strains with defined mutations in DNA gyrase and topoisomerase IV.
Int. J. Antimicrob. Agents 25, 334 (2005).
8) Park, H. S., Jung, S. J., Choi, D. R. and Kwak, J. H. : Antimicrobial activity of DW286 against Streptococcus
pneumonia Int. J. Antimicrob. Agents 36, 230 (2010).
9) Park, H. S., Kim, H. J., Seol, M. J., Choi, D. R., Choi, E. C. and Kwak, J. H. : In vitro and in vivo antibacterial activities of DW-224a, a new fluoronaphthyridone. Antimicrob. Agents Chemother. 50, 2261 (2006).
10) Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; 18th information Supplement. CLSI Document M100-S18, CLSI, Wayne, PA (2008).
11) Bliss, C. I. : Statistics in bioassay. Academic Press, Inc., New York (1985).
12) De Azavedo, J. C., Duncan, C. L., Kilburn, L., Downar, J., Kong, B., Lad, S., Low, D. E. and Bast, D. J. : Relative potential for selection of quinolone-resistance-determining-region mutations in Streptococcus pneumoniae by gemifloxacin, gatifloxacin and moxifloxacin. J. Chemother. 18, 373 (2006).
13) Fernandez, J., Hilliard, J. J., Morrow, B. J., Melton, J. L., Flamm, R. K., Barron, A. M. and Lynch, A. S. : Efficacy of a new fluoroquinolone, JNJ-Q2, in murine models of Staphylococcus aureus and Streptococcus pneumoniae skin, respiratory, and systemic infections. Antimicrob. Agents Chemother. 55, 5522 (2011).
14) Emami, S., Shafiee, A. and Foroumadi, A. : Structural features of new quinolones and relationship to antibacterial activity against Gram-positive bacteria. Mini Rev. Med. Chem. 4, 375 (2006).
