Properties of a Bacillus licheniformis Cellulase Produced by Recombinant Escherichia coli

(1)

257

대장균으로부터 생산된 Bacillus licheniformis WL-12의 Cellulase 특성

박종덕·김연아·윤기홍*

우송대학교 식품생물과학과

Bacillus licheniformis WL-12

의

carboxymethyl cellulase (cellulase)

유전자를함유한대장균균체파쇄상등액으로 부터

DEAE-Sepharose

와

Q-Sepharose

컬럼크로마토그래피를통해

cellulase

를정제하였다

.

정제된효소의비활 성은

163 U/mg

이었으며

, SDS-PAGE

에의해측정된분자량은약

49.5 kDa

으로나타났다

. pH 5.5

와

55

^o

C

에서최대 반응활성을보였으며

, SDS (5 mM)

에의해서는

cellulase

의활성이완전히저해되었고

Cu

²⁺

(5 mM)

에의해서는약 간 증진되었다

.

정제된

cellulase

는

CMC, konjac, barley

β

-glucan

과

lichenan

을가수분해하였으나

xylan, locust bean gum

및

p -nitrophenyl-

β

-glucopyranoside

를 분해하지 못하였다

. Cellooligosaccharides

를 정제된

WL-12 cellulase

로분해하였을때

cellobiose

와

cellotriose

가주된최종반응산물로관찰되었으며

cellobiose

보다는중합도 가큰

cellotriose, cellotetrasoe

와

cellopentaose

는분해하였으나

cellobiose

는분해하지못하는것으로확인되었다

. Key words

□

B. licheniformis , cellulase, E. coli , properties, purification

Endo-

^β

-1,4-glucanase (carboxymethyl cellulase : cellulase)

^는

exo-

β

-1,4-glucanase,

β

-glucosidase

와더불어

cellulase

계구성효소 로서재생자원인농·임산폐자원의당화

,

^{과일음료와}^맥주의^청

징

,

사료첨가물및면직물가공등다양한용도로이용되는산업

용효소이다

. Cellulase

^는^세균

,

^곰팡이와 ^더불어^식물과 ^동물에

서도생산되고있으며

glycosyl hydrolase (GH) family

를구성하 는 가장 큰 집단이다

. Cellulase

^의 ^산업적 ^생산은

Trichoderma

reesei

와같은곰팡이로이루어지고 있으나

,

용도에따라서는곰

팡이효소가갖는단점을보완하기위해다양한특성을지닌세

균의

cellulase

계효소에 대한관심이 지속되고있다

.

청바지 염

료의탈색공정에는 곰팡이 효소가산성

pH

에서주로 반응하게 되어 얼룩을 발생시키는 문제가있어 중성

pH

^에서 ^작용할^수

있는세균성

cellulase

의개발이진행되고있으며

(4, 9),

리그노셀 룰로즈 바이오매스를

cellulase

^로 ^{처리하면서}

Saccharomyces cerevisiae

와

Zymomonas mobilis

로동시당화발효시키는데있어 서경제적인문제점으로지적되고있는

cellulase

^효소의^가격을

낮추기 위해

Bacillus coagulans

의 중온성

cellulase

를 곰팡이

cellulase

^와 ^동시에 ^{시용함으로써} ^{바이오매스} ^당화에 ^필요한

cellulase

효소량을절감하였다

(17).

Bacillus licheniformis

는

B. subtilis

와더불어산업용 효소의생 산에사용되고있으며

,

유전자재조합숙주균으로서산업적이용 이가능한유용

GRAS

균주로

B. licheniformis DSM3

의총염색 체염기서열이 결정되었다

(21). B. licheniformis

는고분자물질의 가수분해효소생산균으로여러종류가다양한장소에서탐색되 어그들이생산하는효소와그유전자에대한특성이다수보고

되었다

. B. licheniformis

에서 가장많이연구된 효소로는 내열성 α

-amylase

가있으며

,

호알칼리성

protease (18), cellulase-chitosanase (8). xylanase (5),

^β

-1,3-1,4-glucanase (15, 20), cellulase (2, 3, 14),

mannanase (7)

와같은섬유물질분해에 관련된효소의 특성이나

그유전자가분석되었다

.

^또한

chitosanase

^를^생산하는

MB-2

^가^인

도네시아온천에서분리된바있으며

(6), 14A

의펙틴분해에관련

된효소

(1)

^에^대한^연구도^{이루어졌다}

.

^한편^국내^가정에서^제조

된된장에서고온성 미생물로분리된

B. licheniformis WL-12

의

cellulase

는

B. licheniformis ATCC 14580

의 효소와 동일한 아미 노산잔기서열을갖는것으로확인되었는데

(23),

현재까지그특 성에대한보고가없어본연구에서는대장균에서

cellulase

유전 자를발현하여효소를정제하고효소반응특성을검토하였다

.

재료 및 방법

사용 균주와 플라스미드 및 배양

B. licheniformis WL-12

의

cellulase

유전자를과잉발현하기위 한 플라스미드와 숙주균으로

pET23a(+)

^와

E. coli BL21(F

^-

ompT hadS

B

(r

B-

m

B-

) , gal dcm (DE3))

를각각사용하였으며

,

배지 로는

ampicillin (100

µ

g/ml)

을첨가한

LB

액체배지

(yeast extract, 5 g; tryptone, 10 g; NaCl, 5 g; water, 1 L)

를사용하였다

.

DNA 분리와 조작

Cellulase

유전자를증폭하기위해

WL-12

의

cellulase

유전자를 함유한 재조합플라스미드를주형으로하고유전자의염기서열 에근거하여 제조한

12CelF (5 ’ -GGAAAACATATGTCATATATG AAACGTTC-3 ’ : Nde I sites; underlined)

^와

12CelR (5 ’ -CGTC AAACTCGAGTTATTTAGGTTCAGTG-3 ’ : Xho I sites; underlined)

*To whom correspondence should be addressed.

Tel: 82-42-630-9742, Fax: 82-42-636-2676

E-mail: [email protected]

(2)

primers

를사용하여

pfu DNA polymerase

로

PCR

반응을실시하 였다

. PCR

반응은

95

^o

C

에서

3

분간열처리한후

95

^o

C

에서

30

초

, 62

^o

C

에서

40

초

, 72

^o

C

에서

3

분간반응을

30

회반복하고최종적으 로

72

^o

C

에서

10

분간방치하여수행하였다

.

Cellulase 정제

Cellulase

유전자를 함유한

E. coli BL21(DE3)/pPES3

를

ampicillin

이첨가된

LB

배지에접종하여

37

^o

C

에서진탕배양하면 서

600 nm

^에서 ^흡광도가

0.7

^정도에 ^이르렀을^때

IPTG

^를^최종

농도가

0.5 mM

이되도록첨가한 후

25

^o

C

에서

5

시간진탕 배양 하였다

.

^배양액을^{원심분리하여}^회수한 ^균체를

50 mM Tris-HCl

buffer (pH 8.0)

에 현탁하고 초음파로 균체를 파쇄한 후

15,000

^×

g, 4

^o

C

에서

20

분간원심분리함으로써균체파쇄상등액을 제조하였다

.

균체 파쇄상등액에

ammonium sulfate

를 첨가하여

30~70% (w/v)

로 분획한 침전물을

50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0)

에 현탁하여 동일한 완충용액으로 투석을 한 후

, DEAE- Sepharose

컬럼 크로마토그래피를 수행하였다

. NaCl (0~0.8 M)

로추출하여얻은활성분획을모아

ultrafiltration

으로 농축한후 이를

50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0)

로 투석하고

Q-Sepharose

컬럼크로마토그래피를수행하였다

.

^결합된^효소를^추출하기^위

해서는 동일완충용액으로

NaCl (0~0.6 M)

농도구배를주어분 획하였으며효소활성을 보이는 분획들을모아서

ultrafiltration

^으

로농축하고이를정제된효소로사용하였다

.

Cellulase 활성 측정

Cellulase

활성은

CMC

를기질로 하여효소반응후에 유리된

환원당을

3,5-dinitrosalicylic acid (DNS)

방법으로다음과같이정 량함으로써측정하였다

.

증류수에현탁시킨

1.0% (w/v) CMC

용 액

0.5 ml, 200 mM sodium citrate buffer (pH 5.5) 0.25 ml

와효소 용액

0.25 ml

를혼합하여

55

^o

C

에서

15

분동안 반응시켰다

. DNS

시약

3 ml

^를^첨가하여^반응을^{정지시키고}^끓는^물에서

5

^분^동안

방치하여 발색시킨 후

540 nm

에서 흡광도를 측정하고 이를

glucose

^를^{표준시료로}^사용하여^동일^{조건하에서}^발색시켜^조사한

흡광도와비교함으로써 유리된환원당의양을결정하였다

.

효소 활성도

1.0 unit

^는^위의^{조건하에서}

1

^분^동안

CMC

^로^부터

1 µmol

의

glucose

에상응하는환원당을생성하는효소의양으로정의하

였다

. p -Nitrophenyl-

β

-glycosides

의분해활성을조사하기위해서는

기질을

1 mM

사용하였으며

10

분간반응시킨후반응액의

2

배부

피의

1 M Na

2

CO

3 용액을첨가하여반응을종결시키고

405 nm

에 서흡광도를측정하였다

.

효소의활성도는

1

분동안

1

µ

mol

의

p - nitrophenol

을유리시키는효소양을

1 unit

로정의하였다

.

반응산물 분석

Cellooligosaccharides

^를^{반응기질로}^하여^{효소반응을} ^수행하고

반응액을

95

^o

C

에서

3

분동안열처리한후원심분리하여단백질

침전물을 제거하고 상등액을 적정량 취해

n-propanol,

nitromethane

과증류수

[7:1:2, (v/v)]

혼합용액을전개용액으로하 여

silica gel-precoated thin layer plate (Merck Kiesegel, No.

5748)

에서박층크로마토그래피를수행하였다

.

전개된물질을발

색시키기 위해서는

9 ml ethanol, 0.5 ml p -anisaldehyde, 0.5 ml sulfuric acid

와

glacial acetate

몇 방울을 혼합한발색제 용액을 뿌린후

, 120

^o

C

에서

10

분간방치하였다

.

결과 및 고찰

Cellulase의 과잉발현

B. licheniformis WL-12

^의

cellulase

^유전자를^{대장균에서} ^과잉

발현시키기위해

signal peptide

를포함하는

cellulase

구조유전자 가 증폭되도록 설계된

12CelF

^와

12CelR primers

^를 ^사용하여

PCR

을 수행하였다

. Primers

의 서열에는

pET23a(+)

에

cellulase

유전자를 크로닝하기 위해

Nde I

과

Xho I

을 도입하였다

.

따라서 증폭한

cellulase

유전자를

Nde I

과

Xho I

으로절단한 후구조유전

자부분을추출하고이를동일한효소로절단된

pET23a(+)

에도

입함으로써 재조합 플라스미드

pPES3

을 제조하였다

(Fig. 1).

pPES3

에 삽입된

cellulase

유전자의 염기서열을 결정하여

PCR

반응중변이가일어나지않은것을확인하였다

.

재조합 플라스미드

pPES3

을

E. coli BL21(DE3)

에 도입하여 얻은형질전환주를

LB

^배지에 ^접종하여

37

^o

C

^에서^진탕^배양하

면서

IPTG

를처리하였다

.

발현된

cellulase

의수용화정도를높이 기위해

IPTG

^처리^후에는^{배양온도를}

25

^o

C

^로^낮추어

5

^시간^배

양하였다

.

균체를회수하고초음파로파쇄한후원심분리하여얻 은 균체파쇄상등액과 배양상등액에 존재하는

cellulase

^활성을

비교한결과배양부피기준으로균체파쇄상등액은

5.28 U/ml

의 효소활성을 보였으나

,

배양상등액에서는균체 파쇄상등액의약

1%

정도에해당하는효소활성을보였다

.

이로보아재조합대장

균에서 생산된

cellulase

는대부분이균체내에존재하는것으로

Fig. 1. Structure of recombinant plasmid pPES3 containing the cellulase gene. Black bar indicates the cellulase gene. The arrows indicate the direction of transcription of genes. Abbreviations are as follows: T7, T7 RNA polymerase promoter; CelS, cellulase gene;

Amp, ampicillin resistance gene; Ori-f1, f1 origin; Ori, replication

origin of plasmid pBR322.

(3)

확인되었는데

,

대장균에도입된

cellulase

유전자가

signal peptide

를부분을포함하고있음에도불구하고균체외로분비되지않았 음을알수있다

.

대장균에서

cellulase

또는이와유사한균체외 분비효소의외래유전자가발현될 경우일정량의효소가균체외 부로 분비되는경우가 다수보고된 바가 있다

. B. licheniformis

의내열성 α

-amylase

유전자는

T7 promoter

를이용하여대장균 에서과잉발현되었을때생산된효소가균체외로분비되며대 장균분비계가 α

-amylase

의

signal peptide

를인지할 수있는것 으로알려졌고

(19), B. licheniformis

의

endo-

^β

-1,3-1,4-glucanase

^도

대장균에서생상될때약

40%

이상이균체외로분리된다고보 고되었다

(15).

^또한

pUC19

^에^크로닝된

WL-12 cellulase

^유전자

로형질전환시킨대장균에서도생산된

cellulase

일부가균체외 로분비되었고

(

결과 미제시

), B. subtilis

형질전환주는배양상등 액에

WL-12 cellulase

를

7 U/ml

로생산하였다

(23).

이와는 달리

E. coli BL21(DE3)/pPES3

에서생산된

cellulase

가분비되지않은 것은

WL-12

의

cellulase

특성이기보다는

IPTG

를첨가한후배 양온도를

25

^o

C

로낮추어

signal peptide

가효과적으로 제거되지 못한 때문으로 여겨진다

. B. subtilis

의

mannanase

유전자를

T7 promoter

에도입하여

BL21(DE3)

에서

IPTG

를첨가하여

37

^o

C

에 서과잉발현을유도하였을때

signal peptide

^를^포함하지^않는^유

전자는 균체 내에 과량의

mannanse

를 생산하였으나

, signal

peptide

^를^포함한 ^유전자는^거의

mannanase

^를^생산하지^않은^것

으로확인된바있다

(11).

한편최근에

B. subtilis 1N

의

2

개

cel- lulases

^유전자를

T7 promoter

^에^도입하여

BL21(DE3)

^에서 ^발현

하였을 때생산성이 배양액 기준으로

0.52 U/ml

과

0.22 U/ml

로 확인된것에 비하면

(13)

대장균에서

WL-12

의

celllulase

생산성 은훨씬높은것을알수있다

.

Cellulase의 정제

BL21(DE3)/pPES3

로부터 생산된

cellulase

를

SDS-PAGE

에서 활성염색을실시한결과

3

^종류^이상의^활성

bands

^가^{확인되었다}

(

결과미제시

). WL-12

의

cellulase

가한개의활성영역과한개의

cellulose binding domain (CBD)

^으로 ^구성되어 ^있고^{대장균에서}

생산된

cellulase

의

C-

말단에 존재하는

CBD

가분해되어도 활성

영역은

cellulase

^활성을 ^유지할 ^수 ^있으므로 ^여러 ^개의 ^활성

bands

가관찰된것으로여겨진다

.

이러한현상은다른균주유래

의

cellulases

를대장균에서 발현하였을 때도보고된 바있고

(3,

9),

이미

WL-12 cellulase

유전자를

B. subtilis

에 발현시켰을때 도

2

개 이상의 활성

bands

가 관찰된 바 있다

(23).

그런데

B. licheniformis B-41361

의

cellulase

를 대장균에서 과잉 발현하여

불용성단백질로존재할 경우

proteolysis

를받지않는다는사실

이밝혀졌다

(3).

Cellulase

를 정제하기 위해서 대장균 균체 파쇄상등액을

ammonium sulfate (30%~70%)

^로 ^분획하여 ^얻은 ^단백질을

DEAE-Sepharose

컬럼 크로마토그래피로 정제하였는데

resin

에

결합되지 않고 그대로 용출되는

cellulase

^와

resin

^에 ^결합되어

NaCl

농도구배를 주었을 때용출되는

cellluase

로구별되었다

.

SDS-PAGE

로활성염색을하여

resin

에결합되지않은효소와결

합된효소를비교하였을때

resin

에결합되지않은

cellulase

는크 기가 작은 것으로 확인되었다

.

본 연구에서는 크기가 큰

cellulase

를정제하기위해

NaCl

로용출한분획중

cellulase

활성 을보이는 분획을

ultrafiltration

으로농축하고 이를

Q-Sepharose

컬럼크로마토그래피로정제하였다

. Q-Sepharose

에결합된단백

질을

NaCl

^로 ^용출한 ^후^{활성분획을} ^모아 ^농축하여

SDS-PAGE

로분석한결과

Fig. 2

에보인바와 같이분자량이약

49.5 kDa

인

cellulase

^가 ^{확인되었는데} ^이는 ^{대장균에서} ^정제된

B. licheniformis NBL420

의

cellulase-chitosanase

의분자량과 동일하

였다

(8).

^유전자의 ^{염기서열에서} ^유추되는

cellulase

^의 ^분자량은

56.8 kDa

과비교해 보았을때정제된 단백질은 그크기가 약

7 kDa

작은 것으로 보아

signal peptide

지역이나

C-

말단 지역의 일부가 절단되었을 것으로 추정된다

.

대장균에서 정제된

B- 41361 cellulase

는 분자량이

42 kDa

으로 유전자로부터 예측되는 단백질의 분자량보다 약

15 kDa

이작은 것으로보고되었다

(3).

그런데

B. licheniformis B-41361

의배양상등액에서도여러개의

cellulase

^활성^단백질

bands

^가^{관찰되었으나}

,

^분자량이

35 kDa

^에

해당하는단백질이

cellulase

활성이가장높은것으로보고되었

다

(2).

^유전자 ^서열에서 ^분자량이

27.4 kDa

^으로 ^유추된

B. licheniformis

의

cellulase

나

(15)

많은

Bacillus

유래의

cellulases

의 분자량

(<42 kDa)

^보다는 ^재조합 ^{대장균에서} ^생산된

WL-12

^의

cellulase

는분자량이큰것을 알수있다

.

한편

BL21(DE3)

에서 과잉발현된

B. subtilis 1N(13)

의

cellulase

는분자량이

54 kDa

로 확인되었으며

B. stearothermophilus No. 236

의배양상등액에서 정제된

cellulase

는분자량이

95 kDa

에이르는것으로보고되었다

(10).

Fig. 2. SDS-PAGE of the cellulase purified from recombinant E. coli . Lane 1, the molecular weight markers; 2, the purified enzyme.

Molecular size is shown in kilodaltons to the left side of the gel.

(4)

Cellulase의 반응특성

대장균이생산한

WL-12

의

cellulase

활성에미치는반응온도와 반응

pH

의 영향을 분석하였다

.

그 결과

WL-12

의

cellulase

는

55

^o

C

^와

pH 5.5

^에서 ^최대의 ^활성을 ^보였다

(Fig. 3). B.

licheniformis B-41361

배양상등액에서 정제된 분자량

35 kDa

의

cellulase

^와^{대장균에서}^정제된

42 kDa

^의

cellulase

^는^모두

65

^o

C

^와

pH 6.0

에서 최대활성을 보여

WL-12

의

cellulase

와는 다른 것으 로보고되었다

(2, 3).

^그런데

Bacillus

유래의

cellulases

^는^반응온

도가

50~70

^o

C,

반응

pH

는

5.0~7.0

범위에서 최대활성을보이는 효소가다수인 것을 보면

WL-12

의

cellulase

는

Bacillus

유래의

일반적인

cellulase

특성을보이는것으로판단된다

.

또한열안정

성을분석하기위해온도를달리하여효소액을

3

시간방치하면 서시간별로잔존활성을측정한 결과

50

^o

C

에서는

3

시간까지안 정하였으나

55

^o

C

이상에서는

1

시간방치후에도급격히효소활 성이실활되었으며

3

^시간^방치^후에^실활된 ^정도와^{유사하였다}

(Fig. 4). WL-12 cellulase

는 열안정성은

B-41351

과

B. amyloliquefaciens DL-3

^의 ^효소에 ^비해 ^낮은 ^편이며

(3, 12), NBL420

이나

Bacillus sp. CH43

과

HR68

의효소와는유사하였다

(8, 16).

^최적반응^조건에서

CMC

^를^기질로 ^하여^정제된

WL-12 cellulase

를반응하였을때효소비활성은

163 U/mg

으로확인되었 으며 이는 대장균에서 생산된

B-41351

의

cellulase

비활성

(60.7 U/mg)

보다는 높고

B-41351

의 배양상등액에서 정제된

35 kDa cellulase

의비활성

(183 U/mg)

과는유사하며

,

최근에정제 된

DL-3

의

cellulase

비활성

(6,070 U/mg)

보다는매우낮았다

.

금속이온이나화합물이

cellulase

활성에미치는영향을조사하

기위해반응액에

5 mM

^의^농도로^첨가하여^정제된^효소로^반응

을실시하였다

. Table 1

에보인바와같이

SDS

의존재하에서는 효소활성이거의대부분저해되었으며

,

^대부분의^다른^화합물은

적은범위에서효소활성을저해또는증가시키는것으로나타났 다

. Cu

²⁺은

B. licheniformis B-41361

의

cellulase

와는 달리

WL- 12

의

cellulase

활성을 증가시켰고

, WL-12

의

cellulase

활성에거 의영향을 미치지않는

Mn

²⁺은

cellulase

종류에따라그활성에 미치는 영향이 다양한것으로 보고되었다

(3, 10, 12, 16).

또한

EDTA

는 대부분의

Bacillus

유래의 효소와 같이

WL-12

의

cellulase

^활성을^저해하지^않았지만

, DL-3

^의

cellulase

^활성을^상

당히 저해하였고

B. subtilis AH18

의

cellulase

의 활성도저해하 였다

(12, 22).

기질특이성과 반응산물

정제된 효소를 이용하여

CMC

를비롯한 여러 다당류의가수

Fig. 3. Effects of reaction temperature and pH on the cellulase.

Temperature profile (

■

) was obtained by measuring the cellulase activities at different temperatures and pH 5.5. The reactions was done at 55

^o

C and various pHs for determining the pH profile (dotted line).

Buffers used were as follows: sodium citrate (

^●

), sodium phosphate (

○

), Tris (

▼

).

Fig. 4. Thermostability of the cellulase. The residual relative activity was determined by measuring after preincubation for 3 h at various temperatures with a fixed pH 6.5.

Table 1. Effects of metal ions and other reagents on the cellulase activity

Effector (5 mM) Relative activity (%)

None 100.0

KCl 101.3

NiCl

2

106.4 MgCl

2

97.7 MnCl

2

98.4 CaCl

2

97.0 CuCl

2

119.5 FeCl

2

98.0 FeCl

3

95.8 EDTA 94.0

SDS 0.0

(5)

분해활성을비교하였다

.

^{효소반응에}^사용된^다당류는^모두^반응

액에

0.5%

농도로하여실험을실시하였는데

,

정제된

cellulase

는

glucose

^가 ^β

-1,4

^결합으로^구성된

CMC

^의^{가수분해능보다} ^β

-1,3- 1,4

결합으로이루어진

barley

β

-glucan

에대한가수분해능이

2

배

이상 높았으며

lichenan

^에 ^대한 ^{가수분해능은}

CMC

^분해능의

83%

에 이르렀다

(Table 2). Lichenan

과

barley

β

-glucan

은 모두

glucose

^가^β

-1,3-1,4

^결합에^하고^있지만^β

-1,3

^결합과^β

-1,4

^결합

의비율이 차이가 있으며

lichenan

은

barley

β

-glucan lichenan

에 비해 β

-1,3

결합의 비율이 높다

. Locust bean gum

이나

oat spelt xylan

은

cellulase

에의해가수분해가일어나지않은것으로보아

WL-12

의

cellulase

는

mannanase

와

xylanase

활성은 없는것으로 확인되었다

. Konjac

^은

glucomannan

^다당류로 ^구성되어 ^있는데

cellulase

의경우

glucose

잔기간의결합을분해하고

mannanase

의

경우는

mannose

^잔기간의^결합을 ^분해할^수^있다

.

^따라서

WL-

12 cellulase

가

locust bean gum

을 분해하지 못하면서

konjac

의

분해능을보이는것은

cellulase

활성에의한것임을알수있다

.

WL-12

의

cellulase

는

CMC

보다 β

-glucan

의 분해능이 높은

Bacillus sp. CH43

과

HR68

의

cellulases

와유사한 기질특이성을 보였다

(16).

그러나

B-41351

과

DL-3

의

cellulase

도β

-glucan

을분 해하지만

CMC

보다는 분해활성이 낮았으며

(3, 12), DL-3

와

B. stearothermophilus No. 236

^은

WL-12

^의

cellulase

^와는^달리

xylan

을 분해하는 것으로 보고되었다

(22).

한편

p -nitrophenyl-

β

- glycosides

^를^기질로^하여^분해력을^조사한 ^결과

p -nitrophenyl-

^β

- cellobioside

는분해하였지만 β

-xylosidase

와 β

-galactosidase

활성 뿐 아니라 β

-glucosidase

^의 ^활성은 ^없었다

.

^실제 ^많은

cellulases

가

p -nitrophenyl-

β

-cellobioside

은 분해하지만

p -nitrophenyl-

β

- glucoside

는분해하지못하는것으로알려졌다

(3, 9, 12, 22).

Cellulase

에 의한 가수분해 산물을 분석하기 위해 기질로

glucose

의 중합도가 다른

cellobiose, cellotriose, cellotetraose

그

리고

cellopentaose

를사용하여과량의효소를 처리한후가수분

해산물을

TLC

로조사하였다

.

그결과

cellobiose

는전혀분해되 지않았으나중합도가

3

개이상인올리고당은모두분해되는것 으로 나타났으며

cellotriose

의분해정도가 가장 낮았다

(Fig. 5).

Cellopentaose, cellotetraose

^와

cellotriose

^의^최종 ^{가수분해산물로}

는

B-41351

의

cellulase

와 유사하게

glucose

는 생성되지 않고

cellobiose

^와

cellotriose

^가 ^{생성되지만}

, B-41351

^과는 ^달리

cellobiose

가

cellotriose

보다 많은 것으로 나타났다

(3).

특히

B- 41351

^의

cellulase

^는

cellotriose

^를 ^분해하지 ^못하지만

WL-12

^의

cellulase

는이를분해하였다

.

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Substrates Relative activity (%)

Carboxymethylcellulose 100

Konjac 176

Barley

β

-glucan 292

Lichenan 83

Locust bean gum ND

Oat spelt xylan ND

p -Nitrophenyl-

β

-celobioside 19

p -Nitrophenyl-

β

-glucoside ND

p -Nitrophenyl-

β

-xyloside ND

p -Nitrophenyl-

β

-galactoside ND

ND, not detected.

Fig. 5. Thin-layer chromatogram of hydrolysis products of

β

-1,4-

linked cellooligosaccharides. The reaction mixtures containing the

purified cellulase and cellooligosacchrides in 50 mm sodium citrate

buffer (pH 5.5) were incubated at 50

^o

C. Reaction products were

analyzed from reaction mixtures before (lanes C2B, C3B, C4B, and

C5B) and after reaction (C2A, C3A, C4A, and C5A). C2 to C5

represent for cellobiose, cellotrisoe, cellotetraose, and cellopentaose,

and G for glucose.

(6)

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(Received August 10, 2009/Accepted September 1, 2009)

ABSTRACT: Properties of a Bacillus licheniformis Cellulase Produced by Recombinant Escherichia coli Jong Duk Park, Yeon A Kim, and Ki-Hong Yoon* (Department of Food Science and Bio- technology, Woosong University, Daejeon 300-718, Republic of Korea)

Carboxymethyl celluase (cellulase) was purified from cell-free extract of the recombinant Escherichia coli car-

rying a Bacillus licheniformis WL-12 cellulase gene by DEAE-Sepharose and phenyl-Sepharose column chro-

matography with specific activity of 163 U/mg protein. The molecular mass of the purified enzyme was

estimated to be approximately 49.5 kDa by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. The

enzyme had a pH optimum at 5.5 and a temperature optimum at 55

^o

C. The activity of the enzyme was com-

pletely inhibited by SDS (5 mM), and slightly enhanced by Cu

²⁺

(5 mM). The cellulase was active on CMC,

konjac, barely glucan and lichenan, while it did not exhibit activity towards xylan, locust bean gum, and p-nitro-

phenyl-

^β