Antioxidant Activity and Protective Effects of 9-hydroxy-$\alpha$-tocopherone from Viola mandshurica Extracts

41(3) : 166∼ 173 (2010)

166

제비꽃(Viola mandshurica) 추출물로부터 분리된 9-hydroxy-α-tocopherone의 항산화 활성 및 세포 보호효과

이미라·황지환¹·박재희²·김현정·박은주²·박해룡^*

경남대학교 식품생명학과, ¹일본 산업기술종합연구소, ²경남대학교 식품영양학과

Antioxidant Activity and Protective Effects of 9-hydroxy-α-tocopherone from Viola mandshurica Extracts

Mi-Ra Lee, Ji-Hwan Hwang¹, Jae-Hee Park², Hyun-Jung Kim, Eunju Park² and Hae-Ryong Park*

Department of Food Science and Biotechnology, Kyungnam University, Masan 631-701, Korea

1National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), 2-42 Aomi, Koto-ku, Tokyo 135-0064, Japan

2Department of Food and Nutrition, Kyungnam University, Masan 631-701, Korea

Abstract − Oxidative stress to proteins, lipids, or DNA is higher in human autopsy tissue and in rodent models of a number of neurodegenerative conditions, including Alzheimer's and Parkinson's disease. On the basis of this information, we established a screening system using N18-RE-105 cells to identify therapeutic agents that can protect cells from glutamate toxicity. During the course of our screening program, we recently isolated the active compound 9-hydroxy-α-tocopherone (α-TP), which pre- vents glutamate-induced cell death, from Viola mandshurica. The chemical structure of α-TP was identified using spectroscopic methods and by comparison with literature values. Antioxidant activity and protective effects of α-TP were evaluated by DPPH radical-scavenging assay, morphological assay, MTT reduction assay, and lactate dehydrogenase (LDH) release assay. These results suggest that α-TP could be a new potential chemotherapeutic agent against neuronal diseases.

Key words − 9-hydroxy-α-tocopherone, Viola mandshurica, glutamate, antioxidant activity, protective effect, N18-RE-105 cells

최근 생활환경과 식생활 패턴의 변화 등으로 현대인들은 생체조직의 노화를 비롯한 퇴행성 신경질환에 관심이 커지 고 있으며, 그 원인이 활성산소(free radical, oxygen radical) 에 기인된 것이라는 산소 유해설이 점차 인정받고 있다.^1,2) 이러한 활성산소를 조절할 수 있는 항산화제의 개발과 연 구에 더 많은 관심이 집중되고 있다.^3,4) 인체는 정상적인 상 태에서 superoxide dismutase (SOD), catalase, glutathione peroxidase 등 항산화 효소와 glutathione (GSH), uric acid 등의 여러 가지 비효소적 항산화 물질들에 의해 활성산소 의 축척이나 해로운 산화작용을 막음으로 인해 활성산소 생 성과 항산화 효소에 의한 제거작용이 균형을 이루고 있다.

그러나 활성산소들은 불안정하고 산화력이 높아 여러 생체 물질과 쉽게 반응하기 때문에 인체 내에서 제거되지 못하 면 산화적 스트레스를 유발하게 되며 동맥경화 및 당뇨병 등 각종 질병을 일으킬 뿐만 아니라 생체 대사과정에서 세

포막 지질을 과산화시키고 세포막 투과성의 변화를 초래하 여 DNA 손상을 유발시킨다.^5-8) 특히, 다른 장기에 비해서 뇌는 대사를 위한 산소 이용률이 높고 과산화지질의 함량 도 높은 반면에 활성산소에 대한 산화방지 효소계나 저분 자의 산화방지제가 타 조직에 비해 상대적으로 적은 관계 로 유해 활성산소나 라디칼에 의한 산화적 손상에 대하여 매우 약하기 때문에 쉽게 신경세포 사멸 유도하는 것으로 보고되어져 있다.^9-11)

한편, 최근에는 이와 같은 유해 활성산소나 라디칼을 제 거함으로써 질병을 치료하려는 시도가 활발해지고 있으며 이러한 활성산소를 조절할 수 있는 항산화제의 효능이 있 는 다양한 소재들이 주목 받고 있다.^12-15) 특히 안전성 문제 로 사용이 제한되고 있는 합성소재들에 비해 생체 기원의 안전한 천연자원으로부터 항산화 활성이 뛰어나면서 신경 세포 보호효과를 가지는 치료제의 개발에 대한 관심이 높 아지고 있는 실정이다.^16,17)

본 연구팀에서는 국내, 외에서 자생하고 있는 약용식물

*교신저자(E-mail):[email protected] (Tel): +82-55-249-2689

추출물을 대상으로 뇌신경세포계 hybridoma N18-RE-105 세포를 이용하여 고농도의 glutamate로부터 유도되는 산화 적 스트레스로부터 세포보호 효과를 갖는 천연물의 탐색을 시도하였다. 그 결과 제비꽃(Viola mandshurica) 추출물로부 터 강력한 항산화 활성 및 세포보호 효과를 확인할 수 있었 다. 제비꽃은 다년생 표본으로 줄기가 없고 잎은 뿌리로부 터 총생하며 엽병이 길고 날개가 있다. 꽃은 보통 4~5월에 농자색으로 피며 과실은 원추형으로 성숙하면 3열로 갈라 지며 다갈색의 종자가 튀겨서 나간다. 주요성분은 지상부에 flavone 배당체¹⁸⁾로 orientin, isoorientin 등이 함유되어 있으 며, 약리작용으로는 적리균, 황색포도상구균, 폐렴구균, 피 부진균, 결핵간균의 성장 억제 및 소염 효과 등이 알려져 있 다. 하지만 제비꽃에 관한 생리·약리학적 연구는 아직 초 보적인 단계에 불과하며, 특히 신경세포 보호효과와 관련된 연구는 수행된 바가 없다. 본 연구팀은 제비꽃 추출물로부 터 항산화 활성 및 세포 보호효과를 가지는 생리활성물질 을 분리하고자 제비꽃의 acetone 추출물을 hexane, diethyl ether, ethyl acetate 및 물 층으로 순차적 분획하여 silica gel column chromatography를 실시하여 비극성이 높은 물질 순 으로 분리하였다. 최종적으로 HPLC를 실시하여 단일물질 로 분리한 다음, 이 활성물질을 JBK-1이라 명명하였다. 활 성물질 JBK-1의 화학 구조를 결정하기 위해 UV, HR-ESI- Mass, NMR spectrum 분석을 실시하였다. 그 결과, 활성물 질 JBK-1의 화학 구조는 α-tocopherol의 유도체인 9-hydroxy- α-tocopherone (α-TP)으로 동정되었다.

본 연구에서는 제비꽃 추출물로부터 분리된 활성물질 α- TP의 항산화 활성 및 세포 보호효과를 확인함으로써 인구 고령화와 더불어 사회적 문제가 되고 있는 퇴행성 신경질 환의 치료제로써의 가능성을 제시하고자 한다.

재료 및 방법

시약 및 실험재료 − 본 실험에서 사용된 제비꽃은 경상남 도 산청군 지리산 근처에서 채집하여 음건, 추출하여 실험 에 사용하였다. 세포 보호효과 실험에 사용된 시약으로 L- glutamic acid, MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide), ascorbic acid는 Sigma Chemical Co.

(St. Louis, MO, USA) 제품을 구입하였으며, LDH (Lactate dehydrogenase) release assay kit는 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (Osaka, Japan)로부터 구입하였다. 세포주 배 양을 위해 필요한 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), horse serum (HS) 및 HAT supplement 등은 Gibco-BRL (Grand Island, NT, USA)에서 구입하였다. 시료 추출용 유기용매는 99% 이상 의 1급 시약(Daejung Chemical, Ltd, Korea)으로 ethanol, hexane, diethyl ether, ethyl acetate 등을 사용하였고, HPLC

분석용매는 Baker사(USA)의 특급용매를 사용하였으며, 그 외 연구에 사용된 용매 및 시약은 모두 일급 이상의 등급을 사용하였다.

세포주 및 배양 − 본 실험에 사용된 세포주는 hybridoma N18-RE-105로써 한국생명공학연구원에서 분양 받아 사용 하였다. 사용된 배지는 DMEM medium에 10% FBS, 5%

HS 및 1 × HAT supplement를 첨가하여 사용하였고, 95%의 습도가 유지되는 37^oC, 5% CO₂ incubator (MCO-18AIC, SANYO, Osaka, Japan)에서 배양하였다.

추출 및 분리 − 건조된 제비꽃 500 g에 acetone 10 L을 가하여 3일 동안 상온에서 침출시켜 추출한 후, 여지(5C.

110 mm, Advantec, Tokyo, Japan)로 여과하여 불순물을 제 거하고, 이 여액을 감압농축기(EYELA N-1000, Tokyo, Japan)로 감압 농축하여 acetone 추출물을 얻었다. Acetone 추출물의 극성을 각각 달리하여 hexane, diethyl ether, ethyl acetate 및 water로 순차적으로 용매 분획하여 bioassay를 해 본 결과 hexane 층에서 활성을 확인하였다. 다음으로 CHCl₃ : MeOH = 100 : 1의 전개 용매를 이용하여 silica gel column chromatography를 실시하였다. 활성이 우수한 부분 을 모아서 HPLC를 실시한 결과, 90% MeOH와 UV 254 nm 의 조건에서 활성물질의 peak을 확인할 수 있었으며, 이를 JBK-1이라 명명하였다(Fig. 1).

JBK-1의 구조 결정 − 제비꽃 acetone 추출물로부터 순수 분리된 활성물질 JBK-1은 황색 분말로서, HR-ESI-Mass spectrum의 분석 결과, negative mode [M-H]^-에서 445의 분 자이온의 peak가 나타났으며, positive mode [M-H₂O]⁺에서 429의 ion fragment peak가 검출되었다(Fig. 2). 이상의 Mass spectrum 결과로부터 JBK-1의 분자량은 446으로, 분 자식은 C₂₉H₅₀O₃로 결정되었다. 그리고 UV spectrum 분석 결과, JBK-1은 292 nm (aqueous acetonitrile)에서 최대 흡수

Fig. 1. Isolation procedure of JBK-1.

파장을 보이고 있었으며, 230 nm (aqueous acetonitrile)에서 shoulder가 관측되었다. 이것은 α-tocopherol의 특징적인 자 외선 최대 흡수파장으로, 292와 230 nm에서 관측된 spectrum 을 통해 JBK-1의 구조가 항산화 활성으로 알려져 있는 α-

tocopherol의 유도체일 가능성이 제시되었다(Fig. 3).¹⁹⁾ 이상 의 spectrum 결과를 바탕으로 구조 동정을 해본 결과, JBK- 1은 최종적으로 α-tocopherol의 산화형 유도체인 9-hydroxy- α-tocopherone (α-TP)으로 동정되었다(Fig. 4).²⁰⁾α-TP는 현 재까지 α-tocopherol로부터 산화적 유기합성 방법에 의한 보 고가 있었지만, 천연물로서는 전혀 보고되어 있지 않았고, 제비꽃 추출물로부터 최초로 분리되었다.

DPPH 라디칼 소거능 측정 − DPPH (2,2,-diphenyl-1- picrylhydrazyl) 라디칼 소거능은 Mensor 등^21,22)의 방법에 준 하여 시료 20 µL에 0.2 mM의 DPPH 용액 80 µL를 가하여 10초 동안 강하게 진탕하여 실온에서 10분 동안 방치한 후, 492 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료의 라디칼 소거 능은 아래의 식에 의해 계산하였으며, 시료 첨가구와 대조 구 간의 흡광도 차이를 백분율로 나타내었다. Vitamin C는 positive control로 사용하였다.

라디칼 소거능(%) = (1 − 시료의 흡광도/대조구의 흡광도) 라디칼 소거능(%) = × 100

총 항산화능(Total radical trrapping antioxidant potential, TRAP) 측정 − 시료의 총항산화능(TRAP)은 Rice-Evans와 Miller²³⁾의 inhibition assay 방법에 따라 분석하였다. 이 방 법은 ABTS[2,2'-azinobis (3-ethylbenzothiazolin 6-sulfonate), 150µM]와 metmyoglobin (2.5 µM)을 H₂O₂ (75µM)로 활성 화시킴으로써 생성된 ferry myoglobin radical species와의 Fig. 2. HR-ESI-Mass spectrum of JBK-1.

Fig. 3. UV spectrum of JBK-1.

Fig. 4. Structure of 9-hydroxy-a-tocopherone (α-TP).

상호작용에 의해 형성된 ABTS radical cation의 흡광도를 측정하는데 기초를 두고 있으며, 그 흡광도의 억제정도는 시료에 들어 있는 항산화능에 비례하게 된다. 10 µL의 시료 (100, 500, 1000µg/mL), 음성대조구 (PBS) 또는 Trolox standard를 ABTS radical cation과 5분 동안 30^oC에서 배양 하면서 흡광도의 변화를 UV/VIS spectrophotometer로 734 nm의 파장에서 측정하였다. 시료의 trap 농도는 trolox 의 calibration curve를 이용하여 계산하였으며 TEAC (Trolox equivalent antioxidant capacity, mM)로 표현하였다.

세포의 형태학적 변화 관찰 − α-TP와 20 mM의 glutamate 의 처리에 대한 N18-RE-105 세포의 형태학적인 변화에 대 한 관찰을 위해 세포를 6-well plate에 1 × 10⁵cells/mL로 분 주하여 24시간 배양하여 phase-contrast microscope (TS 100-F, Nikon, Tokyo, Japan)로 각 well의 세포 형태를 관찰 하고 100배로 사진 촬영하였다.

MTT reduction assay− 세포 보호효과를 측정하기 위하 여 MTT reduction assay를 실시하였다. N18-RE-105 세포 를 5 × 10⁴ cells/mL로 맞추고 96-well plate에 각각 100 µL 씩 첨가하여 24시간 동안 37^oC, 5% CO₂ incubator에서 배 양하였다. α-TP와 20 mM glutamate를 처리하여 24시간 배 양한 후 각 well에 PBS 완충액에 녹인 MTT (5 mg/mL) 용 액을 10 µL씩 첨가하여 1시간 동안 다시 배양하였다. 반응 후 well 바닥에 형성된 formazan이 흩어지지 않게 상등액을 제거하고 DMSO 100 µL 첨가하여 녹이고 ELISA reader (Model 680, BioRad, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광 도를 측정하였다. 대조구 세포수를 100%로 하였을 때 상대 적인 세포생존율을 구하였다.

LDH release assay− 세포 보호효과를 측정하기 위한 방법으로 LDH (lactate dehydrogenase) release assay를 실 시하였다. N18-RE-105 세포를 5 × 10⁴ cells/mL로 맞춘 후, 100µL씩 96-well plate에 분주하여 CO₂ incubator에서 24시 간 동안 배양하였다. α-TP와 20 mM glutamate를 처리하여 24시간 배양한 후 배양액을 새로운 96-well plate에 50 µL 분주하고, 이 배양액에 LDH reagent를 50 µL씩 첨가하여 상온에서 정치시킨 후, 20분간 반응시켰다. 반응이 완료되 면 stop solution인 1 N HCl을 100 µL씩 첨가하여 반응을 중지시킨 후, ELISA reader를 이용하여 540 nm에서 흡광 도를 측정하였다. 살아남은 세포의 LDH 측정을 위해 배양 액을 제거한 후, 0.5% Triton X-100 용액을 50 µL 첨가하 여 40 rpm으로 10분 동안 shaking시켜 세포벽을 깨트린 다 음, 같은 방법으로 LDH reagent 50 µL를 첨가하여 반응시 키고, 반응이 끝나면 반응 정지액을 넣은 뒤, 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. LDH에 의한 세포독성의 백분율은 배 양액과 살아있는 세포에서 유리된 총 LDH에 대한 배양액 으로부터 유리된 LDH의 값으로 계산하여 glutamate 실험 군과 비교한 값을 나타내었다.

Hoechst 33342 염색 − N18-RE-105 세포주의 apoptosis 유도 활성을 측정하기 위하여 Hoechst 33342로 세포의 핵 을 염색하였다. 6-well plate에 1 × 10⁵ cells/well로 24시간 동안 배양하여 α-TP를 50, 100 ng/mL 농도로 처리한 후, 20 mM glutamate를 처리하여 24시간 반응하였다. PBS 완 충용액으로 2회 세척하고 10% formalin을 처리하여 2시간 고정한 후 다시 PBS 완충용액으로 세척하고 Hoechst 33342 (Sigma)로 30분 동안 염색하였다. 염색 후 PBS 완충용액으 로 세척하고 형광현미경으로 각 well의 세포를 관찰하고 400 배로 사진 촬영하였다.

통계처리 − 모든 자료의 처리는 SPSS-PC+ 통계 package 를 사용하여 처리하였다. 각 항목에 따라 백분율과 평균치

± 표준편차(SD)를 구하고 각 추출물의 세포독성 정도를 비 교하기 위해 one-way 분산분석(ANOVA)을 시행하여 F값을 구하고 Scheffe's test를 이용하여 대조군과 각 구간의 유의 성 차이를 검증하였다. 통계적 유의성은 5% 수준에서 평가 하였다.

결과 및 고찰

α-TP의 항산화 효과 − DPPH 라디칼 소거능은 항산화성 분이 안정한 free radical DPPH에 전자를 공여하여 자색이 탈색되어 노란색으로 변하면서 라디칼의 소거되는 정도를 측정한 것이다.²⁴⁾제비꽃 추출물에서 분리된 α-TP의 라디 칼 소거능을 비교한 결과는 Table I과 같다. α-TP 1000 µg/

mL의 농도에서 52.5%로 가장 높은 라디칼 소거활성을 나 타내었으며, 다음으로 500, 100, 50 µg/mL에서는 각각 43.5, 12.7, 5.5%의 활성을 보여, 농도 의존적인 결과를 나타내었 다. 최고 농도인 1000 µg/mL에서 positive control로 사용된 vitamin C (1000µg/mL에서 72.7%)와 비교 시, α-TP는 비 교적 높은 라디칼 소거활성을 보였다. Bondet 등은²⁵⁾ DPPH 라디칼의 환원 정도는 항산화성분에 함유된 hydroxyl기의 수에 의존하는 것으로 보고하고 있어, α-TP의 DPPH 라디 칼 소거능은 α-TP 구조에 존재하는 hydroxy기가 DPPH 라 디칼에 수소 원자를 공여함으로 인해 나타난 것으로 생각 된다.

Table I. DPPH radical-scavenging activity (RSA) of α-TP

Concentration (µg/mL)

50 100 500 1000

RSA (%)¹⁾ 5.5±0.9^a2) 12.7±1.6^b 43.5±1.6^c 52.5±0.9^d

1)

RSA (%) = (1- absorbance of sample/absorbance of the control) × 100

2)

Values are expressed as mean ± standard error of triplicate

experiments. Values not sharing the same letter are

significantly different from one another by Duncan multiple

range test (p<0.05).

α-TP의 총항산화능(TRAP)을 100-1000 µg/mL의 농도에 서 측정한 결과는 Fig. 5과 같다. α-TP의 농도가 증가함에 따라 TRAP 활성도 증가하였으며, 1000 µg/mL에서는 1.16 mM trolox 당량의 활성을 나타내었다. Hydroxy기를 함 유한 단일 성분 catechin과 catechol의 TRAP 활성은 2.02와 1.42 mM로 보고되고 있어,^26,27) α-TP의 항산화능은 다른 단 일 성분들과 유사한 것으로 사료된다. TRAP은 항산화성분 에 의해 소거되는 라디칼의 양을 평가하기 위해 사용되는 방법으로,²⁸⁾ 빠르고, 간편하고 항산화제의 생물학적 활성과 상관성이 있는 것으로 보고되고 있다.²⁹⁾

α-TP의 세포 보호효과 − α-TP의 glutamate에 의해 유도 된 산화적 스트레스 상태에서 N18-RE-105 세포에 대한 세

포 보호효과에 대한 결과는 Fig. 6과 7로 나타내었다.

Glutamate는 신경계에서 가장 흔한 흥분성 신경전달물질로 작용하지만 시냅스 간극(synaptic cleft)에 과량 축적되면 glutamate 수용체들이 과도하게 활성화될 뿐 아니라 mitochondria의 흡수, 저장능력에 이상이 생김으로 인해서 Ca²⁺가 세포 안으로 유입되게 되어 nNOS (neuronal nitric oxide)가 활성화됨으로 인해서 과량의 NO를 생성하여 superoxide와 결합하여 강력한 산화제인 peroxinitrie가 생성

된다.^30,31) 이렇게 생성된 peroxinitrie는 세포내 손상, DNA

손상, PARP-1 활성화를 초래하게 되고 특히 PARP-1 활성 화는 NAD를 기질로 하여 poly (ADP-ribosyl) action을 촉 매하여 세포내 NAD와 ATP의 고갈로 인한 AIF의 활성화

Fig. 5. Total radical trapping antioxidant potential of α-TP.

Values are mean with standard error of triplicate experiments.

Values not sharing the same letter are significantly different from one another (p<0.05) by Duncan's multiple range test.

Fig. 6. Morphological changes in glutamate-stressed N18-RE- 105 cells. The cells were exposed to 50 and 100 ng/mL of α- TP and morphological changes were monitored for 24 hr (a:

control, b: 20 mM glutamate, c: 20 mM glutamate/50 ng/mL α-TP, d: 20 mM glutamate/100 ng/mL α-TP). Photographs were taken with a phase-contrast microscope at 100 × magnification.

Fig. 7. Protective effect of α-TP on glutamate-stressed N18- RE-105 cells. (A) Cells were pretreated with α-TP at the indicated concentrations (50, 100 ng/mL) for 30 min prior to incubation with 20 mM glutamate for 24 hr. After MTT assay, the MTT reduction rate (mean ± SD of triplicate determination) were calculated by setting each of control survivals in the absence of glutamate and α-TP. (B) Cell viability was measured using LDH release assay in cells exposed to α-TP under glutamate-stressed conditions. N18-RE-105 cells pretreated for 30 min with various concentrations of α-TP. The cells were then treated with 20 mM of glutamate for 24 hr. Data were normalized to the activity of LDH release from vehicle-treated cell (100%). Values not sharing the same letter are significantly different from one another (p<0.05) by Duncan's multiple range test.

로 핵으로의 이동을 유도함으로써 DNA 절단, nuclear condensation을 유도하여 apoptosis를 초래하게 된다.³²⁾ 이렇 듯 강력한 세포사멸을 유도하는 glutamate의 세포독성으로 부터 α-TP의 세포 보호효과를 알아보기 위해 광학현미경하 에서 세포의 형태학적인 변화를 관찰하였다. 그 결과, Fig.

6과 같이 정상군에 비해 대조군은 스트레스로 인하여 신경 돌기가 거의 소멸된 양상을 보임으로써 신경세포가 형태학 적으로 큰 변화가 유도된 것을 확인할 수 있었으나, α-TP 를 50, 100 ng/mL 처리하였을 때 농도 의존적으로 세포의 생존을 확인할 수 있었다. 이러한 N18-RE-105 세포의 형태 학적인 변화를 통하여 α-TP가 glutamate에 의한 세포의 손 상을 억제하거나 보호하는 효과가 있다는 것을 확신할 수 있었다.

세포생존율 측정을 위해 MTT reduction assay 방법을 이 용하여 아무것도 처리하지 않은 정상군과 glutamate를 처리 한 대조군 그리고 glutamate와 α-TP를 농도별로 처리한 실 험군을 비교하였다. Fig. 7A의 결과와 같이, glutamate 처리 군의 세포생존율은 40.7%로 나타났으나, α-TP를 10, 50, 100 ng/mL의 농도로 세포에 처리했을 때의 세포생존율은 41.8, 51.6, 72.4%로 증가하였다.

또한 동일한 조건 하에서 세포손상의 정도를 확인하기 위 하여 세포 배양액 중에 들어있는 LDH (lactate dehydrogenase) 의 방출량을 측정한 결과는 Fig. 7B와 같다. LDH의 방출량 측정은 세포손상 정도를 확인하는 방법 중 하나로 세포외 LDH는 안정적 상태이므로 세포배양에서 방출된 LDH는 세 포손상의 정도와 비례관계를 가지게 된다. Glutamate가 처 리된 N18-RE-105 세포에 α-TP를 10, 50, 100 ng/mL로 처 리하여 glutamate 처리군과 비교한 결과, glutamate 단독 처 리군에서는 58%의 LDH를 방출하는 것을 확인할 수 있는 데 반해 α-TP 처리군에서는 LDH 방출량이 40.9%, 30.8%, 25.9% 로 감소하여 정상군의 수준으로 회복되었다는 것을 확인할 수 있었다. Glutamate가 세포에 손상을 끼침에 따라 세포막 파괴로 인해 LDH 방출량이 높은 것과 대조적으로 α-TP 처리군에서는 농도 의존적으로 glutamate가 유도하는 산화적 스트레스로 인한 세포손상으로부터 N18-RE-105 세 포를 보호함에 따라 효과적으로 LDH 방출량을 감소시키는 것을 확인할 수 있었다. 이 결과는 α-TP가 glutamate의 산 화적 스트레스로부터 유도되는 세포사를 강력하게 억제한 다는 것을 시사하고 있다.

α-TP의 apoptosis 억제효과 − Apoptosis는 다세포 생물 에서의 programmed cell death를 일컫는 용어로 세포의 죽 음에 관련되어 능동적으로 일어나는 세포의 죽음 과정 중 하나이다. Apoptosis가 일어나면 세포는 면역반응을 일으켜, 핵의 condensation 및 DNA가 일정한 크기로 조각나는 형 상을 비롯하여 세포질 속 세포소기관 및 세포막 등에서의 변화가 발생하여 세포가 사멸하게 되는 것으로 알려져 있

다. α-TP의 apoptosis 억제효과를 측정하기 위하여 핵의 변 화를 관찰하였다. 즉, 세포의 수축과 응축으로 인해 일어나 는 apoptotic body를 관찰하기 위해서 핵 내 DNA에 특이 적으로 결합하는 형광 염색체인 Hoechst 33342를 사용하여 핵을 염색하고 형광현미경으로 관찰하였다. Fig. 8과 같이 glutamate 처리군의 세포핵은 condensation과 fragmentation 으로 인한 apoptotic body가 핵 주변에 나타나는 전형적인 apoptosis 특징을 보이는 반면에 50, 100 ng/mL 농도의 α- TP를 처리했을 때 정상군과 유사하게 타원형의 온전한 핵 모양을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

이상의 결과로부터 제비꽃 추출물로부터 분리한 α-TP는 항산화 활성과 glutamate의 산화적 스트레스로부터 유도되 는 세포독성을 강력하게 억제하여 N18-RE-105 세포를 보 호하고 있다는 것을 확인할 수 있었으며, 인구 고령화와 더 불어 증가하고 있는 퇴행성 신경질환을 치료하거나 예방할 수 있는 치료제로써의 가능성을 제시하였다.

결 론

최근 노화를 비롯한 퇴행성 신경질환, 심혈관계 질환, 각 종 성인병 등의 주된 원인이 활성산소에 기인하다는 것이 인정됨에 따라 활성산소를 조절할 수 있는 항산화제의 개 발과 연구에 관심이 집중되고 있다. 본 연구에서는 제비꽃 (Viola mandshurica) 추출물에서 항산화 활성 및 세포 보호 Fig. 8. Inhibitory effect of α-TP on glutamate-induced apoptosis in N18-RE-105 cells. The cells were preincubated with α-TP at the indicated concentrations for 30 min. The cells were then stimulated with 20 mM of glutamate for 24 hr and then used for the cell staining with Hoechst 33342 (10µM) and examine by fluorescence microscope (Magnification ×400, a: control, b: 20 mM glutamate, c: 20 mM glutamate/50 ng/mL α-TP, d:

20 mM glutamate/100 ng/mL α-TP). The arrows indicate apoptotic cells.

효과를 확인하고 활성물질의 분리 및 정제를 실시하여, α- tocopherol의 유도체인 9-hydroxy-α-tocopherone (α-TP)을 분리하였다. α-TP의 항산화 활성을 알아보기 위해 DPPH 라디칼 소거능을 확인한 결과, 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 세포 보호효과를 확인하기 위 해 N18-RE-105 세포에 50, 100 ng/mL로 처리하여 형태학 적인 변화를 관찰한 결과, glutamate를 단독으로 처리한 대 조군에 비해 α-TP을 처리한 각 세포에서는 신경돌기의 출 현 유도를 통한 신경세포 생존을 확인할 수 있었다. MTT reduction assay에서도 동일하게 glutamate 단독 처리 시 40.7%의 세포생존율을 나타내는데 반하여 α-TP을 처리한 세포에서는 41.8, 51.6, 72.4%로 농도 의존적으로 세포가 회 복되는 것을 확인할 수 있었다. LDH release assay에서도 동일한 결과를 확인할 수 있었다.

사 사

이 연구결과물은 2010학년도 경남대학교 학술연구장려금 지원에 의한 것임.

인용문헌

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(2010. 7. 15 접수; 2010. 8. 6 심사; 2010. 9. 8 게재확정)