Anti-cancer Effects of Dendropanax Morbifera Extract in MCF-7 and MDA-MB-231 Cells

황칠나무 줄기 추출물의 MCF-7과 MDA-MB-231 유방암 세포주에 대한 세포증식억제 효과

대전대학교 한의과대학 부인과교실 임규정, 장새별, 유동열

ABSTRACT

Anti-cancer Effects of Dendropanax Morbifera Extract in MCF-7 and MDA-MB-231 Cells

Kyu-Jung Im, Sae-Byul Jang, Dong-Youl Yoo

Dept. of Oriental Gynecology, College of Oriental Medicine, Dae-Jeon University

Objectives: Dendropanax morbifera is known as a tree that has been used in traditional medicine for various diseases. However, its biological activities in cancer have not yet been clearly elucidated. In this study, we investigated the anti-cancer effects of water extract of Dendropanax morbifera (DP) on 2 human breast cancer cell lines (estrogen dependent MCF-7 and estrogen independent MDA-MB-231).

Methods: The MTT assay and flow cytometry were used to assess cell proliferation, along with cell cycle analysis. Nitric oxide production was detected by Griess assay.

The expression of apoptosis related gene was assessed by quantitative real-time PCR.

Results: Our data revealed that DP inhibits the cell growth in a dose dependent manner (0, 50, 100, 250, and 500 μg/ml) of both estrogen independent MDA-MB-231 and estrogen dependent MCF-7 breast cancer cells. Also, LPS induced nitric oxide production was significantly reduced by DP. Cell cycle analysis showed an increased G1 phase in the MCF-7 cell and G2/M phase in the MDA-MB-231 cell.

DP decreased mRNA expression of apoptotic suppressor gene Bcl-xL, and increased mRNA expression of pro-apoptotic genes. DP increased mRNA expression of p21, and Rip1 in both cell. And DP decreased mRNA expression of survivin in the MCF-7 cell.

Conclusions: Taken together, these results indicate that DP extract are source of anti-cancer potential and could be developed botanical drug.

Key Words: Dendropanax morbifera, breast cancer, anticancer, MCF-7, MDA-MB-231

3)

Corresponding author(Dong-Youl Yoo) : You & Green Korean medicine Clinic, 70 Moonjung-ro 48th-gil, Tanbang-dong, Seo-gu, Daejeon City, Republic of Korea

Tel : 042-471-4777 E-mail : [email protected]

Ⅰ. 서 론

황칠나무(Dendropanax morbifera Lev.) 는 두릅나무과(Araliaceae)에 속하는 아 열대성 상록 교목으로, 세계적으로 귀한 난지성 수목이다. 우리나라에는 1속 1종 밖에 없으며, 주로 전남의 해남, 완도, 보 길도 등의 서남해안지역 인근과 제주도 의 한라산에 자생한다 ^1,2) 고 알려져 있다.

性味는 甘溫하고 祛風濕 活血脈하는 효 능이 있어, 風濕으로 인한 반신불수, 사 지마비를 치료하고 생리불순에 활용할 수 있다 ³⁾ . 황칠나무의 주성분은 2개의 환구조를 갖는 sesquiterpene에 속하는 β -selinene과 capnellane-8-one이며, 이외에 아직 밝혀지지 않은 성분도 다량 함유하 고 있다 ²⁾ .

현재까지 황칠나무에 대한 연구로 황 칠나무의 항산화작용 및 항암 효과에 대 한 연구가 보고되었고 ^4,5) , 황칠나무 잎의 유효성분이 항 당뇨, 항 동맥경화 효과 를 가지고 있음이 보고되었다 ⁶⁾ . 또한 황 칠나무의 추출물이 자외선으로부터 피부 세포를 보호하고, 미백제로 알려진 알부 틴 보다 더 우수한 멜라닌 합성 저해 활 성능력이 있으며 ⁷⁾ , 황칠나무 에탄올 추출 물이 서로 다른 4가지의 암세포주(MCF7, A549, Hep3B, AGS)에서 50% 이상의 성장 저해율을 나타냈다 ⁸⁾ 고 보고된 바 있 다. 이러한 연구 결과를 바탕으로 현재 황 칠나무 추출물이 건강기능 보조식품 및 식품첨가제 등으로 활용되고 있으나, 황 칠나무의 항암제로서 효능을 구체적으로 밝히는 연구는 아직 미흡한 실정이다.

유방암은 서구에서 가장 흔한 암으로, 우리나라에서도 최근 서구화된 식습관

및 생활 패턴의 변화로 급속하게 증가하는 추세에 있는데, 한국 중앙암등록보고서 에 의하면 2011년에만 1만 5,942건이 발 생하여 여성 암 중 2위를 차지하였다 ⁹⁾ . 유방암 치료의 근간은 근치적인 수술을 시행하는 것이나 자가 검진 및 선별검사 를 통해 조기발견을 하여 근치적인 수술을 시행하여도, 액와 림프절이 음성인 경우 20%, 액와 림프절이 양성인 경우 60%이 상에서 재발 하게 된다. 수술 전 혹은 후의 보조 항암요법은 근치적인 수술과 함께 재발률을 낮추고 생존율을 높이기 위할 목적으로 연구되었다 ¹⁰⁾ . 그런데 치료목적 의 항암제 및 재발방지를 위한 Tamoxifen 같은 호르몬 조절제가 유방암 재발은 감 소시켰으나 암세포뿐 아니라 정상세포에 도 영향을 미치고, 내성을 가지게 되는 부작용을 야기 시키기 때문에 이를 대체 할 수 있는 천연물을 찾아내는 것이 중 요한 과제로 여겨지고 있다 ^11,12) .

이에 본 논문에서는 황칠나무(Dendropanax morbifera)의 열수추출물이 estrogen 비의 존성 유방암세포(MDA-MB-231)와 estrogen 의존성 유방암세포(MCF-7)의 증식에 미 치는 영향, NO의 생성과 apoptosis 기전 에 관여하는 유전자를 mRNA 수준에서 분석하여 apotosis를 통한 천연항암물질 로서의 가능성을 확인하고자 하였다.

Ⅱ. 실 험

1. 재료 및 방법 1) 시약 및 배지

DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s

medium), RPMI1640, trypan blue, fetal

bovine serum(FBS), trypsin-EDTA 및

모든 세포배양 시약은 Life Technology (Rockville, MD, USA)에서 구입하여 사용 하였으며, lipopolysaccharide(LPS), 3-4-5- dimethylthiazol-2-yl-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT), DMSO, GRIESS reagent 는 Sigma(St. Louis, MO, USA)에서 구 입하여 사용하였다. 기타 시약은 세포배 양용 및 분석용 특급시약을 사용하였다.

2) 시료제조

이 실험에 사용한 황칠나무는 완도 자 생지에서 채취하였으며, 황칠나무 줄기 분쇄가루 150 g을 1:25의 비율로 3차 증 류수를 첨가하여 3시간 동안 환류 열수 추출하였다. 추출된 용액은 whatman No.1 disc paper를 이용하여 여과하였다. 그 후 추출액을 rotary vacuum evaporator (EYELA, N-1000, Tokyo, Japan)로 감압 농축한 후 동결건조기(EYELA, FDU-1000, Tokyo, Japan)로 동결건조하여 분말 16.4 g을 얻었다.

3) 세포배양

이 실험에 사용된 사람유래 유방암 세 포주인 MCF-7과 MDA-MB-231 세포와 마우스 유래 단핵구인 RAW 264.7 세포는 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank, Seoul, Korea)에서 분양 받아 사용하였다.

MCF-7과 MDA-MB-231 세포는 10%

FBS가 포함된 RPMI1640배지를 사용하 였고, RAW 264.7 세포는 10% FBS가 포 함된 DMEM배지를 사용하여 5% CO 2 , 37℃ 조건하에서 배양 하였다. 세포가 배 양 접시의 70~80% 정도 증식하면 1×

phosphate buffered saline(PBS, PH 7.4) 로 세척하고, 0.025% trypsin-EDTA용액을 이용하여 단일 세포로 분리한 다음 세포 를 1×10 ⁶ cells/ml로 계대 배양하였다. 실 험을 위해 세포를 seeding한 후 황칠나무

열수추출물(DP)을 dimethyl sulfoxide (DMSO)에 10 mg/ml의 농도로 만들어 배지로 희석하여 사용하였다.

4) Anti-proliferative activity

황칠나무 열수추출물(DP)처리에 따른 세포 사멸효과를 측정하기 위해 3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT assay)분석법을 이용하였다.

살아있는 세포의 mitochondria dehydrogenase 의 능력을 이용하여 노란색 수용성 기질인 MTT를 보라색의 비수용성 formazan으로 변환시키는 방법으로 생성된 formazan의 양은 살아있는 세포수에 비례한다. 배양된 유방암세포(MCF-7, MDA-MB-231)를 96 well plate에서 24시간 동안 5% CO 2 , 37℃

조건하에서 배양한 후, 각 농도별로 DP를 처리했다. 24시간 배양한 세포에 MTT 용액(5 mg/ml)을 첨가하여 4시간 동안 반응시킨 후 생성된 보라색 formazan을 DMSO를 첨가하여 용해시켜 550 nm에서 spectrophotometer(Tecan, Austria)로 흡 광도를 측정하였다. 아무것도 처리하지 않 은 대조군을 100%로 잡아 상대적인 세포 생존율을 구하였다.

5) Nitric Oxide assay

RAW 264.7 세포로부터 생성된 NO의 양은 Griess reagent를 이용하여 세포배양 액 중에 존재하는 NO 2 - 형대로 측정하였다.

1×10 ⁵ cells/ml로 조정된 RAW 264.7 세포를 96 well에 24시간 부착 시킨 뒤 1 μg/ml LPS(lipopolysaccharide)와 DP를 농도별로 처리하여 iNOS(inducible isoforms of nitric oxide synthase) 생성을 유도 하였다. 24시간 동안 5% CO 2 , 37℃ 조건하에서 배양한 후 세포배양액과 동량의 Griess reagent(1%

sulfanilamide, 0.1% N-naphthylethylenediamine

in 2.5% phosphoric acid)를 혼합하여 15분 동

안 반응시킨 후 550 nm에서 spectrophotometer (Tecan, Austria)로 흡광도를 측정하고 그 비를 % 값으로 환산하였다.

6) Cell cycle analysis

DP를 두가지 농도로 처리한 유방암세 포(MCF-7, MDA-MB-231)를 1×phosphate buffered saline(PBS, PH 7.4)으로 수세 하고, ice cold 70% 에탄올로 -20℃에서 12시간동안 고정시켰다. 다시 1×PBS로 수차례 수세한 후 300 μl propidium iodine (PI;0.1% triton X-100; 0.2 mg/ml RNase A; 20 μg/ml PI)으로 상온에서 30분간 염색하였다. 세포주기 분석은 Tali Image -based cytometer와 TaliPCApp(version 1.0)을 이용하여 분석 하였으며, 대조군 으로는 DP를 처리하지 않은 세포를 사 용하였다.

7) Real-time Quantitative PCR에 의 한 세포사멸 관련 유전자 분석 세포사멸유도에 관여하는 유전자의 발 현을 관찰하기 위해 유방암세포(MCF-7, MDA-MB-231)에 DP를 농도별로 처리 하여 세포로부터 total RNA를 분리 하 였다. 분리한 total RNA로부터 표적유 전자의 mRNA를 역전사시켜 cDNA를 합성하고 SYBR-green Ex Taq(TAKARA Bio INC, Japan)에 세포사멸에 관여하는 유전자인 Bcl-2, Bcl-xL, Bad, Bax, caspase-3, caspase-8, caspase-9, p53, p21, survivin, Rip1을 첨가하여 qPCR을 수행하였다.

모든 반응 실험은 3회 시행 하였으며, 2- ΔΔCT method로 분석하였다. 이 실험에 사용한 primer는 아래와 같다(Table 1).

Bcl-2 sense GCCTTTGTGGAACTGTACGGC anti sense GGCAGTAAATAGCTGATTCGACGTT BclxL sense CTTTGCCTAAGGCGGATTTGAA

anti sense AATAGGGATGGGCTCAACCAGTC Bad sense GTTCCAGATCCCAGAGTTTGAGC

anti sense TTAAAGGAGTCCACAAACTCGTCACT Bax sense GCGAGTGTCTCAAGCGCATC

anti sense CCAGTTGAAGTTGCCGTCAGAA Caspase-3 sense ATGGAGAACACTGAAAACTCA

anti sense GCTGTTTACAAGACCCACGTGG Caspase-8 sense GCCTGCTGAAGATAATCAACGACTAT

anti sense TTGATGATCAGACAGTATCCCCG Caspase-9 sense TGGCTTCGTTTCTGCGAACTA

anti sense GTTACTGCCAGGGGACTCGTC p53 sense GCT CTG ACT GTA CCA CCA TCC

anti sense CTC TCG GAA CAT CTC GAA GCG p21 sense CTC AGA GGA GGC GCC ATG

anti sense GGG CGG ATT AGG GCT TCC Survivin sense GCATGGGTGCCCCGACGTTG

anti sense GCTCCGGCCAGAGGCCTCAA Rip1 sense TTTTGCACAGCAAAGACCTTACG

anti sense AGCTGCTCAGAAGGTCGATCC

Table 1. Primer Sequence Used for PCR

2. 통계 분석

실험 결과는 SPSS v12.0을 이용하여 mean±standard error로 기록하였고, 유 의성 검증은 Student’s T-test 분석방법 을 이용하여 p<0.05인 경우 유의성이 있 다고 판정하였다.

Ⅲ. 결 과

1. DP의 Anti-proliferative activity에 미치는 효과

유방암세포(MCF-7, MDA-MB-231)에 DP를 0, 50, 100, 250, 500 μg/ml로 처리 하여 24시간동안 배양한 뒤 세포 생존율을 측정하였고, 이것으로 증식 억제 효과를 계산하였다. MCF-7과 MDA-MB-231 세 포에 대한 DP의 암세포 증식 억제율은 500 μg/ml 농도에서 MCF-7은 58.3%, MDA-MB-231은 57.9%로 높은 증식 억제 효과를 보였다. 또한 DP는 두 세포주에서 모두 농도 의존적으로 세포 증식을 억제 하였다(Fig. 1, 2).

Fig. 1. Effect of water extract of Dendropanax morbifera (DP) on cell viability of MCF-7 cells.

Cells were treated with different concentration of DP for 24hrs. Cell viability was determined by the MTT assay.

Fig. 2. Effect of water extract of Dendropanax morbifera (DP) on cell viability of MDA -MB-231.

Cells were treated with different concentration of DP for 24hrs. Cell viability was determined by the MTT assay.

2. DP에 의한 Nitric Oxide 생성 억제 효과

RAW 264.7 세포에 DP를 0, 50, 100, 250, 500 μg/ml로 처리하여 NO의 생성 억제 효과를 측정한 결과, 250 μg/ml의 농도에서 약 58.7%(p<0.05), 500 μg/ml의 농도에서 87.8%(p<0.005)의 생성 억제능 을 보였다(Fig. 3).

Fig. 3. Effect of water extract of Dendropanax morbifera (DP) on nitric oxide of LPS- induced RAW 264.7 cells.

Cells were treated with various concentration of DP and 1 μg/mL LPS for 24hrs. Nitric oxide production was measured by Griess reagent assay.

* : p<0.05, ** : p<0.005 vs control.

3. DP에 의한 세포 주기 변화 분석 DP를 150, 300 μg/ml 농도로 처리한 MCF-7, MDA-MB-231 두 유방암세포 모두 세포 증식이 억제 되는 것을 현미 경을 통해 관찰할 수 있었다. 또한 세포 주기를 분석한 결과 MCF-7에서는 DP

150 μg/ml 농도에서 대조군보다 G1 phase 가 1.27배 증가하고 DP 300 μg/ml 농도에 서 1.29배 증가 하였으며, MDA-MB-231의 경우는 150 μg/ml에서는 G1 phase, G2/M phase의 변화는 없었고, 300 μg/ml에서 G2/M phase가 2.13배 증가 하였다(Fig. 4).

Fig. 4. Effect of water extract of Dendropanax morbifera (DP) on the cell cycle distribution in breast cancer cell lines.

Cells were treated with various concentration of DP.

A) The morphological change observed under the phase-contrast inverted microscope (×100, scale bars 50 μm).

B) Image-based cytometric analysis was performed to determine the effect of DP on the cell cycle distribution.

4. DP가 세포사멸관련 유전자의 발현 에 미치는 영향

DP를 유방암 세포주(MCF-7, MDA- MB-231)에 처리하면 MCF-7 세포에서는 세포사멸을 억제 또는 지연시키는 항사멸 인자인 Bcl-2, Bcl-xL의 발현이 DP 300 μg/ml 농도에서 유의하게(p<0.05) 감소 했으며, 사멸인자인 Bad와 Bax의 발현 은 DP 300 μg/ml 농도에서(p<0.005) 유 의하게 증가하였다. MDA-MB-231 세포

에서는 Bcl-xL의 발현이 DP 300 μg/ml 농도에서 유의하게(p<0.005) 감소했으며, Bax의 발현은 DP 300 μg/ml 농도에서 유의하게(p<0.005) 증가하였다(Fig. 5).

또한 DP를 처리한 MCF-7 세포에서는

세포 사멸을 유발하는 caspase-3, caspase-8,

caspase-9의 발현이 농도 의존적으로 증가

되었으며, caspase-3, caspase-8은 150, 300

μg/ml 농도에서 유의하게(p<0.05, p<0.005)

증가하였고, caspase-9는 100, 150, 300 μg/ml

농도에서 유의하게(p<0.05, p<0.005) 증가 하였다. MDA-MB-231 세포에서는 caspase-3, caspase-9의 발현이 농도 의존적으로 증 가하고, caspase-3은 100, 150, 300 μg/ml 농도에서, caspase-8은 100 μg/ml 농도에서, caspase-9는 150, 300 μg/ml 농도에서 유의 하게(p<0.05, p<0.005) 증가하였다(Fig. 6).

그리고 DP를 처리한 MCF-7 세포에 서는 p53의 발현에 영향을 주지 못했으 나, p21의 발현이 농도 의존적으로 증가 하였고 150, 300 μg/ml 농도에서 유의하 게(p<0.05) 증가하였다. Survivin의 발현

이 농도 의존적으로 감소하였고 150, 300 μg/ml 농도에서 유의하게(p<0.005) 감소 하였다. Rip1의 발현이 100, 150, 300 μg/ml 농도에서 모두 유의하게(p<0.005) 증가하 였다. MDA-MB-231 세포에서는 p53의 발현에 영향을 주지 못했고, p21의 발현이 농도 의존적으로 증가하였으며, 300 μg/ml 농도에서 유의하게(p<0.005) 증가하였다.

Survivin의 발현에는 영향을 주지 못했으 며, Rip1의 발현은 농도 의존적으로 증가 하였고 150, 300 μg/ml 농도에서 유의하 게(p<0.005) 증가하였다(Fig. 7).

Fig. 5. Effect of water extract of Dendropanax morbifera (DP) on apoptosis related gene expression of breast cancer cells.

Cells were treated with DP for 24hrs and then mRNA level evaluated by quantitative real-time PCR.

A) MCF-7, B) MDA-MB-231

* : p<0.05, ** : p<0.005 vs control.

Fig. 6. Effect of water extract of Dendropanax morbifera (DP) on caspase gene expression of breast cancer cells.

Cells were treated with for 24hrs and then mRNA level were evaluated by quantitative real-time PCR.

A) MCF-7, B) MDA-MB-231

* : p<0.05, ** : p<0.005 vs control.

Fig. 7. Effect of water extract of Dendropanax morbifera (DP) on anti-proliferative gene expression of breast cancer cells.

Cells were treated with for 24hrs and then mRNA level were evaluated by quantitative real-time PCR.

A) MCF-7, B) MDA-MB-231

* : p<0.05, ** : p<0.005 vs control.

Ⅳ. 고 찰

유방암은 전 세계적으로 여성들에게 가장 흔히 발병되는 질병으로 발생률이 꾸준히 증가하고 있으며, 이에 따른 사 망률 또한 점차 증가하고 있다. 유방암 은 여성의 estrogen 호르몬 의존성 암과 비의존성 암으로 나뉘며, 동양인에게서 는 다소 낮은 발병률을 보이는 암이지 만, 최근에는 산업화에 의한 식생활 변 화와 출산율 감소 및 암환자의 조기 발 견 등으로 발병률이 증가하고 있는 추세 다. 현재 항암제들은 종류에 따라 효능 이 다를 뿐만 아니라, 정상세포의 손상 및 면역력 저하 등 많은 문제점을 가지

고 있어 ^13,14) , 치료 효능이 뛰어나면서 부

작용이 없고 항암 및 면역 조절효과 있 는 천연물들에 대한 연구가 활발하게 진 행되고 있다.

유방암은 한의학적 병증명 중 ‘乳巖’과 가장 가깝다고 볼 수 있다. 乳巖의 발생 원인으로는 肝氣鬱滯, 七情所傷이 선행 요인이자 주요인이고, 이것이 오래되거 나 血氣枯槀와 房勞로 正氣不足, 氣血損 傷, 및 衝任失調 등으로 나타나는 장부 기능의 실조, 外感, 痰飮 등이 있다. 乳房 腫塊, 不痛, 不痒, 不赤하고 혹 內熱, 夜 熱, 五心煩熱, 肢體倦瘦, 月經不調 등의 증상이 나타나는데 단미제로 鬼箭羽, 黃 芩, 半枝蓮, 楡根皮, 川楝子, 三稜, 玄胡 索, 皂角刺, 桔梗 및 五加皮 등이 효과가 있다고 알려져 있다 ¹⁵⁾ .

기존의 항암본초를 이용한 유방암 관련 실험연구를 살펴보면, 川楝子 메탄올 추 출물은 Bcl-2를 억제하여 mitochondria를 공유하는 apoptosis를 유도함으로써 유방

암 치료에 유의한 효과가 있었으며 ¹⁶⁾ , 三稜 추출물은 농도와 시간에 비례하여 MCF-7 세포 증식을 강력하게 억제하였으며, MCF-7 세포의 세포독성과 세포 자멸사 유발 효과 를 나타내었다 ¹⁷⁾ . 또한 薑黃의 에탄올 및 물 추출물은 세포독성을 유도하여 MCF-7 세포 증식을 효과적으로 억제하는 효능 이 있었으며 ¹⁸⁾ , 玄胡索 메탄올 추출물은 Bcl-2와 Bcl-xL발현을 억제하여 세포 자 멸사를 증가시켜 MCF-7 세포의 활성을 감소시킨다고 보고되었다 ¹⁹⁾ .

위의 약물들은 모두 活血化瘀의 효능

이 있는데 이외에도 全虫, 土鱉蟲, 川芎,

紅花, 丹蔘, 蓬朮, 烏藥, 當歸尾, 大黃, 降

香, 五靈脂, 蛇毒, 鷄血藤, 柘樹, 紫樹 등

活血化瘀 효능을 갖고 있는 다양한 약물

들이 항암작용이 있다고 보고되고 있다 ²⁰⁾ .

본 연구에 활용한 황칠나무(Dendropanax

morbiferia)에는 2개의 환구조를 갖는

sesquiterpene에 속하는 β-selinene이 가장

많이 함유되어 있고, capnellane-8-one가

다음으로 많이 함유되어 있으며 이외에

아직 밝혀지지 않은 성분도 다량 함유하

고 있다 ²⁾ . 祛風濕 活血脈 효능을 가지고

있는 것으로 알려져 있으며 ³⁾ , Lee 등 ²¹⁾ 은

황칠나무의 잎과 줄기에서 추출된 물질인

dendropanoxide가 인간 골 육종 세포에

서 ERK1/2 활성화를 통해 자가포식을

유도하며 자가 포식을 억제할 경우에는

dendropanoxide에 의해 유도된 apoptosis

를 강화한다고 보고하였고, Jin 등 ²²⁾ 은

황칠나무에서 추출한 물질인 Oleifolioside

B는 자가소화를 유도하여 인간 비소세포

폐암세포에서 세포 사멸을 촉진하는 작

용이 있어 황칠나무의 새로운 항암제로

서의 가능성을 보고하였다. 또한 황칠나

무 추출물인 Oleifolioside A는 NF-κB와

MAPK 활성을 억제하여 항염증 효능을 나타내고 ²³⁾ , caspase 활성이 아닌 새로운 신호전달경로를 통하여 HeLa cell의 세포 자멸을 유도하는 항암효과가 있는 것으 로 알려져 있다 ²⁴⁾ .

위와 같이 황칠나무줄기 열수추출물의 폐암 및 자궁경부암의 항암효과, 항염작 용에 대한 결과가 보고되었으나 유방암 세포주에 대한 연구는 접하지 못하였기에 본 연구에서는 유방암세포인 MCF-7과 MDA-MB-231를 이용하여 황칠나무열 수추출물의 항암 효과를 세포사멸 관련 유전자 발현 분석을 통해 확인하고자 하 였다.

유방암의 약 60%는 estrogen receptor (ER) positive이고, anti-estrogen 치료제 를 사용하며, ER-negative 유방암은 공 격성이 강하고 anti-estrogen 치료제로는 큰 효과를 얻지 못한다 ^25,26) . 그렇기 때문에 항암치료제 물질의 억제 효과를 측정 시 ER-positive와 ER-negative 세포에서 모두 효과를 나타내는지 확인 할 필요가 있다.

이에 ER-positive인 MCF-7과 ER-negative 인 MDA-MB-231 세포를 사용하여 DP 가 암세포 증식에 미치는 영향을 측정하 였다.

먼저 유방암세포(MCF-7, MDA-MB-231) 를 0, 50, 100, 250, 500 μg/ml의 DP로 처리하여 24시간 동안 배양한 뒤 증식 억제 효과를 측정한 결과 두 세포주에서 모두 세포 증식 억제 효과가 있는 것을 확인 할 수 있었으며, 이는 호르몬의존성과 상관 없이 유방암 세포에서 DP가 암세포의 성장 억제능을 갖고 있음을 시사한다.

NO는 조직치유와 관련된 angiogenesis에 중요한 역할을 하는데, vascularization은 종양성장에 필수적이며 종양전이와 관계

가 있어 NO가 종양촉진에 관여하고 ²⁷⁾ , 세 포에서의 NO는 직접 DNA를 변화시켜 G;T mismatch를 수선하는 thymine-DNA -glycosylases의 활성을 저해 하는 것으로 알려져 있다 ²⁸⁾ . 또한 iNOS에 의해 생성된 NO는 발암과정 중 p53 돌연변이에 관여 하며 tyrosine nitration에 의해 p53의 기 능을 변화시키는 것으로 알려져 있다 ²⁹⁾ .

DP의 0, 50, 100, 250, 500 μg/ml 처리 농도에서 LPS에 의해 유도된 NO의 생 성 억제 효과를 측정한 결과 농도 의존 적으로 NO의 생성을 억제 하였으며, 이 는 DP가 NO의 생성을 억제하여 염증의 진행을 막고, 유해 활성산소의 체내 축 적 및 주변 조직 및 세포 손상으로부터 세포를 보호할 수 있음을 시사한다. 따 라서 DP는 NO나 NO대사물에 의한 유 전자 독성을 억제하여 암 억제 효과가 있을 것으로 사료된다.

또한 암세포의 과도한 증식은 세포주 기의 증식 및 분열과 관계된 기전을 조 절함으로 억제 할 수 있다. 세포 주기는 S, M, G1, G2의 단계로 나누어지며 여 러 요인에 의해 DNA가 위험을 감지하 면 G1, G2 checkpoint를 통해 세포 주기 가 중단 되며 cyclin-dependent kinase와 cyclin-dependent kinase inhibitor에 의해 조절된다 ³⁰⁾ .

MCF-7, MDA-MB-231 두 유방암세

포 모두에서 150, 300 μg/ml 농도로 DP

를 처리하면 세포 증식이 억제 되는 것

을 현미경을 통해 관찰할 수 있었다. 또

한 DP에 의한 증식 억제가 세포가 성장

하고 분열하는 과정에 영향을 끼쳐 세포

주기를 억제 하는지를 분석한 결과, DP가

MCF-7 세포에서 G1 phase의 정지를 유

도하고, MDA-MB-231에서 G2/M phase

의 정지를 유도하여 세포 증식에 영향을 주는 것으로 사료된다.

Apoptosis로 인한 세포 사멸은 mitochondria 막에 존재하는 Bcl-2 family(Bcl-2, Bax) 유전자 발현과 기질이 되는 단백질의 특 정한 aspartic acid를 인지하여 세포내 단백질과 핵단백질을 분해하는 역할을 하는 단백질 분해효소인 caspase(cysteine -aspartic protease or cysteine-dependent aspartate-directed protease)의 활성화로 나타난다 ³¹⁾ . Anti-apoptotic Bcl-2 family 는 apoptosis를 억제하는 기능을 가지며 Bcl-2, Bcl-xL 등이 있고, 반대로 apoptosis 를 유도하는 pro-apoptotic Bcl-2 family 로는 Bax, Bad 등이 있으며, 세포사멸의 마지막 신호 전달 경로 관련 유전자인 caspase-3, caspase-8, caspase-9 등이 있 다 ³²⁾ . 정상세포에서 산화적 스트레스로 DNA가 손상을 받으면 p53이 증가하여 세포내 Bax발현이 증가되어 세포 사멸이 증가 되고, caspase-3는 caspase-8, caspase-9 의 초기 신호를 증폭시킴으로 세포사멸을 일으키는 중요한 역할을 한다 ^33-35) . 이런 caspase들의 감소와 결핍은 각종 암에서 발견되며, 유방암에서도 caspase-3가 결핍 또는 감소되었음이 보고되었으며, 핵의 단백질 구조에 손상을 일으킨다는 보고 가 있다 ^31,36) . p21은 cyclin-dependent kinase inhibitor(CKI)로 cyclin-dependent kinase 를 억제하여 세포주기를 정지시킴으로서 암 억제자로서 암 예방 역할을 수행한 다. p53이 p21 유전자의 promotor에 결 합하여 p21이 전사되면 세포주기가 정지 하고, 결합하지 못하면 p21이 전사되지 않아 세포자살이 일어난다 ³⁷⁾ . 또한 survivin 은 BIRC5라고도 불리며 caspase활성을 억제하여 apoptosis를 억제하고 ³⁸⁾ , Rip1

은 FAS와 결합하여 MAPK 활성화를 통해 NF-kB pathway를 활성화 시켜 세 포자살이 진행된다 ³⁹⁾ .

DP를 유방암 세포주(MCF-7, MDA- MB-231)에 농도별로 처리하여 유전자 의 발현을 mRNA 수준에서 측정한 결과 Bcl-xL의 발현이 DP 300 μg/ml에서 유 의하게 감소했으며 Bax의 발현은 DP 300 μg/ml에서 유의하게 증가하였다. 또 한 MCF-7 세포에서는 caspase-3, caspase-8, caspase-9의 발현이 증가되었으며, MDA- MB-231 세포에서는 caspase-3, caspase-9 의 발현이 증가되었다. 이외에도 MCF-7 및 MDA-MB-231 세포에서 p21의 발현 을 유의하게 증가시키고 MCF-7에서는 survivin의 발현을 유의하게 억제시켰으 며, MCF-7와 MDA-MB-231에서 Rip1 의 발현을 유의하게 증가시켰다. 이것으 로 보아 DP는 Bcl-xL의 발현을 감소시 키고, Bax, p21, Rip1의 발현과 caspase-3, caspase-9의 활성을 증가시켜 세포사멸 을 증가시킬 것으로 판단되며, 이는 세 포주기를 억제하는 결과와 일치하였다.

그러므로 황칠나무 열수추출물은 유방

암세포의 세포 증식 억제와 NO 생성 저

해뿐만 아니라 세포 주기의 억제와 세포

사멸 프로그램에 관여하는 유전자들의

발현 조절을 통해 세포증식을 억제하여

항암효과를 갖는 것으로 사료된다. 이러

한 결과는 향후 유방암 치료를 위한 천

연물신약의 개발에 참고할 수 있을 것이

며 정상 세포에 대한 연구 및 인체 내에

서 일어나는 더욱 정확한 기전에 대한

심도있는 연구가 보강되어야 할 것으로

생각된다.

V. 결 론

황칠나무(Dendropanax morbifera)의 열수추출물이 estrogen 비의존성 유방암 세포(MDA-MB-231)와 estrogen 의존성 유방암세포(MCF-7)의 증식에 미치는 영 향, NO의 생성과 apoptosis 기전에 관여 하는 유전자를 mRNA 수준에서 분석을 통하여 다음과 같은 결과를 얻었다.

1. DP가 유방암 세포에서 호르몬 의존 성과 상관없이 농도 의존적으로 세포 증식을 억제하였다.

2. DP가 NO의 생성을 억제하였다.

3. DP가 MCF-7 세포에서 G1 phase의 정지를 유도하였다.

4. DP가 MDA-MB-231 세포에서 G2/M phase의 정지를 유도하였다.

5. DP가 Bcl-xL의 발현을 감소시켰다.

6. DP가 Bax의 발현과 caspase-3, caspase-9 의 활성을 증가시켰다.

7. DP가 p21의 발현을 유의하게 증가시 켰다.

8. DP가 MCF-7 세포에서 survivin의 발 현을 유의하게 억제하였다.

9. DP가 Rip1의 발현을 유의하게 증가 시켰다.

이상을 종합하여 볼 때, 황칠나무 열 수추출물은 MDA-MB-231과 MCF-7에 대해 항암효과를 나타내는 것으로 사료 된다.

□ Received : April 21, 2015

□ Revised : April 27, 2015

□ Accepted : May 08, 2015

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