Utility of Micro CT in a Murine Model of Bleomycin-Induced Lung Fibrosis

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(1)DOI: 10.4046/trd.2009.67.5.436 ISSN: 1738-3536(Print)/2005-6184(Online) Tuberc Respir Dis 2009;67:436-444 CopyrightⒸ2009. The Korean Academy of Tuberculosis and Respiratory Diseases. All rights reserved.. Original Article. Bleomycin 유도 폐 섬유화 쥐 모델에서 미세 전산화단층촬영의 유용성 전북대학교 의학전문대학원 1영상의학교실, 2폐손상 치료 개발 특성화 센터, 3임상의학연구소, 4내과학교실, 5병리학교실, 6익산병원 영상의학과 1. 1,2,3. 이재아 , 진공용. 1. 1,3. 2,3,4. , 복세미 , 한영민 , 박성주. 2,3,4. , 이용철. 2,3,5. , 정명자. 6. , 윤건하. Utility of Micro CT in a Murine Model of Bleomycin-Induced Lung Fibrosis Jae A Lee, M.D.1, Gong Yong Jin, M.D.1,2,3, Se Mi Bok1, Young Min Han, M.D.1,3, Seoung Ju Park, M.D.2,3,4, 2,3,4 2,3,5 6 Yong Chul Lee, M.D. , Myung Ja Chung, M.D. , Gun Ha Youn, M.D. 1 2 3 Department of Radiology, Research Center for Pulmonary Disorders, Research Institute of Clinical Medicine, Departments of 4 Internal Medicine, 5Pathology, Chonbuk National University Medical School, Jeonju, 6Department of Radiology, Iksan Hospital, Iksan, Korea. Background: Micro computed tomography (CT) is rapidly developing as an imaging tool, especially for mice, which have become the experimental animal of choice for many pulmonary disease studies. We evaluated the usefulness of micro CT for evaluating lung fibrosis in the murine model of bleomycin-induced lung inflammation and fibrosis. Methods: The control mice (n=10) were treated with saline. The murine model of lung fibrosis (n=60) was established by administering bleomycin intra-tracheally. Among the 70 mice, only 20 mice had successful imaging analyses. We analyzed the micro CT and pathological findings and examined the correlation between imaging scoring in micro CT and histological scoring of pulmonary inflammation or fibrosis. Results: The control group showed normal findings on micro CT. The abnormal findings on micro CT performed at 3 weeks after the administration of bleomycin were ground-glass opacity (GGO) and consolidation. At 6 weeks after bleomycin administration, micro CT showed various patterns such as GGO, consolidation, bronchiectasis, small nodules, and reticular opacity. GGO (r=0.84) and consolidation (r=0.69) on micro CT were significantly correlated with histological scoring that reflected pulmonary inflammation (p＜0.05). In addition, bronchiectasis (r=0.63) and reticular opacity (r=0.83) on micro CT shown at 6 weeks after bleomycin administration correlated with histological scoring that reflected lung fibrosis (p＜0.05). Conclusion: These results suggest that micro CT findings from a murine model of bleomycin-induced lung fibrosis reflect pathologic findings, and micro CT may be useful for predicting bleomycin-induced lung inflammation and fibrosis in mice. Key Words: X-ray Microtomography, Bleomycin; Fibrosis; Mice. This study was supported by a grant of the Korea Healthcare technology R&D Project, Ministry for Health, Welfare and Family Affairs, Republic of Korea (A084144) and by Fund of Chonbuk National University Hospital Research Institute of Clinical Medicine. Address for correspondence: Gong Yong Jin, M.D. Department of Diagnostic Radiology, Chonbuk National University Medical School, San 2-20, Geumam-dong, Deokjin-gu, Jeonju 561-180, Korea Phone: 82-63-250-2307, Fax: 82-63-272-0481, E-mail: [email protected] or Yong Chul Lee, M.D. Department of Internal Medicine, Chonbuk National University Medical School, San 2-20, Geumam-dong, Deokjin-gu, Jeonju 561-180, Korea Phone: 82-63-250-1664, Fax: 82-63-250-1633, E-mail: [email protected] Received: Sep. 7, 2009 Accepted: Sep. 29, 2009. 436.

(2) Tuberculosis and Respiratory Diseases Vol. 67. No. 5, Nov. 2009. 서. 론. 특발성 폐섬유화증(idiopathic pulmonary fibrosis)은 정확히 알 수 없는 원인으로 인해 점진적인 폐 섬유화가 진행되고, 결국에는 환자의 폐 기능을 감소시키는 예후가 매우 불량한 질환이다1. 병리학적으로는 폐의 간질 부위 에 염증 세포가 침윤되고 섬유모세포가 증식되는 형태로 나타나며, 방사선학적으로는 폐 기저부와 가슴막밑(subpleural) 부위에 벌집모양(honeycomb appearance)을 특 징으로 한다. 명확한 병인이 밝혀져 있지 않고 유병률은 낮으며, 환자의 생존 기간은 매우 짧기 때문에, 그 병태생 리를 연구하거나 치료법을 개발하는 것이 매우 어려울 수 밖에 없다1,2. 아직까지도 효과적인 치료제가 확립되지 않 아 새로운 치료 방법의 개발이 절실히 요구되는 상황이므 로, 폐섬유화증에 대한 끊임없는 연구가 반드시 필요하다 고 할 수 있다. 질환을 연구하기 위해서는 그 병태생리적 특징을 잘 나타내는 동물 모델이 반드시 필요하다. 실험 동물에게 폐 섬유화를 유도시키기 위해 방사선 조사, 석면 과 같은 섬유화 유발 물질의 투여, 섬유화 관련 시토카인 의 유전자 변이 등의 다양한 방법이 사용되고 있지만, 현 재까지 가장 많이 사용되는 동물 모델 중 하나가 블레오마 이신(bleomycin)을 투여하여 유발시킨 폐 섬유화 모델이 다2. 림프종을 비롯한 다양한 종양에 대한 치료제로 사용 되는 블레오마이신은 중대한 부작용 중 하나로 조직의 섬 유화를 발생시킨다3. 이를 이용하여 블레오마이신 유도 폐 섬유화 쥐 모델을 만들었고, 약제를 구하기 쉽고 비교 적 어렵지 않게 모델을 만들 수 있으며, 재현성도 높은 편이어서 좋은 동물 모델로서의 조건을 충분히 가지고 있 2 다 . 실험 동물을 이용한 연구를 진행하기 위해서는 좋은 동물 모델을 만드는 것도 중요하지만, 질병의 진행이나 호전 상황을 평가하기 위해 어떠한 방법을 이용하고 무슨 측정치를 사용할 것인지가 또한 상당히 중대한 문제이다. 따라서, 블레오마이신 유도 폐 섬유화 쥐 모델에서도 병리 학적인 평가뿐 아니라 폐의 염증이나 섬유화와 관련된 매 개체들의 측정을 통하거나 영상학적 접근을 통한 평가가 중요하리라 생각된다. 쥐의 폐를 영상화시키기 위한 노력이 끊임없이 이루어 졌고 지난 10년 동안 이에 필요한 기술이 급진적으로 발 달함에 따라, 미세 전산화단층촬영(micro computed tomography, micro CT)이 폐의 미세 구조물이 시각화되고 평가될 수 있을 정도로 높은 해상도의 영상을 제공하게 되었다4. 미세 전산화단층촬영은 블레오마이신을 쥐에게. 투여한 후 폐 섬유화의 발생과 그 진행 과정을 영상을 통 해 확인할 수 있게 해 주었고, 이러한 영상학적 소견이 4-6 병리 소견과 상당히 일치한다는 논문들이 발표되었다 . 최근 한 연구에서 미세 전산화단층촬영에서 보였던 경화 (consolidation)와 젖빛유리(ground-glass opacity)가 병리 학적으로 폐 조직에서 보이는 염증 정도와 통계학적으로 유의한 연관성을 나타내고, 기관지 확장 등의 소견도 폐 실질의 섬유화를 잘 반영함을 보여주었다7. 또한, Cavanaugh 등8은 미세 전산화단층촬영을 이용하여 측정 된 폐 손상의 범위가 조직 소견과 상당한 연관성을 보여 미세 전산화단층촬영이 블레오마이신에 의한 폐 손상을 예측할 수 있는 좋은 방법임을 확인하였다. 특히 기관지 내로 블레오마이신을 투여한 후 불균일하게 폐 손상이 발 생한 경우 조직 채취를 해야 할 부위에 대한 정보를 제공 할 수 있다는 점에서 미세 전산화단층촬영은 단순한 폐 손상의 평가 이상으로 블레오마이신 유도 폐 섬유화 쥐 모델의 연구에 있어 그 중요성이 크다고 할 수 있다4,5. 블레오마이신 유도 폐 섬유화 쥐 모델을 이용하여 연구 하는 데 있어 미세 전산화단층촬영에 대한 관심이 높아지 고 필요성이 증가하고 있기는 하지만, 아직 이에 대한 연 구는 매우 제한적으로 이루어지고 있다. 현재까지 블레오 마이신에 의한 폐 섬유화 정도를 영상화하여 보여 주고 분석한 연구가 드문 실정이며, 대부분의 경우 쥐를 죽인 후에 미세 전산화단층촬영술을 시행한 결과들이다7,8. 또 한, 외국에서 개발된 미세 전산화단층촬영 기술을 이용하 여 이루어지고 그 결과가 발표되고 있어, 아직까지 국내에 서 개발된 미세 전산화단층촬영 기기를 이용하여 쥐의 폐 섬유화 과정을 영상화한 논문은 없다. 본 연구는 쥐가 살 아있는 상태에서 국내에서 개발된 미세 전산화단층촬영 기술을 이용하여 영상을 얻었다. 쥐의 기도에 블레오마이 신을 투여한 후 3주와 6주째에 얻은 영상들의 패턴을 비 롯한 특징을 분석하고 조직 소견과 비교하여 봄으로써 블 레오마이신에 의해 유발되는 폐 섬유화 과정을 연구하는 데 있어서 미세 전산화단층촬영이 갖는 유용성에 대해서 알아보고자 하였다.. 대상 및 방법 1. 쥐 모델의 준비와 처치 병원체 감염이 되지 않은 20∼25 g의 수컷 C57BL/6 쥐(Daejeon, Korea)를 이용하여 전북대학교 동물실험윤 리위원회에 승인을 받아 연구를 시행하였다. 쥐는 티오펜. 437.

(3) JA Lee et al: Micro CT in bleomycin-induced lung fibrosis. 탈소디움(thiopental sodium, 0.08 mL/kg of body weight)을 복강 내에 주입하여 마취한 후 기관 삽관을 시행하 였다. 대조군의 경우에는 생리식염수 30 μL를 기도 내로 주입하였고, 실험군에는 10 mg/kg의 bleomycin hydrochloride (Nippon Kayaku Co., Tokyo, Japan)을 30 μL 의 생리식염수에 섞어 기도 내로 주입하였다. 블레오마이 신을 주입한 후 3주와 6주에 미세 전산화단층촬영(NFRPolaris-G90; NanoFocusRay, Iksan, Korea)을 시행하였다.. 2. 미세 전산화단층촬영 시스템 이 CT는 원추-빔형(cone-beam type)의 평판형 X-선 영 상센서(flat-panel detector)를 기반으로 하는 볼륨 CT로서 엑스선 발생장치의 관전압 및 관전류는 각각 40∼130 kV o 와 65 μA이었다. CT는 한 조사(projection) 당 1 씩 회전 o 하여 360 회전 시 총 360개의 영상을 얻었다. 한 번의 조사에 걸린 시간은 1초로 총 조사 시간은 6분이 소요되 었다. 조사영역(field of view, FOV)은 56×59 mm이고, 재조합 방법(reconstruction algorithm)은 Feldkamp back projection 방법을 이용하였다. 재조합된 영상은 화상을 구성하는 최소 단위의 화소가 1,024×1,024 픽셀(pixel)이 었으며, 512개의 단층 영상을 얻을 수 있었다. 따라서, 입 체화상을 구성하는 삼차원 영상의 화소인 복셀(voxel)의 크기는 약 50×50×100 μm로 계산되었다. 재조합된 영 상을 삼차원의 영상으로 보기 위하여 3D-렌더링 소프트웨 어 프로그램(Lucion: Infinitt Technology, Seoul, Korea) 을 이용하였다.. 3. 미세 전산화단층촬영의 영상화 생리식염수를 투여한 3주 후의 대조군(n=10)과 블레오 마이신을 투여한 후 3주째의 실험군(n=30), 블레오마이신 을 투여한 후 6주째의 실험군(n=30)에 대해 미세 전산화 단층촬영을 시행하였다. 티오펜탈소디움을 복강 내에 주 입하여 깊게 마취시킨 후 호흡 동기 없이 쥐의 폐를 영상 화하였다. 영상은 50 kVp, 65 μA, 470 ms/frame, 360o 회전 영상을 이용하여 얻었고, 측정된 노출 방사선량은 약 84 mGy였다. 미세 전산화단층촬영의 공간해상력은 약 44.25 μm였고, 재구성 영상은 디지털 영상(Lucion; Infinite Technology)을 이용하여 얻었다. 총 70 마리의 쥐에 서 촬영 도중 사망하거나, 영상의 질이 떨어져서 영상 분 석이 불가능하거나, 또는 분석이 가능하더라도 인공음영 (artifact)으로 인해서 분석에 오류가 생길 가능성이 있는 경우, 블레오마이신을 투여함에도 불구하고 병변이 생기. 438. 기 않은 경우는 영상 분석에서 제외하였다. 총 70마리 중 20마리가 영상 분석이 가능하였으며, 각 군별 분포를 보 면 대조군 8마리, 3주째의 실험군 7마리, 6주째의 실험군 5마리였다.. 4. 병리학적 분석 대조군은 생리식염수를 투여한 3주 후에 미세 전산화단 층촬영촬영이 끝나는 대로 즉시 희생시켜 폐 조직을 얻었 다. 또한, 블레오마이신을 투여한 후 3주째와 6주째의 쥐 도 미세 전산화단층촬영촬영이 끝난 후 즉시 희생하여 폐 조직을 얻었다. 폐를 제거하기 전에 기도와 폐에 고정액 (10% formalin)을 주입하고 기도를 묶어서 폐를 고정하였 다. 폐를 분리하여 포르말린 용액에 넣어 고정하였고, 파 라핀에 포매하였다. 조직학적 소견을 보기 위하여 Leica model 2,165 rotary microtome (Leica, Nussloch, Germany)을 이용하여 4 μm 간격으로 조직을 잘랐으며, 파 라핀을 제거한 후 H&E 염색(Richard-Allan Scientific, Kalamazoo, MI, USA)에서 관찰하였다. 한 명의 병리학과 전문의가 모든 폐 조직의 병리 소견을 분석하였다. 폐 섬 유화 정도는 이전에 다른 연구에 기술된 방식을 따라 측정 하였다9,10. 쥐의 폐 전체를 25배 시야로 확대한 현미경 하 에 각각의 좌우 엽, 즉 5개의 엽에 대해서 염증과 섬유화 정도를 0점부터 7점까지 점수화하였다. 비정상적 소견이 없는 경우에 0점, 폐 실질의 5% 미만의 염증 또는 섬유화 가 있는 경우 1점, 폐 실질의 25% 미만의 염증 또는 섬유 화가 있는 경우 2점, 폐 실질의 25∼50%에서 염증 또는 섬유화가 있는 경우 3점, 폐 구조의 손상이 없이 기관지 벽의 비후, 작은 섬유화 결절이 있는 경우 4점, 폐 실질의 50% 이상의 염증 또는 섬유화는 5점, 폐 구조의 분명한 손상과 섬유화, 작은 섬유화 결절은 6점, 폐 실질의 50% 이상 염증 또는 섬유화, 폐 구조의 심한 섬유화와 왜곡은 7점으로 정의하였다9,10.. 5. 미세 전산화단층촬영소견의 분석 미세 전산화단층촬영에서 얻은 영상은 조직검사의 결 과를 모르는 두 명의 영상의학과 전문의들이 독립적으로 분석하였다. 영상들은 모두 다이콤 파일(Dicom file)로 TM 저장한 후 팍스(m-view ; Marotech, Seoul, Korea)에서 분석하였다. 미세 전산화단층촬영에서 촬영된 마리당 쥐 의 총 영상 수는 평균 170장이었으며, 각 마리당 촬영된 영상 수에 따라 폐를 위에서 아래로 10개의 구역으로 나 누었고, 또한 흉골을 중심으로 쥐의 폐를 좌측과 우측으.

(4) Tuberculosis and Respiratory Diseases Vol. 67. No. 5, Nov. 2009. Figure 1. Micro CT finding (A) and pathologic finding (B) of saline-treated mice. Both micro CT scan and lung tissue show normal findings (H&E stain, ×25).. 로 나누었다. 대조군과 실험군에서 얻은 영상에서 보이는 비정상 소 견의 위치와 패턴(pattern)에 대해서 알아보았다. 위치는 일측성 또는 양측성 여부를 분석하고, 중심성인지 주변성 인지 중심과 주변에 모두 생겼는지를 알아보았다. 영상 패턴은 소결절, 젖빛유리, 경화, 망상형 음영, 벌집모양, 기관지확장증으로 분류하였다. 젖빛유리는 폐혈관의 음 영이 보이는 정도의 음영 증가로 정의하였고, 경화는 폐혈 관이 보이지 않는 정도의 음영 증가로 정의하였다. 망상 형 음영은 선상 간질성 음영, 벌집모양은 1 cm 이하의 벽 두께를 가지고 있는 작은 낭성 공간이 있는 경우로 각 각 정의하였다. 기관지확장증은 비정상적으로 벽이 두꺼 워져 있으며, 기관지가 대조군이나 정상 기관지와 비교했 을 때 1.5배 이상 확장된 경우로 하였으며, 작은 결절은 1 cm 미만의 결절로 정의하였다. 영상 패턴에 따라 젖빛유리, 경화, 결절, 기관지확장증, 망상형, 벌집모양으로 분류된 병변은 각 패턴별로 병변이 전체 폐에서 차지하는 범위(extent)에 따라 0점부터 5점까 지 점수화하였다. 병변이 없는 경우는 0점, 병변이 5% 이 하인 경우는 1점, 병변이 5∼25%인 경우는 2점, 병변이 25∼50%인 경우는 3점, 병변이 50∼75%인 경우는 4점, 병변이 75% 이상인 경우는 5점으로 하였다.. 6. 통계 처리 3주와 6주째에 실시한 미세 전산화단층촬영에서 보이 는 병변의 범위에 따른 영상화 점수와 조직에서 폐 염증 및 섬유화의 병리학적 점수 사이의 상관관계 분석을 위해. Table 1. Micro CT findings according to pattern in bleomycin-treated mice. Normal Bronchiectasis Small nodule Reticular Honeycomb Ground-glass opacity Consolidation. 3 weeks. 6 weeks. ＋ − − − − ＋＋. − ＋＋＋ − ＋＋. SPSS (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) Spearman rank correlation를 이용하였다.. 결. 과. 미세 전산화단층촬영의 영상 분석에 대한 두 관찰자의 변이는 Kappa test를 이용하였으며, k 값은 0.87이었다. 생리 식염수를 투여한 3주 후에 대조군에서 시행한 micro CT와 폐 조직 소견은 모두 정상 소견을 보였다(Figure 1). 블레오마이신을 투여한 실험군의 경우 3주와 6주에 촬영한 미세 전산화단층촬영상 병변의 위치를 보면 일측 성과 양측성이 각각 50%에서 나타났다. 병변의 위치는 3 주에는 중심부(20%), 주변부(30%), 중심부와 주변부에 분 산된 경우(40%)로 나타났지만, 6주째에는 100%에서 중심 부와 주변부에 분산되어 나타났다. 3주째 미세 전산화단층촬영에서 보여지는 비정상적인. 439.

(5) JA Lee et al: Micro CT in bleomycin-induced lung fibrosis. 소견으로는 젖빛유리와 경화가 있었다(Table 1). 6주째에 는 3주째에 관찰되던 젖빛유리와 경화뿐 아니라, 소결절 (Figure 2), 기관지확장증, 망상형의 다양한 소견이 보였 다. 일반적으로 영상학적으로 섬유화의 초기 소견으로 여 겨지는 망상형이나 기관지확장증은 블레오마이신을 투여 한 6주 후부터 미세 전산화단층촬영에서 관찰되어, 블레 오마이신 유도 폐 섬유화 쥐 모델에서 미세 전산화단층촬 영을 통해 폐 섬유화를 평가하기 위해서는 6주 정도가 필. 요함을 알 수 있었다. 조직 소견을 분석해 보면, 블레오마이신을 투여한 3주 후에는 주로 기관지 주변에 많은 염증 세포가 침윤되어 있는 소견이 관찰되었고, 일부에서 기관지 벽과 간질의 비후가 있었다. 염증이 폐 조직에서 차지하는 범위는 대 부분 50% 이하였다. 6주째의 조직에서는 광범위한 염증 세포의 침윤, 기관지 벽의 비후와 콜라겐의 침착, 섬유화 결절, 국소적인 벌집모양의 간질 비후 등의 진행된 염증. Figure 2. Micro CT finding (A) and pathologic finding (B) of bleomycin-treated mice that is classified as small nodule according to the pattern of micro CT finding. Micro CT scanning and histological sampling were performed at 6 weeks after the administration of bleomycin solution. (A) Micro CT shows two small nodules (white arrow) in right lower lobe on micro CT. (B) Histological finding shows an aggregation of inflammatory cells (black arrow) with fibroblast around bronchus (H&E stain, ×25).. Figure 3. Micro CT finding (A) and pathologic finding (B) of bleomycin-treated mice that is classified as consolidation according to the pattern of micro CT finding. Micro CT scanning and histological sampling were performed at 3 weeks after the administration of bleomycin solution. (A) Micro CT shows the consolidation (white arrow) in left lower lobe. (B) Histological finding shows many inflammatory cells around bronchi, alveoli (black arrow), and alveolar septa (H&E stain, ×25).. 440.

(6) Tuberculosis and Respiratory Diseases Vol. 67. No. 5, Nov. 2009. 소견과 폐 섬유화의 소견이 관찰되었다. 미세 전산화단층촬영상 나타나는 각 패턴별로 영상학 적 점수와 폐 조직의 병리학적 점수 사이의 상관 관계를 분석해 보면, 젖빛유리(r=0.84, p＜0.05)와 경화(r=0.69, p＜0.05)가 조직의 염증 정도와 밀접한 관련이 있었다 (Figure 3). 폐 섬유화를 예측할 수 있는 영상학적 패턴인 기관지확장증(r=0.63, p＜0.05)과 망상형(r=0.83, p＜ 0.05) 소견은 조직학적 섬유화 정도와 의미 있는 상관관계. 를 나타내었다(Figure 4). 기관지확장증과 망상형 패턴은 영상학적 점수를 통해 평가해 보아도 미세 전산화단층촬 영상 블레오마이신 투여 6주 후 비교적 많이 발견될 수 있는 소견으로 나타났다(Table 2). 블레오마이신 투여 3 주째와 6주째 모두에서 나타나는 패턴인 젖빛유리와 경화 의 시간대별 변화를 분석해 보면, 젖빛유리는 3주째보다 는 6주째에 더 증가되며(1.86 vs. 3.30), 경화의 경우에는 오히려 6주가 되면서 감소되는 특징을 보였다(0.68 vs.. Figure 4. Micro CT finding (A) and pathologic finding (B) of bleomycin-treated mice that show many patterns related with lung fibrosis on micro CT. Micro CT scanning and histological sampling were performed at 6 weeks after the administration of bleomycin solution. (A) Micro CT shows diffuse ground-glass opacity, reticular opacity (white arrow), bronchiolectasis, and small nodule in left lower lobe. (B) Histological finding shows dense collagen deposition and interstitial fibrosis (black arrow) (H&E stain, ×25). Table 2. Histological scoring and imaging scoring of saline- or bleomycin-treated mice Patterns Histological scoring. Imaging scoring. Ground-glass opacity Consolidation Nodule Bronchiectasis Reticular opacity Honeycomb. Type of models Saline Bleomycin/3 Bleomycin/6 Bleomycin/3 Bleomycin/6 Bleomycin/3 Bleomycin/6 Bleomycin/3 Bleomycin/6 Bleomycin/3 Bleomycin/6 Bleomycin/3 Bleomycin/6 Bleomycin/3 Bleomycin/6. weeks weeks weeks weeks weeks weeks weeks weeks weeks weeks weeks weeks weeks weeks. Scoring Not detect 1.56±1.27 4.60±1.35 1.86±1.21 3.30±1.50 0.68±1.52 0.42±0.70 0.00±0.00 0.04±0.08 0.00±0.00 0.74±0.80 0.00±0.00 2.45±1.24 0.00±0.00 0.00±0.00. r*. p-value*. 0.84. ＜0.05. 0.69. ＜0.05. 0.07. 0.84. 0.63. ＜0.05. 0.83. ＜0.05. 0.00. 1.00. *Correlation between histological scoring and imaging scoring.. 441.

(7) JA Lee et al: Micro CT in bleomycin-induced lung fibrosis. Figure 5. Micro CT finding (A) and pathologic finding (B) of bleomycin-treated mice that have severe lung fibrosis. Micro CT scanning and histological sampling were performed at 6 weeks after the administration of bleomycin solution. (A) Micro CT shows diffuse ground-glass opacity with reticular pattern (white arrow) in left lower lobe. (B) Histological finding shows a reticular pattern (black arrow) due to severe interstitial fibrosis with destruction (H&E stain, ×25).. 고. Figure 6. Correlation between imaging scoring (extent of lung with abnormal findings) in micro CT and histological scoring of pulmonary inflammation or fibrosis.. 0.42) (Table 2). 조직 소견상의 벌집모양은 6주째의 실험 군 5마리 중 1마리에서만 보였으며, 이 쥐 모델의 미세 전산화단층촬영 소견은 젖빛유리와 망상형이 동반된 형 태로 보였다(Figure 5). 미세 전산화단층촬영상 병변의 범위에 따른 영상학적 점수와 병리학적 점수의 상관성을 전체적으로 분석한 결과 유의한 상관관계를 나타내었다(r=0.842, p＜0.05) (Figure 6).. 442. 찰. 본 연구는 블레오마이신을 쥐에 투여하여 만들어진 폐 섬유화 모델에 대해 블레오마이신 투여 3주 후와 6주 후 에 미세 전산화단층촬영을 시행하여 블레오마이신에 의 해 유발되는 폐 섬유화의 과정을 영상화하여 확인할 수 있었다. 이전에 발표된 연구의 결과를 보면, 블레오마이 신을 투여한 후 2주와 4주째에 경화나 젖빛유리, 기관지 벽의 비후가 미세 전산화단층촬영상 관찰되는 소견으로 나타났고, 이러한 소견은 조직학적으로 나타나는 폐 염증 과 연관성을 가지고 있었다7. 또한, 8주째에 폐 섬유화 소 견으로 기관지확장증, 망상형, 벌집모양이 미세 전산화단 층촬영상 관찰되었고, 조직 소견상 폐 섬유화와 밀접한 7 연관이 있음을 확인하였다 . 비록 영상 획득의 시기에 있 어 약간의 차이로 인하여 그 결과가 완전히 일치하지는 않았지만, 본 연구에서도 3주와 6주째 이와 비슷한 결과 를 보여 경화, 젖빛유리, 기관지확장증, 망상형이 블레오 마이신 유발 폐 섬유화 쥐 모델에서 나타나는 주된 미세 전산화단층촬영의 소견임을 확인하였다. 본 연구에서 블 레오마이신을 투여한 후 3주째에는 조직학적으로 폐의 염 증 소견이 주로 관찰되었고, 이는 미세 전산화단층촬영상 경화와 젖빛유리의 소견으로 나타났다. 블레오마이신을 투여한 후 6주가 되면 폐 손상으로 인한 폐 섬유화가 조직 학적으로 확인되었고, 이러한 조직 소견은 미세 전산화단.

(8) Tuberculosis and Respiratory Diseases Vol. 67. No. 5, Nov. 2009. 층촬영상 기관지확장증과 망상형의 음영을 발견함으로써 예측할 수 있었다. 그러나, 저자들의 연구에서는 조직 소 견상 벌집모양의 폐 섬유화가 일부 있었음에도 불구하고 미세 전산화단층촬영상 벌집모양은 보이지 않았는데, 이 것은 시기적으로 블레오마이신을 투여한 후 발생한 벌집 모양을 발견하기는 이르거나, 국소적인 벌집모양 음영을 발견하기에는 여전히 미세 전산화단층촬영의 해상도가 낮기 때문일 것으로 생각된다. 본 연구에서 70마리의 쥐에 대해 미세 전산화단층촬영 을 시행하였지만 20마리에서만 영상 분석이 가능했다. 대 조군의 경우 10마리 중 8마리(80%)에서 분석이 가능하였 는데, 분석 가능한 영상을 얻지 못한 2마리는 마취가 잘 되지 않아서 인공음영이 심한 영상을 얻었기 때문이었으 므로 미세 전산화단층촬영의 촬영 방법이나 해상도의 문 제는 아닌 것으로 생각된다. 블레오마이신을 투여한 쥐의 경우 60마리 중 단지 12마리(20%)에서만 분석이 가능한 영상을 얻었다. 영상 분석이 불가능했던 원인으로는 블레 오마이신을 투여했음에도 불구하고 3주나 6주 영상에서 정상을 보이거나(n=30), 폐 손상으로 인해 호흡 조절이 더욱 어려워져 호흡 인공음영이 심한 경우가 가장 많았다. 본 연구의 경우, 전체 실험 모델의 50%에서 폐 섬유화 모 델을 만드는데 실패를 하여 모델을 만드는 성공률이 상당 히 낮게 나타났다. 그 이유로는 실험 연구원의 기술적인 미숙, 부정확한 용량의 블레오마이신의 투여, 개체 차이 등을 고려할 수 있다. 다른 연구에서도 블레오마이신을 투여한 후 촬영한 모든 쥐에서 미세 전산화단층촬영상 벌 집모양의 심한 섬유화 소견이 관찰되는 것은 아니었으며, 쥐의 개체상 특성에 의해서 폐 섬유화가 나타나지 않거나 6주가 지나서 나타날 수도 있다7. Genovese 등9은 블레오 마이신을 투여한 후 매우 짧은 간격인 15일 만에 쥐를 희 생시켰음에도 불구하고, 조직학적으로 폐 섬유화를 확인 하였다. 그러나 이 논문의 경우 블레오마이신을 투여한 쥐에서 폐 섬유화 정도를 확인하는 정확한 방법에 대해서 는 언급이 되어 있지는 않다. 아직까지 미세 전산화단층 촬영을 제외하고는 블레오마이신을 투여한 후 살아있는 채로 쥐 모델의 폐 섬유화 진행 정도를 측정할 수 있는 방법은 없다. 따라서, 현재까지 제기된 블레오마이신 유 발 폐 섬유화 쥐 모델을 만드는 방법상의 다양한 인자들을 보정하여 미세 전산화단층촬영을 시행한다면, 향후 미세 전산화단층촬영은 폐 섬유화의 유발 유무와 폐 손상의 정 도를 평가하는 데 있어 매우 중요한 역할을 할 것으로 생 각된다. 또한, 이러한 기술이 기반이 되어 블레오마이신. 외의 자극을 통해 유발된 다른 폐 섬유화 동물 모델로도 적용 가능한 실험 방법으로 발전할 수 있을 것이며, 궁극 적으로는 폐 섬유화를 비롯한 다양한 폐 손상에 대한 치료 제 개발 연구의 밑바탕이 될 수 있을 것이다. 미세 전산화단층촬영을 이용하여 폐 섬유화의 적절한 평가를 위해서는 높은 해상도를 가진 좋은 영상을 얻기 위한 영상학적 기술 발전이 우선되어야 한다. 병리적 소 견은 쥐가 죽은 상태에서 얻기 때문에 측정 기술의 차이가 중요하게 작용하지 않지만, 미세 전산화단층촬영의 경우 실험 모델 쥐가 살아있는 상태에서 영상이 얻어지므로 기 술적 차이에 의해 폐 섬유화 정도의 평가도 크게 달라질 수 있기 때문이다. 특히, 폐 섬유화가 진행되어 동물의 호 흡 조절이 어려운 상태에서 영상을 얻기는 상당한 어려움 이 있다. 본 연구에서도 6주째에 시행된 미세 전산화단층 촬영의 경우 호흡으로 인한 인공음영이 심하게 나타나서 영상 분석을 할 수 없는 쥐가 3주째의 실험군보다 많았다. 쥐를 살아있는 채로 영상을 얻기 위해 최근에는 쥐를 마취 한 후 호흡 동기(respiratory gating) 또는 심장 동기(cardiac gating)을 하면서 촬영을 한다. 이런 방법으로 촬영을 하면 쥐를 죽이지 않아도 분석이 가능한 좋은 질의 영상을 얻을 수 있다11,12. Johnson6은 블레오마이신을 투여한 쥐 의 폐를 영상화하기 위해 호흡 주기 중 호기 말과 흡기 말에 영상을 호흡과 동기화해서 얻었다. 이러한 동기화 방법을 적절히 이용하여 살아있는 쥐에서 영상을 얻은 경 우, 쥐를 죽여서 촬영한 경우와 비교했을 때 폐 섬유화를 정량화하는 데 차이가 없었다6. 본 연구에서는 호흡 동기 나 심장 동기 없이 마취를 이용해서 최대한 호흡을 천천히 하도록 유도해서 미세 전산화단층촬영을 시행하였지만 좋은 영상을 얻은 성공률은 높지 않았고, 특히 블레오마이 신을 투여한 후 6주째에 폐 섬유화가 진행되어서 호흡이 가빠지는 경우 분석이 가능한 영상을 얻기는 무척 어려웠 다. 따라서, 향후 블레오마이신을 이용한 폐 섬유화 정도 를 영상적으로 정확히 평가하기 위해서는 호흡 및 심장 동기 방법을 이용하여 분석 가능한 좋은 영상을 얻는 것이 우선되어야 할 것이며, 이러한 연구가 진행된다면 본 연구 에서 얻은 결과보다 더 좋은 결과를 얻을 수 있으리라 기 대해 본다. 현재까지 폐 조직의 병적 변화를 분석하는 데 기준이 되는 방법은 절제된 폐 조직을 현미경으로 검사하는 방법 이다. 그러나, 이러한 방법도 완전할 수는 없고 문제점이 나 제한점을 가지고 있다. 검사할 폐 조직을 만드는 중 탈수나 조직을 자르는 과정 중 발생하는 기술적인 오류가. 443.

(9) JA Lee et al: Micro CT in bleomycin-induced lung fibrosis. 여전히 존재하고, 폐 전체를 검사하기 보다는 절제된 폐 조직의 일부만 검사를 하기 때문에 병변 부위가 선택되지 않으면 정상으로 오인될 수도 있으며, 일단 면역 염색 등 의 특수 처치가 시행되면 그 조직으로는 다른 검사를 다시 할 수 없는 어려운 점이 있다. 또한, 시간대별 병변의 변화 를 알기 위해서는 각 시간에 해당하는 시기에 동물을 희생 시켜야 하는 단점이 있다. 이에 비해 미세 전산화단층촬 영의 경우 실험쥐의 폐 전체를 동시에 검사할 수 있고, 반복적인 촬영을 통해서 조직에 손상을 주지 않고 병변 부위를 반복적으로 또한 시간대별로 여러 번 검사할 수 있으며, 촬영한 후 재구성을 통해서 폐 병변의 절단면 두 께를 다양하게 해서 보다 정확하게 병변 부위를 평가할 수 있다. 또한, 정성 분석과 정량적인 분석이 모두 가능하 다는 장점이 있다. 더욱이 미세 전산화단층촬영을 통해 폐 전체 중 가장 비정상적 소견을 보이는 부위를 확인 한 후에 조직 검사나 면역 검사를 시행할 수 있게 도와주어 병리학적 병변의 평가에도 큰 도움을 줄 수 있다1,5. 이 연구의 제한점으로는 앞에서 언급하였듯이 호흡 동 기 없이 미세 전산화단층촬영을 시행함으로써 영상 분석 을 할 수 있었던 쥐의 숫자가 적었고, 폐 섬유화를 볼 수 있는 촬영 시기를 블레오마이신 투여 후 6주로 함으로써 영상에서 벌집모양을 볼 수 없었다는 것이다. 본 연구를 더욱 발전시키기 위해서는 향후 호흡 동기를 하면서 미세 전산화단층촬영을 추가로 촬영해야 하며, 미세 전산화단 층촬영의 기술적인 발달을 토대로 블레오마이신 투여 6주 후 정도의 시기에도 벌집모양이 확인될 수 있도록 해상도 를 더 높여야 하고, 6주 이후에는 폐 섬유화가 어떻게 진 행되는지 추가적인 영상 자료가 필요할 것으로 생각된다. 결론적으로 본 연구는 미세 전산화단층촬영상 블레오 마이신에 의한 폐 손상 3주 후의 소견은 젖빛유리 음영과 경화의 패턴으로 나타나며, 6주 후에는 젖빛유리, 기관지 확장증, 망상형의 패턴이 주로 나타남을 알 수 있었고, 이 러한 영상학적 소견이 폐 조직 검사에서 병리학적으로 확 인되는 폐 염증 및 섬유화 과정과 상관관계를 가짐을 확인 하였다. 향후 미세 전산화단층촬영은 블레오마이신 유도 폐 섬유화 쥐 모델의 연구를 비롯한 다양한 폐 섬유화와 관련된 연구에서 폐 조직 검사 전에 적절한 실험 모델이 만들어졌는지 병변을 확인할 수 있는 방법으로 또는 폐 섬유화 치료제 개발을 위한 실험에서 치료 효과를 평가하. 444. 기 위한 방법으로 그 중요성을 더할 것으로 생각된다.. 참 고 문 헌 1. Gross TJ, Hunninghake GW. Idiopathic pulmonary fibrosis. N Engl J Med 2001;345:517-25. 2. Moeller A, Ask K, Warburton D, Gauldie J, Kolb M. The bleomycin animal model: a useful tool to investigate treatment options for idiopathic pulmonary fibrosis? Int J Biochem Cell Biol 2008;40:362-82. 3. Sleijfer S. Bleomycin-induced pneumonitis. Chest 2001; 120:617-24. 4. Ritman EL. Micro-computed tomography of the lungs and pulmonary-vascular system. Proc Am Thorac Soc 2005;2:477-80, 501. 5. Ritman EL. Micro-computed tomography-current status and developments. Annu Rev Biomed Eng 2004;6:185208. 6. Johnson KA. Imaging techniques for small animal imaging models of pulmonary disease: micro-CT. Toxicol Pathol 2007;35:59-64. 7. Lee HJ, Goo JM, Kim NR, Kim MA, Chung DH, Son KR, et al. Semiquantitative measurement of murine bleomycin-induced lung fibrosis in in vivo and postmortem conditions using microcomputed tomography: correlation with pathologic scores--initial results. Invest Radiol 2008;43:453-60. 8. Cavanaugh D, Travis EL, Price RE, Gladish G, White RA, Wang M, et al. Quantification of bleomycin-induced murine lung damage in vivo with micro-computed tomography. Acad Radiol 2006;13:1505-12. 9. Genovese T, Cuzzocrea S, Di Paola R, Mazzon E, Mastruzzo C, Catalano P, et al. Effect of rosiglitazone and 15-deoxy-Delta12, 14-prostaglandin J2 on bleomycin-induced lung injury. Eur Respir J 2005;25:225-34. 10. Ashcroft T, Simpson JM, Timbrell V. Simple method of estimating severity of pulmonary fibrosis on a numerical scale. J Clin Pathol 1988;41:467-70. 11. Langheinrich AC, Leithäuser B, Greschus S, Von Gerlach S, Breithecker A, Matthias FR, et al. Acute rat lung injury: feasibility of assessment with micro-CT. Radiology 2004;233:165-71. 12. Ford NL, Wheatley AR, Holdsworth DW, Drangova M. Optimization of a retrospective technique for respiratory-gated high speed micro-CT of free-breathing rodents. Phys Med Biol 2007;52:5749-69..

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