사랑과 열정으로 더불어 함께 하는 세상 만들기 - 율촌재단(栗村財團)

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(1)Prototype 생물 반응기를 이용한 고분지 나노 올리고 덱스트란 합성과 프로바이오틱으로서의 기능성 연구 유선균 중부대학교 한방건강식품학과. 1. 서 론 프리바이오틱은“활성촉진제라고 부르기도 하며 장(colon)에 유익한 미생물의 대사와 성장을 선 택적으로 활성화하여 인체에 유익하도록 영향을 미치는 난소화성 식품 성분(non-digestible food ingredient)”으로 정의한다. 탄수화물 중에 프리바이오틱 탄수화물은 1) 인체의 소화·흡수 과정 에 저항하고, 2) 장내에 존재하는 세균에 의하여 이용이 될 수 있으며, 3) 제한된 수의 세균의 활성 (activity)과 성장(growth)을 선택적으로 자극하는 기능을 지니는 소재이어야 한다. 이 중에서 프리 바이오틱으로서 난소화성 올리고당은 소장에서 소화되지 않고 대장에 도달하여 Bifidobacterium spp. Bacteroides f ragilis, Peptostreptococcus spp.와 같은 장내 유익균 증식에 기여하고 Salmonella, Campylobacter, Clostridium 같은 장내 유해균의 증식을 억제하여, 장내 균총 개선, 병원균의 감염 방지, 장내 부패억제, 비타민의 생산 그리고 장의 운동을 활발히 하는 데 유용한 효과를 나타내 는 것으로 알려졌다. 기능성 식품 시장에서 판매되고 있는 난소화성 올리고당은 프럭토 올리고 당과 이소말토 올리고당이 시럽 형태로 판매되고 있는데, 최종제품에 반응하지 않은 프럭토 올 리고당 제품인 경우에는 30% 이상의 소화성 과당이 함유되어 있고 이소말토 올리고당에는 50% 이상의 비기능성 당들인 포도당, 말토 올리고당들이 포함되어 있는 것으로 알려졌다. 현재 생산 되고 있는 기능성 올리고당의 생산 방식은 주로 효소를 이용하여 생산하는데, 최종 생산된 올리 고당 중에 난소화성 올리고당을 분리 정제하기 어려운 실정으로 상당한 양의 기질인 당과 소화 성 올리고당이 함유된 채로 판매되고 있다. 따라서 아직 산업화 단계로 접어들지 않았지만 주로 선형 결합 α-1→6 glucose를 주쇄 (backbone) 로 하여 α-1→4 glucose 분지(branch) 덱스트란을 생산하는 Leuconostoc mesenteroides 계 통 균주로 산과 열에 강한 기능성 올리고덱스트란을 합성하는 연구가 많이 시도되고 있다. 하지 만 대부분 α-1→6 glucose 선형 결합형태의 덱스트란은 가수분해효소들에 의하여 비교적 빠르게. 271. 유선균.indd 271. 2010-04-16 오후 5:17:34.

(2) 분해되기 때문에 장내 해로운 미생물 균총들에 의하여 이용될 가능성이 높은 것으로 보인다. 이 를 극복하기 위하여 α-1→6 glucose 선형(linear)을 주쇄(backbone)로 하여 α-1→2 glucose, α-1→3 glucose, α-1→4 glucose 등으로 이루어진 고분지(highly branched) 올리고덱스트란을 합성한다면, 장내 유익한 미생물들의 증식을 선별적으로 도울 수 있는 대체 항생제로서의 뛰어난 기능성을 가진 프리바이오틱 올리고덱스트란을 생산할 수 있을 것이다. 따라서 본 연구는 덱스트란 생산 균주들로부터 말토오스를 수용체로 올리고덱스트란 생산조건을 확립하고 prototype reactor에서 균체고정화를 통하여 대량생산의 기초연구를 수립하였다.. 2. 연구방법 2.1 올리고덱스트란 생산 균주의 선정 실험에 사용된 Leuconostoc mesenteroides ATCC 12291균주는 동결 건조된 형태로 한국미생물 보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM, Seoul)로부터 구입을 하여 5℃에 서 냉장 보관하면서 Tryptic soy Broth(TSB, Becton, Dickinson and Company, USA)에 설탕 2% 를 첨가한 배지에서 계대배양을 하고, 보관균주는 TSB에 설탕 2%를 첨가한 배지에서 배양된 배양액 1ml에서 250µl 글리세롤을 첨가하여 -20℃에 보관하였다.. 2.2 실험에 사용된 시약 균주의 배양에 사용된 배지는 Tryptic soy Agar(TSA, Becton, Dickinson and Company, USA)와 TSB, 그리고 실험실에서 합성한 염배지(mineral medium; MM); KH2PO4 3g/l; FeSO4·H2O 0.01g/l; MnSO·4H2O 0.01g/l; MgSO4·7H2O 0.2g/l; NaCl 0.01g/l; CaCl2 0.05g/l를 이용하였다. 덱스트란을 생 산하기 위한 기질인 설탕은 백설탕(CJ제일제당, Incheon)을 사용하였고 수용체 반응에는 말토 오스(Yakuri Pure Co., Kyoto Japan)를 사용하였다. 물질분리에 사용된 Acetonitril, Ethyl Acetate, Methyl Acetate, 1-Propanol 등의 용매는 Mallinckrodt Baker, Inc.(USA)에서 구입한 일급 또는 특급 시약을 사용하였다. Ethyl Alcohol, Sulfuric Acid는 대정화금의 제품을 사용하였고, α-napthtol은 Sigma제품을 사용하였다.. 272. 유선균.indd 272. 2010-04-16 오후 5:17:34.

(3) 2.3 발효에 의한 올리고덱스트란 최적 생산 조건에 대한 연구 수용체 반응을 위한 배지 조성 실험에서 사용한 수용체 반응을 이용한 발효에 사용된 배지의 조성은 MM배지에 5%(w/v) 수 크로오스와 2.5% 말토오스를 첨가하였고 yeast extract양은 각 실험 조건에 맞게 제조하여 사 용하였다.. 반응표면 분석을 위한 실험계획 올리고덱스트란 생산 최적 조건을 구하기 위하여 모든 실험 계획은 3개의 독립변수 즉, 배양온 도, 배양 초기 pH, 효모추출물의 농도를 각각 30℃, pH 6.5, 0.5%로 하는 center run을 5번 반복하 는 것은 포함하여 총 17개의 처리 조합으로 구성을 하였다. Box-Benken design은 세 가지의 중요 한 절차에 따라 진행이 되는데, 첫째는 계획된 실험(designed experiment)에 따라 통계적으로 실험 을 수행하고, 둘째는 수식 모델의 계수(coefficients of model)를 구하고, 셋째는 모델의 적합성을 판정하는 것으로 진행이 된다. 본 실험에서의 반응 변수들은 올리고덱스트란 생산량, 올리고덱 스트란 생산 수율, 균체량 생산, 단위 균체당 올리고덱스트란 생산 수율로 하였다. 통계적인 계 산을 원활히 하기 위하여 독립 변수를 다음과 같이 표준화(code)하여 사용하였다. 세 개의 변수 들을 각각 X1(온도), X2(pH),k X3(효모추출물)로 하였다. 표준화의 값들은 다음과 같은 공식에 k Y = B0 + ∑ BiXi + ∑ BijXiXj i=1Z로 하였다. i=j=1 의하여 구할 수 있고 그 값을 Z = (X - X0)/ДX · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · (1). X0는 표준화 값의 중심 값이고 X 는 표준화 값이다. ΔX 는 1단위만큼의 증가 또는 감소하는. Y = B0 + B1X1 + B2X2 + B3X3 + B12X1X2 + B13X1X3 2 2 분석법을 2 사용하였으며 최적 공정 조건을 나 값의 크기이다. 실험결과에 반응 + B12대한 X2X3분석은 + B11X표면 1 + B22X 2 + B33X 3. 타내는 다중 회귀식은 다음과 같다. k. k. i=1. i=j=1. Y = B0 + ∑ BiXi + ∑ BijXiXj · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · (2). 여기서 Y는 predicted response이고 본 실험처럼 3개의 변수가 있을 경우에는 k값이 3이 되고 궁 Z = (X - X0)/ДX 극적으로 다음과 같은 식으로 표현된다. Y = B0 + B1X1 + B2X2 + B3X3 + B12X1X2 + B13X1X3 · · · · · · · (3) + B12X2X3 + B11X21 + B22X22 + B33X23. 실험 후에 확정된 결과들의 통계분석은 Design Expert(Couresy: Stat-ease Inc., Statistics Made Easy, Minneapolis, USA)를 사용하였다. 독립변수들의 값의 선택은 예비 실험에서 얻은 결과로부터 선 택을 하여 X1(온도)은 25℃(-1), 30℃(0), 35℃(+1)로 정하고, X2 (pH)는 5.5(-1), 6.5(0), 7.5(+1)로 하고 X3(효모추출물의 농도)는 0.1(-1), 0.5(0), 0.9(+1)%로 하였다(표 1). 올리고덱스트란 생산발효는. Prototype 생물 반응기를 이용한 고분지 나노 올리고 덱스트란 합성과 프로바이오틱으로서의 기능성 연구. 유선균.indd 273. 273. 2010-04-16 오후 5:17:35.

(4) 표 1 levels of independent variables in Box-Benken design. Xi. Independent variables. X1. Level -1. 0. 1. Culture temperature (℃). 25. 30. 35. X2. Culture pH. 5.5. 6.5. 7.5. X3. Yeast extract concentration. 0.1. 0.5. 0.9. 50ml MM을 담고 있는 250ml 배양 플라스크를 이용하였는데, 각각 플라스크 배양에 대하여 1% (v/v)의 배양액을 접종하였다.. 2.4 균체고정화 반응을 이용한 올리고덱스트란의 생산 균체의 고정화는 1l 삼각 플라스크에 담긴 400ml의 MMY3S1.5M배지에서 30℃, 100rpm으로 24시 간 동안 배양한 Leuconostoc mesenteroides ATCC 12291배양액을 멸균된 활성탄과 혼합하여 시행 되었다. 사용되어진 활성탄의 무게는 약 84g으로서 최종 고정화된 세포의 양은 건조 균체량으로 보면 대략 0.069g 균체량/g 활성탄 양이었다. 균체 고정화 반응기는 28mm × 200mm로 된 이중 jacket 유리로 제작되었다. 배지는 2ml/min의 속도로 roller pump에 의하여 이송되었다. 배지는 3% 수크로오스와 1.5% 말토오스를 포함한 500ml MMY가 1000ml 플라스크에 옮겨져 pH 6.5로 조 정된 후에 멸균을 하였다. TLC로 분석을 하여 프룩토오스의 양이 완전히 소모될 때까지 진행하 였다(그림 1).. Recycling pump. Thermocirculator. Bioreactor MMY + 5% sucrose + 2.5% maltose. 그림1 Schematic representation of bioreactor used in this work.. 274. 유선균.indd 274. 2010-04-16 오후 5:17:35.

(5) 2.5 선택된 병원성 균과 Bi fidobaterium의 증식에 대한 올리고덱스트란의 영향 생산된 올리고덱스트란을 탄소원으로 하여 혐기성균 들인 Salmonella t yphimurium, Salmonella enteritidis, Sta ph ylococcus e pidermidis, Sta ph ylococcus aureus 및 Bi f idobacterium bi f idum, Bifidobacterium pullorum의 증식에 미치는 영향에 대하여 실험을 하였다. 탄소원으로서 올리고덱 스트란의 농도는 1.0%(w/v)이었고, 글루코스를 탄소원으로 하여 증식한 정도를 100%로 하여 비 교하였다.. 2.6 분석방법 균체량의 측정은 L. mesenteroides ATCC 12291 를 5% (w/v) 수크로오스를 포함한 1,000ml MMY 를 30℃에서 24시간 동안 배양한 후 멸균된 250ml 원심분리 용기에 옮겨 담은 후 원심분리기를 사용하여 상층액과 균체를 분리하였다. 상등액을 제거하고 완충용액으로 3회 세척하였다. 세척 된 균체를 완충용액을 이용하여 단계별로 희석하였다. 정량의 희석된 균체용액으로부터 일정량 을 알루미늄 그릇에 넣고 건조기를 이용하여 건조 균체량을 측정하고 균체용액에서 건조 균체 량의 측정과 같은 비율의 균체용액을 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 흡광도를 측정 하였다. 건조 균체량과 흡광도를 이용하여 표준곡선을 그리고 발효 중 균체량 측정에 이용하 였다. 발효 공정 중 당들과 올리고덱스트란은 TLC(thin layer chromatography)에 의하여 분석을 하였다. TLC의 전개 용매는 85ml Acetonitril, 20ml Ethyl Acetate, 20ml 1-Propanol, 15ml 물의 비율 로 혼합하여 사용하였으며, 발색시약은 5% H2SO4를 ethanol에 혼합하여 제조 사용하였다. TLC 상에 당 및 올리고덱스트란 크로마토그램들은 densitometry 방법으로 분석하였다(Scion Image, Frederick, Maryland, USA).. 3. 결과 및 고찰 3.1 L. mesenteroides ATCC 12291에 의한 올리고덱스트란 생산 최적화 L. mesenteroides ATCC 12291을 이용하여 5% 수크로오스와 2.5% 말토오스로부터 올리고덱스트 란 생산의 최적 조건요인들인 배양온도, pH, 효모 추출물 농도의 3개의 실험변수에 대하여 BoxBenken 디자인으로 실험을 설계하여 얻어진 실험결과를 표 2에 나타내었다. 올리고덱스트란 생 산의 효율성을 나타내는 중요한 요인들인 총 올리고덱스트란 생산량, 균체량, 올리고덱스트란 생산 수율의 측정값은 표 2에 나타내었다. 실험결과 올리고덱스트란 생산은 4.70~23.16g/l이고,. Prototype 생물 반응기를 이용한 고분지 나노 올리고 덱스트란 합성과 프로바이오틱으로서의 기능성 연구. 유선균.indd 275. 275. 2010-04-16 오후 5:17:35.

(6) 표 2 Experimental data of Oligodextran production, biomass, Oligodextran yield, and sepecific yield by L. mesenteroides ATCC 12291 Sample. Temperature. pH Yeast extract. Oligodextran. Cell mass. Oligodextran. Specific. (g/l). (g/l). yield (%). yield. 1. -1. -1. 0. 8.00. 1.62. 65.70. 4.93. 2. 1. -1. 0. 2.00. 0.26. 22.58. 7.75. 3. -1. 1. 0. 20.00. 3.12. 90.87. 6.42. 4. 1. 1. 0. 16.00. 2.40. 78.96. 6.66. 5. -1. 0. -1. 12.00. 1.46. 74.37. 8.22. 6. 1. 0. -1. 6.00. 1.24. 53.58. 4.82. 7. -1. 0. 1. 20.00. 2.41. 85.11. 8.30. 8. 1. 0. 1. 10.00. 2.25. 62.14. 4.44. 9. 0. -1. -1. 2.00. 0.49. 20.79. 4.11. 10. 0. 1. -1. 18.00. 2.09. 81.31. 8.62. 11. 0. -1. 1. 6.00. 1.70. 45.46. 3.54. 12. 0. 1. 1. 18.00. 2.89. 76.60. 6.23. 13. 0. 0. 0. 10.00. 1.90. 60.08. 5.28. 14. 0. 0. 0. 11.50. 2.10. 61.68. 5.55. 15. 0. 0. 0. 9.80. 1.98. 59.89. 5.34. 16. 0. 0. 0. 10.50. 2.12. 62.05. 5.89. 17. 0. 0. 0. 11.50. 2.05. 61.50. 5.45. 균체량 생산은 2~20g/l, 수율은 20.79~90.82%, 단위균체당 올리고덱스트란 생산 수율은 4.11~8.22 의 범위에서 측정값이 얻어졌다. 표 2의 실험결과를 이용한 회귀식에 대한 분산분석의 결과는 반응표면분석법에 의해 수립된 모델의 적합성 여부를 알려준다. quadratic 회기 모델의 분산분석 결과가 표 3에서 보여진다. 이들의 결과에 따르면 올리고덱스트란 생산, 균체 생산, 올리고덱스트란 생산 수율들은 배양 온도, 배양 pH, 효모추출물 농도의 영향을 받는다는 것이 95% 수준 이내에서 유의성이 인정되었 다. 모델 결정계수(determination coefficient) R2은 실험값(observed value)과 예측값(predicted value) 과 상호연관(correlation) 정도를 보여주는데, 올리고덱스트란 생산량 0.98, 균체 생산량 0.95, 올리 고덱스트란 생산 수율 0.98, 단위 균체당 올리고덱스트란 생산 수율 0.98이므로 이 모델은 2~5% 범위에서 설명되지 않는다는 것을 보여준다. 표 4는 모델의 회귀계수를 나타내는 것으로 균체량, 올리고덱스트란 생산, 생산 수율, 균체당 올리고덱스트란 생산 수율이 세 가지 요인들에 크게 영 향을 받는 것으로 나타났다(P<0.05).. 276. 유선균.indd 276. 2010-04-16 오후 5:17:35.

(7) 표 3 Analysis of Variance (ANOVA) for fitted second-order polynomial model and lack of fit for Oligodextran production Source. DF. Model Residual. Sum of squares Oligodextrana. Cell massb. Yieldc. Specific yieldd. 9. 774.08e. 12.30e. 8615.35e. 1.34e. 7. 15.53. 0.61. 93.32. 0.027. f. f. f. Lack of Fit. 3. 13.00. 0.45. 28.75. 0.023f. Pure Error. 4. 2.53. 0.16. 64.57. 0.004. Cor Total. 16. 789.62. 12.91. 8708.67. 1.37. 2. a. Coefficient of correlation (R ) for Oligodextran production was. b. Coefficient of correlation (R2) for cell mass was. c. Coefficient of correlation (R2) for Oligodextran yield was. d. Coefficient of correlation (R2) for Specific yield was. e. Significant at 5% level. f. All the lack of fits were not significant.. 표 4 Estimated coefficient for the filled second oder polynomial representing the relationship between the response and process variables Factor. Coefficient Oligodextran. Cell mass. Yield. Specific yield. 20.44. 2.92. 90.55. 0.85. Temperature. -3.25. -0.31. -12.35. -0.14. pH. 6.75. 0.80. 21.65. 0.28. Yeast extract. 2.00. 0.50. 4.91. 0.083. Temperature. -3.97. -0.51. -6.63. -0.17. pH. -4.97. -0.56. -19.39. -0.21. Yeast extract. -4.47. -0.57. -15.12. -0.19. pH×Temperature. 0.50. 0.16. 7.80. 0.021. pH×Yeast extract. -1.00. -0.10. -7.35. -0.042. Yeast extract×Temperature. -1.00. 0.014. -0.54. -0.042. Intercept Linear. Quadratic. Interactions. 본 실험결과 배양온도, pH, 효모 추출물에 대한 영향은 1차, 2차, 교호항(cross product term)에 서 모두 유의성이 나타나 요인들의 단독 또는 교호적으로 영향을 미침을 알 수 있다. 이들에 대 한 회귀식은 표 5에 있다.. Prototype 생물 반응기를 이용한 고분지 나노 올리고 덱스트란 합성과 프로바이오틱으로서의 기능성 연구. 유선균.indd 277. 277. 2010-04-16 오후 5:17:36.

(8) 표 5 Polynomial equations calculated by response surface program. X1: Temperature(℃), X2: pH, X3: Yeast extract (g/l) R2. Response. Second oder polynomial equation. Oligodextran. Y=20.44-3.25X1+6.75X 2+2.00X 3-3.97X12-4.97X 22-4.47X 32+0.50X1X 2-. production. 1.00X1X3-1.00X2X3. 0.98. Y = 2 . 9 2 - 0 . 31 X 1 + 0 .8 0 X 2 + 0 .5 0 X 3 - 0 .51 X 1 2 - 0 .5 6 X 2 2 - 0 .5 7 X 3 2. Biomass. 0.95. +0.16X1X2+0.014X1X3-0.10X2X3. Oligodextran yield. Y=90.55-12.35X1+21.65X 2+4.91X 3-6.63X12-19.39X 22-15.12X 32+7.80X1X 2-. 0.98. 0.54X1X3-7.35X2X3 Y=0.85-0.14X1+0.28X 2+0.083X 3-0.17X12-0.21X 22-0.19X 32+0.021X1X 2-. Specific yield. 0.98. 0.042X1X3-0.042X2X3. 3.2 L. mesenteroides ATCC 12291의 균체량 L. mesenteroides ATCC 12291의 균체량 표면 반응의 분석결과 정상점(stationary point)이 최대점으 로 판명되어 예측 최대 균체량 생산은 pH가 7.1부터 pH 7.3 근처까지 균체량 생산이 23.22g/l 까지 증가하다가 이후에는 감소하기 시작하였다(그림 2). 온도에 의한 영향을 보면 25℃부터 서서히. 1.0 0.5. 1.0. 0.5. 0.0 0.0 -0.5 -0.5 A: Temp -1.0 -1.0. 1.0. 1.0. 1.0. 1.0. C: YE. 0.0 0.0 -0.5 A: Temp -0.5 -1.0 -1.0. 1.0 3.22. 0.5. 0.5. -1.0 -1.0. C: YE. B: pH. 2.34. -0.5. -0.5. 0.0. A: Temp. 0.5. 2.98. -1.0 -1.0. 3.03. 0.0. 2.83 2.63. -0.5. 0.0. B: pH. 3.28 3.20. 2.67. -0.5. -0.5. 1.0. -1.0 -1.0. 0.5. 3.06. 0.0. 2.78. C: YE -0.5. 0.5. 1.0. 3.04 0.0. 1.0. 0.5 0.0. 0.5. C: YE. B: pH. 0.5. Cell mass. C. Cell mass. B. Cell mass. A. -0.5. 0.0. A: Temp. 0.5. 1.0. -1.0 -1.0. -0.5. 0.0. 0.5. 1.0. B: pH. 그림 2 Contour and 3D plots of response surface. Effect of temperature and pH (A), temperature and yeast extract (B), and effect of yeast extract and pH (C) on the production of biomass by ATCC 12291.. 278. 유선균.indd 278. 2010-04-16 오후 5:17:36.

(9) 생산량이 증가하다가 28℃에서 최고점을 보이고 이후 감소하기 시작하고 35℃ 근처에서는 1g/l 이하로 떨어졌다. 효모추출물에 의한 균체량 생산을 보면 균체량 생산은 효모추출물의 농도가 낮을 때에는 농도변화에 대하여 균체량의 변화가 큰 반면에 농도가 약 0.5% 이상에서는 생산량 의 변화가 크지 않았다. 균체 생산량은 약 3.28g/l이었다. 종합적으로 보면 균체량 생산에 가장 영 향을 미치는 것은 배양 pH이고 다음에 효모추출물의 농도 그리고 온도의 순으로 나타났다.. 3.3 L. mesenteroides ATCC 12291의 올리고덱스트란 생산 표면 반응의 분석결과 정상점(stationary point)이 최대점으로 판명되어 예측 최대 올리고덱스트란 생산은 pH 5.5 부근에서 서서히 증가하다가 7~7.3 근처에서 최고 생산량을 보여주다가 더 이상의 pH에서는 생산량이 감소하는 결과를 보여주었다. 온도 또한 25℃에서 서서히 생산량이 증가하 다가 27.5~29℃에서 최고 많이 생산되었으며 이후로는 감소하였다. 효모추출물의 농도가 낮을 때에는 농도변화에 대하여 올리고덱스트란 생산량의 변화가 큰 반면에 농도가 약 0.5% 이상에 서는 생산량의 변화가 크지 않았다. 올리고덱스트란 생산량은 약 22.3g/l이었다. 종합적으로 보 면 올리고덱스트란 생산에 가장 영향을 미치는 것은 배양 pH이고 다음에 효모추출물의 농도 그. 0.5 0.0. B: pH. 0.5 0.0. -0.5. -1.0 -1.0. 1.0. 0.5. A: Temp. 0.5. -1.0 -1.0. -0.5. 20.16. 1.0. 0.5. 0.5. 0.0 -0.5. 0.5. 0.0. -0.5. 0.0. -1.0 -1.0. 1.0. 21.21. 16.50 19.86 21.64. B: pH. 22.73. 0.0. 18.55. 20.46. 16.99. 1.0. A: Temp. 0.5. 22.01. C. C: YE. 0.0. -0.5. 1.0. 23.16. -0.5. 1.0. C: YE 0.0. 0.0. -0.5. 1.0. 1.0. C: YE. B: pH. 0.5. B. Oligodextran production. 1.0. Oligodextran production. A. C: YE. Oligodextran production. 리고 온도의 순으로 나타났다.. -0.5. -0.5 15.87. -1.0 -1.0. -0.5. 0.0. 0.5. A: Temp. 1.0. -1.0 -1.0. -0.5. 0.0. A: Temp. 0.5. 1.0. -1.0 -1.0. -0.5. 0.0. 0.5. 1.0. B: pH. 그림 3 Contour and 3D plots of response surface. Effect of temperature and pH (A), temperature and yeast extract (B), and effect of yeast extract and pH (C) on the production of oligodextran by ATCC 12291.. Prototype 생물 반응기를 이용한 고분지 나노 올리고 덱스트란 합성과 프로바이오틱으로서의 기능성 연구. 유선균.indd 279. 279. 2010-04-16 오후 5:17:37.

(10) 3.4 L. mesenteroides ATCC 12291의 올리고덱스트란 생산 수율 L. mesenteroides ATCC 12291의 생산 수율에 대한 표면 반응의 분석결과 정상점(stationary point)이 최대점으로 판명되고 예측 최대 올리고덱스트란 생산 수율은 효모추출물의 농도 0.1%에서부터 증가하다가 0.58% 근처에서 최대값을 보이고 다음부터는 감소하기 시작하였다. pH의 영향을 보 면 최고 생산 수율은 pH 7.0 근처에서 확정되었다. 온도의 영향을 보면 27℃에서 최고의 생산 수 율이 나타났다. 올리고덱스트란 생산 수율에 가장 영향을 미치는 것은 pH이고 다음에 효모추출 물의 농도 그리고 온도의 순으로 나타났다.. 1.0. 1.0. 0.5 0.0 -0.5 -0.5 -1.0-1.0. 0.0. C: YE 0.0. A: Temp. 0.0. 96.57. 0.0 82.63. 0.0. A: Temp. 0.5. 1.0. -1.0 -1.0. B: pH. 91.72 96.31. -0.5. -0.5. -0.5. 0.0. -0.5 -0.5 -1.0 -1.0. 0.5 93.67 88.80. 81.03. -0.5. 0.5. 0.0. 1.0. 79.36. -1.0 -1.0. A: Temp. 0.0. 88.72. C: YE. 0.0. 0.5. 95.95. C: YE. B: pH. -0.5 -0.5 -1.0 -1.0. 1.0. 0.5. 0.5. 1.0. 99.12. 1.0. 1.0. 0.5. 1.0. 0.5. 1.0. 0.5. C: YE. B: pH. Oligodextran yield. C. Oligodextran yield. B. Oligodextran yield. A. -0.5. 0.0. A: Temp. 0.5. 1.0. -1.0 -1.0. -0.5. 0.0. 0.5. 1.0. B: pH. 그림 4 Contour and 3D plots of response surface. Effect of temperature and pH (A), temperature and yeast extract (B), and effect of yeast extract and pH (C) on the yield of oligodextran by ATCC 12291.. 3.5 L. mesenteroides ATCC 12291의 단위 균체량에 의한 올리고덱스트란의 생산 수율 L. mesenteroides ATCC 12291의 단위 균체량에 의한 올리고덱스트란의 생산수율에 대한 표면 반 응의 분석결과 정상점(stationary point)이 최대점으로 판명되고 예측 최대 수율은 효모추출물의 농도 0.1%에서부터 증가하다가 0.58% 근처에서 최대값을 보이고 이후 감소하기 시작하였다. pH 5.5부터 pH 7.2 근처까지 균체량의 생산이 3.22g/l까지 증가하다가 이후에는 감소하기 시작하였다.. 280. 유선균.indd 280. 2010-04-16 오후 5:17:38.

(11) 1.0 0.5 0.0 0.0 B: pH -0.5 -0.5 -1.0 -1.0 1.0. 0.5. 1.0. 1.0. 0.5. 1.0. 0.89. 0.0. 0.0. 0.84. 0.67. -0.5 -0.5 -1.0 -1.0. 0.0. B: pH. 0.5. C: YE. 0.83 -0.5. 0.5. C: YE 0.0. 0.5. 0.91. 1.0. 0.5. 0.5. 0.0 0.0 A: Temp C: YE -0.5 A: Temp -0.5 -1.0 -1.0 1.0. 0.96. 0.0. Specific yield. 1.0. 1.0. C: YE. 0.5. B: pH. C. Specific yield. B. Specific yield. A. -0.5. 0.89 0.63. 0.94. 0.79. -0.5. 0.75 0.62. -1.0 -1.0. -0.5. 0.0. A: Temp. 0.5. 1.0. -1.0 -1.0. -0.5. 0.0. 0.5. 1.0. -1.0 -1.0. A: Temp. -0.5. 0.0. 0.5. 1.0. B: pH. 그림 5 Contour and 3D plots of response surface. Eff ect of temperature and pH (A), temperature and yeast extract (B), and eff ect of yeast extract and pH (C) on the Specific yield by ATCC 12291.. 온도에 의한 영향을 보면 25℃부터 서서히 수율이 증가하다가 28℃ 근처에서 최고점 0.96을 고비 로 감소하기 시작하고 35℃ 근처에서는 0.29 이하로 떨어졌다. 종합적으로 보면 균체량 생산에 가장 영향을 미치는 것은 pH이고 다음에 효모추출물의 농도 그리고 온도의 순으로 나타났다.. 3.6 고정화 반응기에서의 올리고덱스트란의 생산 균체 고정화효소 반응에서 시간별로 샘플링한 시료에서 당을 분석한 결과는 아래 그림 6에 나타 나듯이 시간이 경과할수록 설탕과 말토오스의 스팟이 옅어져서 양이 줄어드는 것을 확인할 수 있었다. 설탕은 4시간이 경과할 때부터 완전히 소모되었고 말토오스는 시간이 경과할수록 스팟 이 옅어지다가 4시간 경과 이후부터 일정하게 유지되었다. 올리고덱스트란의 생산은 그림에 나왔 듯이 시간이 경과할수록 스팟이 진해졌는데 1시간에서 2시간 사이에서 상승폭이 가장 컸으며 3 시간 이후부터 스팟의 차이가 거의 없었다. 그림 6과 그림 7은 Scion image 프로그램으로 분석한 결과이다. 올리고덱스트란의 생산은 계속 증가하여 3시간 경과 후에 27.52g/l를 나타내었고 덱스 트란은 서서히 증가하여 3시간 경과 후 28.36g/l로 별 차이가 없었다.. Prototype 생물 반응기를 이용한 고분지 나노 올리고 덱스트란 합성과 프로바이오틱으로서의 기능성 연구. 유선균.indd 281. 281. 2010-04-16 오후 5:17:38.

(12) fructose. sucrose maltose. s1. s2 s3 h0. h1 h2. h3 h4. h5 h6. h7 h8. h24. fructose. sucrose. maltose. s1 s2 s3 h0 h1 h2 h3 h4 h5 h6 h7 h8 h24. 그림 6 Change of substrates fermentation by the acceptor reaction of Leuconostoc mesenteroides ATCC 12291 on immobilized cell bioreactor at optimum conditions. DP 1 DP 2 DP 3 DP 4 DP 5. h0. h1. h2. h3. h4. h5. h6. h7. h8 h24. DP 1 DP 2 DP 3 DP 4. DP 5 h1 h2 h3 h4 h5 h6 h7 h8 h24. 그림 7 Change of oligodextrans by the acceptor reaction of Leuconostoc mesenteroides ATCC 12291 on immobilized cell bioreactor at optimum conditions.. 282. 유선균.indd 282. 2010-04-16 오후 5:17:39.

(13) 3.7 선택균주들의 증식에 대한 올리고덱스트란의 영향 생산된 올리고덱스트란은 선택된 병원성 균들에 대하여 가장 이용하기 쉬운 탄소원인 포도당 에 대한 증식영향을 비교한 결과 올리고덱스트란을 기질로 사용 시 증식억제를 보여주었다. 가장 높은 증식억제를 보여주는 것은 S. aureus이었고 Salmonella 계통 중에서는 S. enteritidis 의 증식억제가 가장 높았다. 그리고 올리고덱스트란은 탄소원을 포도당을 사용하였을 때와 비교하면 Bifidobacterium pullorum, bifidum의 증식효과는 낮았지만 약 70% 정도를 보여주었다.. S. aureus. S. epidermidis. S. enteritidis. S. typhimurium. 0. 10. 20. 30. 40. 50. 60. 70. Relative growth (%). 그림 8 Growth of bacteria on oligodextran as carbon sources. Growth was based on assayed as absorbance at 660 nm. The growth of S. t yphimurium on glucose was designated as 100%.. Dextran. LGOS. CGOS. Mannitol. Glucose 0. 0.5. 1 1.5 Abs at 660 nm. 2. 2.5. 그림 9 Growth of Bifidobacterium pullorum on oligodextran as carbon sources. Bacteria were anaerobically cultured in media containing 0.5% (w/v) oligodextran (GOS) at 37℃ for 48 h.. Prototype 생물 반응기를 이용한 고분지 나노 올리고 덱스트란 합성과 프로바이오틱으로서의 기능성 연구. 유선균.indd 283. 283. 2010-04-16 오후 5:17:39.

(14) Dextran. LGOS. CGOS. Mannitol. Glucose 0. 0.2. 0.4. 0.6. 0.8 1 Abs at 660 nm. 1.2. 1.4. 1.6. 1.8. 그림 10 Growth of Bi fidobacterium bi fidum on oligodextran as carbon sources. Bacteria were anaerobically cultured in media containing 0.5% (w/v) oligodextran (GOS) at 37℃ for 48 h.. 4. 요 약 본 연구는 L. mesenteroides ATCC 19255의 올리고덱스트란 최적 생산조건을 설정하기 위하여 반 응표면분석법을 이용하였다. 발효 조건의 독립변수들은 배양온도, 초기 pH, 효모추출물의 농도 로 정하고 Box-Benken 디자인을 이용하여 실험을 설계하였다. 연구결과 올리고덱스트란 생산은 4.70~23.16g/l이고, 균체량 생산은 1.01~3.22g/l, 수율은 35.49~99.12%, 단위 균체량에 의한 올리고덱 스트란의 생산 수율은 0.29~0.96의 범위에서 분석되었다. 표면반응분석 결과 균체의 성장, 올리고 덱스트란 생산, 올리고덱스트란의 생산 수율, 단위 균체량에 의한 올리고덱스트란의 생산 수율 에 가장 영향을 미치는 것은 배양 pH이고 다음에 효모추출물의 농도 그리고 온도의 순으로 나 타났다. 결론적으로 최적 조건은 온도는 27~28℃이고, pH는 7.1이며, 효모추출물은 6~7%의 범 위에서 결정되었다. 이러한 조건에서 생산된 올리고덱스트란 양은 23.16g/l이고, 생산 수율은 약 95.95% 정도이며, 단위 균체량에 의한 생산 수율은 0.96이었다. 균체고정화 반응기에서 올리고덱 스트란의 생산은 계속 증가하여 3시간 경과 후에 27.52g/l를 나타내었고 덱스트란은 서서히 증가 하여 3시간 경과 후 28.36g/l로 별 차이가 없었다. 생산된 올리고덱스트란은 선택된 병원성 균들 에 대하여 가장 이용하기 쉬운 탄소원인 포도당에 대한 증식영향을 비교한 결과 올리고덱스 트란을 기질로 사용 시 증식억제를 보여주었다. 가장 높은 증식억제를 보여주는 것은 S. aureus 이었고 Salmonella 계통 중에서는 S. enteritidis의 증식억제가 가장 높았다. 그리고 올리고덱스. 284. 유선균.indd 284. 2010-04-16 오후 5:17:39.

(15) 트란은 탄소원을 포도당을 사용하였을 때와 비교하면 Bifidobacterium pullorum, bifidum의 증 식효과는 낮았지만 약 70% 정도를 보여주었다.. 참고문헌 김문수. L. mesenteroides B-742CB Dextransucrase를 이용한 제한된 크기의 고분지 Dextran 생산 및 특성연구. 전남대학교 대학원, 2001. 김영환, 김희중, 김지영, 최태부, 강상모. Leuconostoc mesenteroides의 내산성변이주의 김치발효에 미치는 효과. 한국미생물·생명공학회지 33(1), 2005. 엄현주, 서동미, 윤향식, 이희봉, 한남수. 김치로부터 고활성 dextransucrase를 생성하는 저온성 Leuconostoc mesenteroides 균주선발. 한국식품학회지 34(6), 2002. 윤명희, 구윤모. Dextransucrase에 의한 Dextran생성기작에 관한 연구. 한국생물공학회지 9(1), 1994. 이인수, 김도만, 허수진, 김문수, 이기영, Seiya Chiba, Atsuo Kimura. 고정화 혼합효소를 이용한 새로운 구조 의 올리고당 생산 및 특성연구. 한국생물공학회지 15(1), 2000. 임원준. 식이섬유 생산 유산균을 이용한 기능성 두유 요구르트 제조. 중부대학교 대학원, 2007. 황승균. 발효 김치로부터 Dextran 생산균주분리 및 Dextran 최적생산 조건 연구. 중부대학교 대학원, 2006. 황승균, 홍준택, 정경환, 장병철, 황경숙, 신정희, 임성팔, 유선균. 김치로부터 분리된 Leuconostoc sp. strain YSK 균주에 의한 덱스트란 생산 조건의 최적화. 생명과학회지 18(10), 2008. Alsop RM. Industrial production of dextrans. pp. 1-44. In M.E. Bushell, (ed.). Progress in industrial Microbiology, vol. 1. Elsevier, Amsterdam. 1983. Behrens U. Wuensche L., Sobre Deriv. Cana Azucar (1965). Utilization of final molasses in dextran production. 3, 39, Chem Abstract. 73, 57413y. 1970. Cibik R, Lepage E, Talliez P. Molecular diversity of Leuconostoc mesenteroides and leuconostoc citreum isolated from traditional french cheeses as revealed by RAPD fingerprinting, 16S rDNA sequencing and 16S rDNA ragment amplification. Syst Appl Microbiol. 23:267-78, 2000. Dicks LM, Dellaglio F, Collins MD. Proposal to reclassify Leuconostoc oenos as Oenococcus oeni [corrig.] gen. nov. comb. nov. Int J Syst Bacteriol. 45:395-7, 1995. Facklam R and Elliott JA. Identification, classification, and clinical relevance of catalase-negative gram-positive cocci, excluding the streptococci and enterococci. Clin Microbiol Rev. 8:479-95, 1995. Jeanes A . Preparation of a water soluble dextran by enzymatic synthesis. Methods Carbohydrate Chem. 5: 127-132, 1965. Jiricek V. (1967). Dextran production by Leuconostoc fermentation. Czech. Patent 124, 853: Chem. Abstract. 69, 34684r. 1968. Kobs SF. Acceptor activity of affinity-immobilized dextransucrase from Stre ptococcus sanusi ATCC 10558. Carbohydrate Research 211: 337-342, 1991. Lacko L, Malek J and Dvorakova J. Dextran Ⅲ. Collection Czechoslov. Chem. Commum. 24: 2954-2958, 1959. Monsan P and Lopez A. On the production of dextran by free and immobilized dextransucrase. Biotechnol. Bioengineering 23: 2027-2037, 1981. Otts DR and DAY DF. The effect of ionophores in the production of exocellular dextransucrase by L. mesentroides.. Prototype 생물 반응기를 이용한 고분지 나노 올리고 덱스트란 합성과 프로바이오틱으로서의 기능성 연구. 유선균.indd 285. 285. 2010-04-16 오후 5:17:40.

(16) FEMS Microbiology Letters 42:179-183, 1987. Paul FD, Auriol E , Oriol D and Monsan P. Production and purification of dextransucrase, NRRLB512(F). NewYork Academy of Sciences 434: 267-270, 1984.. 286. 유선균.indd 286. 2010-04-16 오후 5:17:40.

(17)