Journal of Sasang Constitutional Medicine

뺑씨

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학짜

1 ι

의

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칠맹

N

체

&

”샘많

t삐

少陰

A

升

^R

훌훌혔漫의 免훌調節作用

유창휠*

.

_송정모

_*

I Abstract I

Immunoregulatory Action of Soeumin Seungyangikkitang

Ryu Chang-ryeol . _{Song Jeong-mo}

Dept

이

Sasang Constitutional Medicine, College

이

Orie

미

al M

염iane,

W

∞suk

Univ.

The purpose of this r

않arch

was co investigate the effeas of Seungyangikkitang (SI 끼 on the immune cells in BALB/c

mice. SIT (50

αng/kg)

was administerd p.o. once a day for 7 days. SIT enhanced the proliferation of thymocytes, but

decreased the proliferation of splenocyres. SIT enhanced the subpopulation of cytotoxic T cells in thymocyres and helper T

cells in splenocyres, but did not affea the subpopulation of B220/Thy I cells. SIT enhanced the pr

여uaion

of )( -interferon

and interleukin-2 in thymocyres, splenocytes and serum, but did not affect the produaion of interleukin-4. SIT suppressed

the produaion of nitric oxide, but enhanced the lucigenin chemiluminescence and the engulfment of FITC-conjugated E

coli particles in

야rironeal

macrophages

These results suggest that SIT has a potent aaiviry on the s 야cific immunity via the cytokine secretion of

π11

cells

and the non-specific immunity via the phagocytic aaiviry of macrophages in vivo.

Key words: Seungyangikkitang, cytokine, phag

κytIC, 띠1muniry

L

績 틀융

升陽益氣淑은

r

東隔꿇世保元」 에 처음으로 수록 되었으며 少陰

A

亡陽證에 升陽益氣의 방법에 의하 여 치료하는 처방으로 제시되었다

I)

기존 웰짧學에 서는

t

陽올 陽氣가 虛脫하여 나타나는 病쩔的 徵 候로 본 것을 李濟띤는 陰陽升降의 失調로 인해 陽 이 上升하지 못하고 도리어 下降함으로써 나타난다 고 인식하여 升陽益氣의 방법올 提示한 것이다

²⁾

升陽益氣앓은 少陰

A

탬受熱表熱病의 亡陽初 中 證의 適用方이며 , 桂技揚과 補中益氣陽의 )j 意가 복

합된 處方으로서ι

4)

’

5)

은 陽

l

옮證에 대한 회복효과 가 있다고 보고한 바 있다

.

이러한 陽虛는 소음인의 체질적 특정으로 , 이의 해결을 위해 ‘陽魔之氣가 保 命之 1: ’라는 것올 전제로 하여 少陰

A

表

1

피짧에

i

밟 補升陽함으로써 陰陽升降의 불균형상태를 조절하여 회복시킨다고 하였다찌.

陽虛는 面色蒼터

,

身據

z

^力

,

냄

if,

^{懶言 ,}

⁰

따, 納 食不化 , 없떻 18 冷, 四JJU 찢冷

,

小便淸長, 大{ 핏演행,

-f"

利1 펴앓, 좀質淡 fl, 빠虛

i

않 或 ?X 둥의 중상을 나타 내는 증후군으로서 , 이로 인해 同化

ft'

^{用의 감약 , 腦}

의 興팎性 저하

,

에너지대사의 저하

,

짧環不良

,

免훌

우석대학교 한의과대학 사상채질과

교신저자 송정모 주소) 전주시 완산구 중화산동 2-5 우석대학교 부속한방병원 전화)063-220-8600

E-Mail)soo-<Iang@

뼈nmaiI.nCt

- 102 -

-

유창열 외 1

’

少톰

,utili

훌훌;R 의 S/t 흩빼

11

作

II! -

실험에 사용한 시약은 Dulbecco ^’

s m

여ified

Eagle's

m

어뻐n

(DME), penic

피in-

streptomycin, D

띠becco ^’

s

ph

∞phate

buffered s

에

ine (DPBS-

λ

), lipopolysaccharide

αPS),

¥ - interferon (¥ - IFN), lucige

띠

n, MTf, zymosan, s

띠fa! 피 aJDide,

N-naphthylethylenediamine . 2Hd

은 Sigma

Co., RP

뻐

1640, fetal bovine serum (FBS), trypsin

은

Gibeo Co., mouse ¥-IFN

띠ununoassay

kit,

interferon-2 (11-2) inununoassay kit, mouse

inununoassay kit

는 R&D

Co., PE-conjugated anti-CD4,

FITC-conjugated anti-CDB antilx

녕y,

PE- conjugated

anti-B220, FITC-conjugated anti-

까lY 1

mAbs

는

Dainippon

앞IY 짜u

Co., FITC-conjugated E. coli K-12

bio-particles

는 Molecular

probes Co.

제품 퉁올 사용하

였으며, 기타 시약은 cell

culture

용 및 l 급 시약올 사 용하였다

.

사용기구는 culture

flask (Nunc), multi-well

plate (96-well, 24-well, Costar), Microplace-Reader

(Dynacech MR5000), C02 incubator (V 양 ion scientific

Co.), inverted microscope (Nikon Co.), freeze dry

apparatus (Ilsin Co.), flow cytometer (Coulter EPICS-XL),

luminometer (Be

버1 이d 96LP) 둥올 사용하였다

.

mouse 11-4

2.

方法

1)

홉홉의 빼빼

本 실험에 사용한 處方은

r.

東醫혈世保元

^26)J

에 收載된 少陰

A

升陽益혔꿇으로

,

사용한 藥材들은

X

쉰大學校 附屬 韓方病院에서 구입, 精-選하여사용하 였고 그 內容과 分量은 다음과 같다

.

能力의 저하가 나타나게 된다

^7,8)

최근 陽虛에 대한 없究로는 升陽益氣揚과 A 物君 子陽’

⁾

’ 十全大補揚

^6),

升陽益氣附子揚과 官桂附子理 中앓

^9),

補中益氣楊

^10,11)

^’ 香

iy

養몹現

¹²⁾

동의 方햄

j

에 대한 보고가 , 免훌反應에 대한 없究로는 補中益氣陽

I}-\

끼

, 四君子揚과 四物滾 ^18,

꺼

n.21,2 낀

퉁의 方뼈에 대한 보고가 있는 바

,

이를 통해 補氣 또는 補血하는 補益方들이 陽虛를 먼復시키고 免훨機能의 效果를 增뭘시킨다는 것올 알 수 있다

.

升陽益氣揚의 처방 구성에 참고된 것으로 보이는

桂技楊은

rWj 寒論 ^23)J

에서 太陽傷凰表虛證에 웅용

되며 , 후세방 補中益氣꿇은 氣虛로 인한 中氣下업과 牌不統血 둥에 웅용되는 처방이다

⁸⁾

이는 升陽益氣 없이 소음인 表病證의 正氣와 $ 氣가 싸우는 상태 에서 나타나는 免훌反應에 일정한 영향올 줄 수 있 음을 시사해준다

.

또한 元

²⁴⁾

과 朴

2)

에 의하면 少陰

/ ^＼

補中益氣陽은 短氣

,

失血 꿇, 텀퓨 ,

ff

둥의 氣血虛로 인한 병 증 뿐만 아니라 題痛 , 班珍

,

짧

l

館

,

夢遺

,

上消, 五빼, 體痛 둥에도 웅용되어지고 있는바, 이와 유사한 方 意를 갖는 升陽益氣꿇은

t

陽證 뿐 아니라 일반 雜 病에도 널리 웅용할 수 있어서 일정한 免훌調節作 用이 있올 것으로 사료된다

.

이에 평者는 少陰

A

升陽益氣楊의 免훨調節作用 올 관찰하기 위해

,

또體에서 免훌系를 조절하는 중 요한 細뼈인 흉선세포 , 비장세포 및 대식세포에 대 한 작용을 관찰하여 유의성 있는 결과를 얻었기에 보고하는 바이다

.

重뾰g)

8

8 8

。。‘

9

‘

q

‘에‘에

Prescription of Soeumin Seungyangikkita

때(SI 끼

*

훌햇名 生쫓名

A

훌

Ginseng Radix Alba

桂 技

Cin

때nomi

Ram

마

JS

白정햇

Paeoniae Ra.d

α

짧 홉

Astragali Ra

φx

l츠 If

可首烏

Cynanchi Wolf

이di

Radix

肉 양

Cinnamomi Cortex Spissus

쏠 짧

Angeli

ιae

G

멍antis

Ra

φx

it

草

Gly

α벼따ae

Radix

生 훌

Zingiberis Rhizoma

II.

를뚫 材혐 및 方法

1.

材料

1 )

빠物

본 실험에 사용한 생쥐는 생후 8 주 된 BALBlc 계 수컷을 대한실험동물

t

주) 에서 구입하여 , 온도 20

^土 2 'C,

습도 50:t5%,

dark!1ight 12

시간의 조건 하에서 l 주일 이상 실험실에 적웅시킨 후 사용하였으며 , 고

형사료와 물올 자유로이 섭취하도록 하였다 .

4

4 56

z ^{α yphi Fru}

αus

大짧

2)

試쫓 및 짧훌 合計

- 사상혜짙의학회지 제 13

권 제3 효때1 -

상기 처방 2 첩 분량올 중류수

2,

α)Om! 로

2

회 가열 추출한 후

,

여과하여 여액올 rotary

evaporator

로 농축 한 다음, freeze

dryer

로 동결건조하여 분말 22.5

g ( 수

득율 20.8%) 을 얻어

(

이하 SIT i!} 칭합), 동물실험 시 에는 생리식염수에 용해시켜 사용하였다

2)

뼈훌細뼈, 홈훌細

R

힌 및 大

1

훌뼈

R

먼 톨리

생쥐의 흉선세포 및 비장세포 분리는

Wysocki27)

및

Mizel28)

둥의 방법을 이용하였다

.

생쥐 5 마리를 1

군으로 하여 SIT

50

α

ng/kg

올 l 일 l 회씩 7 일간 경구 투여한 다음 8 일째 생쥐를 경추탈골하여 도살하였 다. 적출한 흉선 및 비장올 DPBS-A 롤 넣은 petri

dish

에서 잘게 분쇄하고 멸균된 stainless

mesh

로 여과하 여 세포부유액올 얻은 후 , DPBS-A 로 2 댄 세척한 다 음0,500

rpm

에서 10 분간 원심분리}, 흉선세포 및 비 장세포 부유액으로 하였다

.

대식세포의 분리는 SIT

500 m 아<g 올 1 일 l 회씩 7

일간 경구투여 하였다

.

약물 투여 4 일째 mouse 복강

에 3%

thioglycollate 2m1

를 注入하고 ,8 일째 경추탈골

하여 도살시킨 다음 , 복강에 cold

PBS lOmI

를 넣어 복강세포를 수집하였다

.

수집한 세포를 4

'C

^에서

1,300

φm 으로 10 분간 원심분리하고 RPMI 배지로 2

회 세척 후 , 직경 120mm

petri

이

sh

에 분주하여

C02

incubator

에서 배양시키고

2

시간 후에 부착되지 않은

세포를 제거한 다음, 부착한 대식세포를 cell

scraper

로 분리하여 사용하였다

.

생쥐 흉선세포

,

비장세포 및 대식세포는 RPMI

1640

협地를 사용하였으며, 배 지에는

10% FBS

와 penicillin-streptomycin

(100 units/mI,

lOOl1g/mI)

올 첨가하여 사용하였다

3)

뼈짧빼빼 및 홉톨細뼈의 예

i

뭘能 멍

9

솔

분리한 흉선세포 및 비장세포의 중식에 미치는

SIT

의 영향은

M

π법으로 측정하였다. 본 실험에 사 용한 M π법은 Mosmann

^영

)

이 개발하여

Kotnik

둥

30)

°

1

변형시킨 방법으로 , 96-well

plate

의 각 well 에 분리한 흉선세포 및 비장세포를 각각 RPMI

1640

배지로 희 석하고 96-well

pi ^따 e

에 1.2xl06

ceUs/mI

농도로 분주하 여 흉선세포는 concanavalin

A(Con A} 511g/mI

를

,

비장 세포는 lipopolysacch-aride(LPS}

1011g/

찌를 첨가한 후,

37'C

의 C

inCl뼈tor 에서 48 시간 배양한 다음 배양

종료 4 시간 전에 M π 시약을

bn

하였다

.

배양 종료

시 O.IN

Hd

에 용해시 킨 10%

SDS 100111

를 각 well 에 첨가하고 차광상태에서

18

시간 더 배양한 후 발색 된 各 well 의 홉광도를

microplate-reader

로 570nm 에서 측정하여 대조군의 홉광도에 대한 실험군의 홉광도 를 백분율로 환산하여 계산하였다 .

4)

뼈훌빼뼈, 빠훌빼뼈의 subpopulation 혹정 분리한 흉선세포 및 비장세포를 각각 RPMII640 배지로 3 회 세척하였다

.T

세포의 개체수는

PE- co

_띠

ugated anti-CD4

및

F

윈따

Iπ T

π

C

ι

-con

쩨

^on

^떼빼

^{jU,맹 19a}

뼈【때혀

^a

뻐

nt따 t monoc

때

'\OC

때

oc

떠

dona뼈 i때 a

에

I a

빼

nt

띠

1π띠 t디 ib<

뼈펴y팩로료’ T 및 B 세포의 sub φpuJation 은

PE-conjugated anti-B220

및 F타Iπ

TC

ι,-con떼

n

띠마빼

¹

니ψ

Jl

ψu맹

l핑 .ga

와te삐

d ac

때

nt따 t

mor

때빼

^{on n3.}

뼈

^13.

베

a

꾀lac뻐

^{nt! π m}

^【

tib<

뼈녕

^y

팩로 이중 염색하여 4

'C

^{에서 30 분}

간 반웅시 킨 후 flow

cyrometer (excitation; 488nm,

emission; 525nm(FITG, 575 nm(PE)]

로 subp 야ulation 올

측정하였다

³¹⁾

5) Cvtokines

빼좋

생쥐 5 마리를 l 군으로 하여 대조군에는 생리식 염수만올, 실험군에는 SIT

5OOmg/kg

올 l 일 l 회씩 7 일간 경구투여한 다음 8 일째 동일한 방법으로 흉선 세포 및 비장세포를 분리하여 2

X 107 cells/mI

로 조

제하여

96 well plate

에 200 μ

R

씩 분주한 후 ,72 시간

동안 C02

incubator

에서 배양하였다

.

배양액을 원심 분리 (2,5OOrpm,

2

분, 4

'C)

한 다음

,

_{상동액 50}

_μ e

를 취하여 mouse

immuno

잃say

kit

를 이용하여 cyrokines 를 측정하였다

.

혈청 중 cyrokines 를 측정할 때는 생쥐 5 마리를 l 군으로 하여 대조군에는 생리식염수만을 , 실험군에 는 SIT

500 m 빙<g 올 l 일 l 회씩 7 일간 경구투여한 다

음 8 일째 생쥐의 심장으로부터 혈액을 채취하여 원 심분리한 후 혈청올 분리하여 , 혈청 50 뼈를 취하여

mouse lffiffiunoassay

따를 이용하여 cyrokines 를 측정하

였다

.

즉 sample

50

때에 assay

diluent 5

μ

e

를 혼합하여 실온에서 2 시간 동안 incubation 한 후 4 회 세척하였 다

.

세척 후 anti-rrouse

cyrokines conjugar

벼 concentrare

100

띠를 가하여 실온에서 2 시간 incubation 한 후, 5 회 세 척하고 substrare

solution I

。이

d

를 혼합하여 30 분 동 안 실온에서 배양하였다 . Stop

solution 100

뼈를 가하 여 450nm 에서 띠c때

^{ate reader}

^{로 홉광도를 측정한}

후, 미리 작성한 검량선에 의해 cytokines 의 양을 환

104 -

Samples T reared of Non-trcared of

Concanavalin A Concanavalin A

Conrrol 100.Ot 1.2 68.2t 1.6

SIT 116.5t2.4* 85.1t2.8*

-

유장혈 외 1 : 少홉A 升빼

Aai

홉의

%

훌빼

g

_作用

-

산하였다.

6)

빠빼 빼뼈로 부터

nitric oxide

생성량 혹정 분리한 대식세포를 24

well plate

에 well 당 2

^X 106

cells

을 분주한 후 대식세포로 부터 생성되는 띠

tric

OJcide(NO)

의 양을 Griess 법

³²⁾

으로 측정하였다

.

각 well

에 LPS

111g!.

찌와 y-IFN

25 띠 lits/

찌를 첨가하여 24 시

간 배양한 후 , 배양액

100111

와 Griess 시약 (1%

s

띠뻐피없꾀de

+ 0.1 % N-naphthylenediamine 2Hd +

2.5% H3P04) 100111

를 혼합하여 96

well m

여ule 에 넣

고

, 37'C

에서

10

분간 방치한 후

570run

에서

n1icroplate-reader

로 홉광도를 측정하여 미리 작성 한

NaN

의 검량선에 의해 N' 의 농도를 환산하였다

7)

빠뾰

*

^{훌細뼈의 훌없}

^e

^혹정

분리한 대식세포를

2 X 106 cellsl

찌가 되도록

DME (without phenol red, 0.34

야 NaHC03,

2.6

빼

HEPES, pH 7.2) 에 부유시켜

실험에 사용하였다

.

Lucigenin

용액의 제조는 IOmI 의 DPBS-A 에 용해한

후 , 여과 멸균하여 -20'C 에서 보관하연서 사용하였 다-(stock

solution). Lucigenin stock solution

은 사용하기 직전에 DME 배지에

1/10

로 희석하여 사용하였다

.

다emilunlin 않ence 측정은 lunlinometer 를 이용하여 37

℃에서 측정하였다”’써

)

측정용 n1icroplate(white) 의 각

well

에 준비된 대식세포 부유액

50 μ e

와 lucigenin 용 액 50

μ e

및 zymosan 용액

30

뼈를 첨가하여 최종

volume

이 200

_μ M

가 되도록한 후 넣고 37'C 에서 15 분

간 전처리한 후 5 분 간격으로

30

분 동안 lucigenin

chemilunlinescence

양올 측정하였다

.

8)

빠團 大

:&

빼뼈의

.1

를作用에 의환 engulfment

혹정

FITC-conjugated E. coli particles

을 HBSS 에 현탁시 켜

sonification

환 후 사용하였으며 , trypan

blue

는 citrate

buffer(pH 4

씨에 250

_μ g

찌 농도로 용해하여 사용하였

다

.

분리한 대식세포를 RPMII μ

o

배지로 1

x 10

^’

cells/mI

되도록 조정한 후, 100 뼈를 96

well

에 분주한

다음 , E.

coli particles

올 뻐ss 용액으로 Img!mI 되게 조제한 현탁액

25 μ g

를 가하여

l

시간 동안

C02

incubator

에서 배양하였다 . 배양액을 제거하고

exrrarell

빼

fl uorescence

를 억제하기 위해 tcypan

blue

lOOjd

를 챔가하여 mve얀

eete

삐

d fluorom

따

l

였다

35)

9)

륭계처리

모든 실험 결과들은 mean

土 SE

로 나타내었고 통계 처리는 student

t-test

를 실시하여 P<0.05 를 기준으로 유의성 여부를 판정하였다

.

川

.

^{를훌훌 월果}

1.

升홉훌혔場 (SIT)

^°

1 뼈編細뼈 및 牌廳細뼈의 혜훌훌애미지는 했果

대조군의 흉선세포에

T

임파구

mItogen

인

concanavalin A (Con A) 를 처리하였을 때의 세포생존

율을 100% 로 하였을 때, Con

A

를 처리하지 않았을 때 세포생존율은 68.2

^{土 1.6%}

로 감소하였으며

, SIT

를 투여하고 분리한 흉선세포에 Con

A

를 처리하였을 때의 세포생존율은 1 16.5f2.4% 로,Con

A

를 처리하지 않았을 때 세포생존율은

85.1 土 2.8%

로 대조군에 비 해 중가하였다 -(Table

I).

Table I. Elf

없이 용

ungyar 빙

|

빼떠I 갱

(Sin on the proliferation

이

murine thyr

παtes

Cell Proliferation (%)

SIT (5OOmg/kg) was adminisrercd p.o. once a day for 7 days, and

the separared thymocytes (1.2x106 cells/mI) were cultured fOt 48

h in RPMII640 media mixed with an acrivating mirogen of

concanavalin A. The data

π

ptesents the mean :!:SE of 5 mice.

*; Sinificandy

이ffercnr

from conrrol roup (p<O.OI)

대조군의 비장세포에 B 임파구 n1itogen 인 LPS 를 처리하였올 때의 세포생존율을

100%

로 하였을 때, 대S 를 처리하지 않았을 때 세포생존율은

77.5:!:3.1%

로 감소하였으며 , SIT 를 투여하고 분리한 비장세포 에 LPS 를 처리하였을 때의 세포생존율은

88.6

土

2.1%

로

, LPS

를 처리하지 않았을 때 세포생존율은

66.7:t1.4%

로 대조군에 비해 감소하였다 Table

11).

- ^{사상채질의학회지 제} 13 권 채 3 호

때1 -

cade l |.

댄gj

d ST m te

α

difg

빼g1

d rTUrne 3jggNtES

Samples

Qll Proli&ration (%)

Treated of Non-treattd of

Lpowlysxchar

버e

ljpopoJysaki1aride

@ntrol l%.O

±

1.8 715

±

3.l

SIT 88 6

±

2 l* 667

±

1.4*

SlT (500mg

뺑

) was

썩mitiste 빼 p o once

a day &r 7 days, and

rhe separated spknocyttS (1.2xlO6 cells/Inl) were cultur-ed for 48

h 띠 RPMI1640 media mixed with an anivating IIlitogen of

lipopolysxrharide- The data represents the mean

土

SE of 5 Inke.

*; SiR

띠6caInly

diRbrent 6iom cmltrol group (p 〈 0.05).

2. S|T

가 뼈線細힌및 牌廳細뼈힌의

subp

。

puldior1

에 미지는 훨果

대조군의 흉선세포중

m4 single wsitivtjCD4+)

세 또는 l2.2

± 0.4%

이었으며

, m8 ^{single posit}

뼈CD8+) 네포는 3.1

^± 0.2%

이었다. SIT 를 투여하고 분리한 생 쥐 흉선세포의 CD4+ 세포는 l3.2

^土 I.l%

로 對照群과 결 차이가 없었으나

, m8+

세포는 43

^± 0.3%

로 對照 洋에 비해 증가하였다 {Table

III).

Tatje ^|

”

. Engj d ST m t

엄 StnnXJ 녕tlg1 여

rTUnre

trvrTgytes

Samples

Cell Subpopulation (%)

CD4+ CD8+

Control SlT

l2.2

±

0 4 l3.2

±

1.l

3 1

±

0 2

4.3

±

0.3*

SlT (500mgkg) was admirustered P O. once a day h 7 days, and

the separatal thymKytes were stamed with PE-con,LIgated

antl-CD4 and FITC

〈

Onjugated anti-CD8 monklonal annbody 6br

3O II1unites at 4

℃

. ^The subpopulation was determlIled wlth a

now cyrometer- The data represents the mean

±

SE of 5 mice.

*; Sign

^파caInly

^{diRKrent from control group (p}

^〈

0.05)

대조군의 비장세포중 B220

@skive

세포(B220+) 는

i8.4 ± 2796

이었으며 ,

111yl positive

세포(ThyI+) 는

1.3 ± 24%

이었다

. ^SIT

를 투여하고 분리한 생쥐 비 상세포중 B220+ 세포는 37.7

± 29%

로 Thy1+ 세포는

’

2.7 ^± l.5%

로 대조군에 비해 별 차이가 없었다

.

비장 겨 T 임파구중 대조군의 CD4+ 세포는 13 3

^土 l.2%,

] 〕8+ 세포는 3.4 ± 0.2%

이었으나

, SIT

를 투여하고 분

끽한 생쥐 비장의 T 엄파구 중

CD4+

세포는

l6.6 土 l.l%

로 대조군에 비해 증가하였으며

, m8+

세 포는

43 ± 0.3%

로 대조군과 별 차이가 없었다{Table

IV, Flg. l).

Ta

미

e |V. EHect of S|T on the submpu|at|0n of munne

sp|en

_α

Mes

Samples

Cell S

띠bpopulation

(%)

B220+ Thyl+ CD4+

38.4

土

2 7 2Y3

土

2.4 133

^土

1.2

CD8+

3.4

^±

0.2 Control

SIT 317

土

2.9 22.7:t1.5 I6.6

土

1.1* 4.3

±

0.3

SIT (5o α neke) was administemd p

_α

oncf a day t

야 7 days,

and

the separated spdtnKytes were stained with PE-cmillgared

anti-B220

및 FITQonluga1cd

arm-111yI monoclonal antl

뼈

y 아

PE-cmillgaIed anti-CD4 and FIT

℃-conlligated

anti-CD8

monklbnal antibody fbr 3O minutes at 4

℃ . The

subpoPulatlOn

was deRrmlncd Wlth a now qtOIIrter. The data

πpresents

the

mean

±

SE of 5 rruce.

*; SlRIliflcandy diHerent from control gmup (p

〈 0.05),

c

。

nlIul SlT

jj

세

t ^1l :.

”지

lt

」

l.

」」

--0

(A) Lymph

_”

cytt* (U) Thymocytes

:F 짧센

편픽했닮 ⁱ

(C) Splmocytes

Flg.1 Cytof|uorometic pattern of lymphoqtes submpu|ation

|n S|T-adm|n|Stered mlce.

3. SlTO|

뼈線細뼈 및

8

뿔鷹細

R

헌의

Cytokines

分泌에 미

I|

는 했果

대조군의 흉선세포 중 X-interferon 및 interleukin-2

- 106 -

Samples

PrÅìuction of Cytokine (P.ljm!)

'i-Inrerferon Inrerleukin-2 Inrerleukin-4

Conrrol 69.5t4. 313.4 t6.8 297.6:!:6.3

SIT 126.6t7.2** 346.0t5.9* 297.0t9.5

Samples

Production

이 Cyrokine

(pg/ml)

'i-Inrerferon Inrerleukin- 2 Inrerleukin-4

GÇturol 442.8t 12.2 354.3tJO.8 191.U8.7

SIT 511.8t9.7* 548.5tI2.5** 201.5:!:10.3

-

유&밸 외 1 : 少함 AJt 뼈훌월‘옳의 Ii 뼈 11

作用 -

의 양은 각각 69.5

^土 4.5

및 313.4

^土 6.8 P

밍mJ 이었으나,

SIT

를 투여한 군은 126.6:t7.2 및 346.0:t5.9

pg/mJ

로 대조군에 비해 증가하였다

Interleukin-4

의 양은 대조

군에서

297.6:t6.3 P

밍mJ 이었으며 , SIT 을 투여한 군

은 297.0

土 9.5 pg/mJ

로 대조군과 별 차이가 없었다

(Table

씨.

대조군의 비장세포 중 -inre

의 양은 각각 442.8

土 12.2, 354.3

土

10.8 pg/mJ

이었으나

SIT

를 투여한 군은 511.8

^土 9.7, 548.5 土 12.5 Pi

밍

mJ

로 대 조군에 비해 모두 증가하였다

. IncerIeukin-4

의 양은 대조군에서

191.1 土 8.7 pg/.

찌 이었으며

, SIT

올 투여한 군은 201.5

^土 IOJpg/mJ

로 대조군과 별 차이가 없었다

(Table VI).

T

빼e V. Effect 이

SIT on the production of cyt

때nes

In

murine thyme

αtes

SIT (500 mg/ 뼈 ) was

찌찌n1$[crc

녕 p.o. once a day for 7 days, and

the separared rhymocyres (2 x 10' cdls/ml) were culru

π

d for 72

h in RPMIl640 media. The secretion of cyrokines was determined

in supernatants of culrures with EUSA ki

【

. ^{끼1e data πpresents}

the mean:!:SE of 5 mice

os

방Uficandy 에fferent “)1t1

conrrol group (*

‘

p<0.05, **; p<O.(XH).

Ta

미

e

씨

. Effect of SIT on the pr,

여ucbon 이 이

tokines in

murine splen

∞ytes

잉 T (500 mg/kg) was administered p.o. once a day for 7 days, and

the separated splenocytes (2 x 10'

‘

:ells/ml) were culrured for 72

h in RPMlI640 media.

까1e secretion

of cyrokines was detennined

in supernatanrs of culrures with EUSA kit. The data

π

presents

the mean:!:SE of 5 mice.

*SignUICandy

ωfferenr

&om conr

빼 gro.q>

(*; p<O.O

χ

**; ^p<O.OI)

4. SIT

가 血淸 中

Cytokines

의 分뼈에 미지는 훨果

대조군의 혈청 중 -interferon및 interleukin

-2

의 양은 40.3:1:4.3 및 45.6

^土 2.8 P

밍빼 이 었으나 , SIT 를 투 여한 군은 75.4:t5.1 및 68.1

^土 4.8 p,

밍때로 대조군에 비 해 증가하였다

InterIeukin-4

의 양은 대조군에서

65.2:t5.1 p, 밍mJ

이었으며 ,

SIT

을 투여한 군은

58.5:t5.3 pg/mJ

로 대조군과 별 차이가 없었다{Table

VII).

T

뼈e VII. Effect

of SIT on the pr, 여ucUon of cytokin

않 m

mice serum

Samples

Produceion of Cytokine (pg/mI)

'i-Interferon Inrerleukin-2 Interleukin-4

Concrol 40.3t4.3 45.6t2.8 65.2t5.1

SIT 75.4

야 .1**

68.U4.8* 58.5:1:5.3

SIT (500 mg/kg) was aψninistered p.o. once a day for 7 days, and

the prod

띠ction

of

αr 피。nes

was determined in

양P 없t 떠 serum

wirh

EUSA kir. The dara represents the meantSE of 5 mice.

*S

밍nifi αntly

diffe

π

nr from conrrol group (*; p<0.05, **;

p<O.OI)

5. SIT

가 뼈뺨 大食細뼈로 루터

ni

’

ric oxide

의 生成애 미지는 훨果

대조군의 대식세포에 LPS 와 ¥-IFN 올 처리하지 않 았올 때 nitric

oxide(NO)

생 성 양은

24

시간 후에

1.2:t0.1).1M

이었으며

, LPS

와 ¥-IFN 을 처리하연 NO

생성양은 12.5

^土 0.3).1M

로 증가하였다 . SIT 를 투여하고 분리한 대식세포에 LPs 와 ¥-IFN 을 처리하였을 때

NO

생성양은 7.5 :to 씨M 로 대조군에 비해 감소하였 다{Table

VIII).

Table

에

I.

까'Ie pr, 여떠ion of nitric

oxide from peritoneal

ma

α。이laQeS

in SIT-administered mi

∞.

Samples Nirric oxidc(1IM)

12.1:!:0.1 Conrrol

SIT 7.5tO.3*

SIT (5oomg/kg) was administered p.o. once a day for 7 days, and

then 3% thio

밍ycollare

was injected i.p. ar the 4th day. Perironeal

macrophages obtained after 2 hrs. adhe

π

nee pen

여 we π culrured

in RPMl 1640 media in the presence lJ'S and 'i-interferon

*; Significantly different from control group (p<O.ool)

- 사상체짙의학회지 제 13 권 저 l3 호 am1 -

6. S|T

가 題圖 大食細뼈의 훌食能에 미지는 했果

G1emilllminescencd

α) 은 탐식작용이 진행되는 동

안 생성되는 oxygen

radical

에 의해 발생되며 , lucigenin 에 의해 증가되는 것으로 알려져 있다뼈

.

대조군의 대식세포로부터 생성되는 Q 의 양 보다 SIT 를 투여 하고 분리한 대식세포에서 생성되는 α 양이 현저 히 증가하였다〈Fig.2). 또한 FITCcmill 맹ted

E.

싸

particles

의 탐식도 현저히 증가됨을 관찰할 수 있었

다{Flg.3). 이는 SIT 가 대식세포의 탐식능을 중가시키 고 있음을 시사하는 것이다

.

goo

。

흔띈표

‘

mMNMMm wm%

“””

m

-c

그‘”

cgag-E그

=E ￡ u

1o 16 go 2s 3Q 3s

1lm (mlnJ

Flg.2 Effect of S|T on |u α germ Chernl|umlne$ ^〉 ence ^|n

munne pentonea| rna α ophages-

S|T(gmmgjkg) was administer

때 P.O.

once a day for 7

days, and then 3% thiog|yco!|ate was |njected i.p. at

4th day.

Peritonea| rrgcrophages (2x1

〔

f

∞|| 의me) 때tamed

after

2 h adherence perk

잉

were cunur

때 |n

DME medla

(Mh phe

이

red)

∞ntalnlng

opsonged

긴mOSan-

The

Chern||umines

∞

nce was measured at 5 min. interva|s

for 3O mm. @her pr α :edures were ^$$

매

ed as

deta||ed |n the n ^딩 tena|s a

때 method

section. Each

P 이 nt represents the rTear1 ± SE of 5 mice.

*; S|Qnlflrant|v d|fferent f 「α n

∞ntml

Qromp

〈

0.m1)

A

Flg.3 Photom|Crographs of englument of fMoresceln

conj

때ated

E

∞k parmes

|n pentonea| rrgcrophages

obtained from S|T-adrn|n|Stered m|Ce.

lnvened f|Uorom|cngpe photon1|Crographs (2mx)

showlng Uptake of f|uoresce|n

∞미Ugated

E coll

part|C|eS |n

∞ntro|

(A), and pentonea| nBC 「 Ophages

obtained from S|T-adm|nlStered m|Ce ( 테 .

|V.

_{考 察}

사상의학에서는 질병을

j

빼i뿜과

i

쁘i 펌으로 분류하 여 기폰의 짧팎짧맹과 시각의 차이를 보이고 있는

데 ,

rQ 강댔;倫J 에서는 g|j 氣의 f

냥人정도에 따라 l| 띠평

을 나누고 있지만 , 사상의학에서는 π-氣의}af 상정도 에 따라 病의 짧深과 l| 떠벙을 판단하고 있다’

7)

이

IF

氣는 保命之 -lE 라고 표현되고 있으며, 질병의 치료에 있어서 이 保命之〕5 의 보호에 모든 치료의 초점을 맞추고 있는 것을 볼 수 있다 .

少陰

A

은 전체적으로

^I{l

心했力이 아래에 있어 陰 化되기 쉬우므로 陽않之氣가 保命之 l, 라는 것을 바 탕으로 升降擺念을 운용한다

.

즉

,

衣病펌에 있어서 뽑太牌小한 職

^R

府的 특정으로 牌씨의

P易氣가 갱5 쐐에

억플린 바가 되어 , 뽑꾀의 陽氣가 그 핑*li 의 저항을

lO8

-

유

g

_{밸 외 1 少홈}

A

升뼈훌

u ^{의 免훌} m!l1II -

받아 不能直升하여 牌局에 速接하지 못하여 나타나

는 뽕狂證파

t

陽證 모두 상숭하지 못하는 陽氣를 어떻게 상숭시키느냐에 따라 , 다시 말하면 陰化된 기운올 어떻게 陽化시키느냐에 주안점을 두고 기본 방향이 정해진다

.

그래서 짧狂證의 無

ff

은 陽氣힘存 한데 營衛陰陽만의 不和한 때문이니 調和營衛하면 되나 亡陽證의 有

ff

은 陽氣不足으로 인한 律被外脫 이므로 治本하기 위하여 陽氣上升올 목표로 升陽益 氣法올 구사한다

2)

亡陽證올 기폰 한의학에서는 과다한 퓨버로 인한 精-氣와律滅의 外脫 현상으로 보았다. 亡陽證의 병 리인식에 있어서 ‘퓨多亡陽’으로표현하였고 38\

ff

出

不止나

I바뼈過極 둥의 원인으로

인하여 陽氣가 돌

연 홍종

i

용하면 大

ff

이 #*1 짧하고 없寒

,

手足冷

,

呼吸微 꿇, 面色훨白

,!IIi

微欲絡 둥의 중상이 나타난다

39)

이 에 대하여 李濟馬는 陰陽의 정상적인 升降運動 失 짧로 인한 律波의 外脫 , 즉 陽이 上升하지 못하고 도리어 下降하는 것으로 인식하였다

40)

소음인의 표병에서

t

陽證이 뽕狂證과 다른 점은 퓨出이 있다는 것인데, 땀이 계속하여 많이 나오연 이것은 陽이 虛脫 상태로 빠진 것을 의미하는바 , 뽕 狂證보다는 亡陽證이 훨씬 陽앓之氣, 즉 保命之主의 손상이 심한 것으로 규정하고 있다

³⁷⁾

이러한 亡陽證의 치료에 있어서 初證에는 桂技漫 에 固表止퓨의 효능올 가진 黃홉를 가미한 黃홉桂 校없을 사용하고 , 中證에는 升陽益氣시켜 陽氣의 虛 脫을 방지하는 의미로 升陽益氣陽 , 補中益氣揚 퉁올 사용하며

,

末證에는 附子와 肉桂를 사용하여 牌氣가 總하는 것을 방지한다

^,3)

升陽益氣陽은

r 東醫꿇 ftI:

保元』 에 처음으로 收錄 된 이래 여러 文敵에 기재되었으며

24,2j,4i43),

少陽人 뽑受熱表熱病의 亡陽初 中證올 치료할 목적으로 만들어진 處方이다

.

朱

4)

는 升陽益氣楊을 補中益氣陽 에서 비롯된 처방으로 보았으며

,

또한 金”과朱

⁴⁾

는 方뼈 구성상 桂技없과 補中益氣陽의 方意가 복합된 처방으로 보았다

.

이러한 升陽益氣揚은 止퓨固表 升 陽하는 효능이 있으며

,

主샘證으로 元

²⁴⁾

은 傷寒陽明 病

t

陽, 短氣, 失血뾰짧, 小兒 짧없 둥에, 朴

²⁾

은

g n,

없

IT

과 小兒의 毛髮과 뼈牙 發生에 웅용하였다

.

r 陽寒論 ^38)J

에서 桂校揚은 太陽病

4

훌園證올 主

펌하며 頭痛 , 發熱, 퓨出 , 앞

^;

風

,

服f}! 數 둥올 목표로

하고 있고 , 그 작용은 滋陰和陽하여 調和쩔衛하고 解

^JJJL

發

ff

하는데 있다

²³⁾

少陰

A

新定處方 中 桂 技傷 連系方으로 金

³⁾

은 川쯤桂技楊

,

黃 桂校揚, 升陽益 氣1£, 升陽益氣附子陽

,

黃

tt

技附子楊

,J\.

홍종桂校附 子陽

,J\.

훌官桂附子짧 둥올 열거했다

.

補中益氣楊은 李東혈에 의해 創方된 처방으로 四 股無力, 優침걷力, 앓옳, 少氣懶님

,

自

ff,

해急, 좀淡

n

품白 ,)jJj( 虛無力한 中氣下

P

섭證과 해

A

의 月經週期 短縮이나 過多月經

,

皮下버血이 나타나는 牌不統血 證

,

또는 氣虛發熱證 둥에 응용된다

^7.8)

r 東짧훌世保元」 의 少陰 A

補中益氣

1

^{易은 亡陽證}

의 初 中證에 升陽益氣 1 과 함께 적용되는 처방으 로

2)

’ 임상에서 일반 雜病 질환에도 폭넓게 웅용되고

있다껴

^,2),4244)

이상에서 본 桂技陽과 補中益氣없의 方意가 복합 된 처방개념으로 볼 때 升陽益氣陽은 俠義의

t

陽 證 개념에서 더 나아가 일반 雜病에도 널리 應用될 수 있을 것으로 생각된다

.

少陰

A

은 陽虛하기 쉬우므로 이로 인한 機能훌退 와 外

%

에 대한 짧抗力 減退는 免훌機能低下의 상 태로 나타날 수 있다

)

훌후훌훌學에서 免훨에 대한 개념은 『素問 刺法 論4J ^’

)

에 “正氣存內 뻐不可주

", rf

^{빔 上古天훨}

論 4J

^’

)

의 “훨氣從之 精神內守 病安從來

" r,

素 f암

1

平熱病論4J ^’

)

에“

%

之所鍵 其氣必虛”라고 하여 질병 의 성립 과정 중 正氣가 왕성하면 뻐氣가 침입하지 못하고 正氣가 허약하면

%

氣가 침입하여 발병한다 고 하였고r, 素問 擔論

^4)J

에서는 “衛氣

Z

所在 與

3

氣相슴而病發”이라 하여 衛氣를 外

%

에 대해 짧 抗하는 혔로 인식한 데서 드러난다

.

여기에서 正氣 와 衛氣는 생명활동의 원동력으로서 생체 방어기구 의 역할을 담당하는 기본적인 물질이라 볼 수 있으 며

,$

氣는 인체의 내외환경에 존재하는 각종 發病 벼

f

를 총칭한 것으로 六앓

,

^없

; 食, 勞健, 七情 둥을

의미한다고 볼 수 있다

% 쟁 )

免훨이란 생체가 自己와 非답

E

를 식별, 非自己 를 제거함으로써 자신올 보호하는 것을 의미하는 것으로, 면역세포가 항원에 특이한 반웅을 나타내어 內因性 및 外因性 이물질( 항원) 에 대한 감시와 방어 를 통하여 개체의 현常性을 유지하는 현상올 말한

다

^49-)1)

이러한 연역반웅은 T 및 B 임파구가 관련된

-

사상혜짚의억회지 셰 13 검 제3 효 2XJ1

-

特異的 免훨反廳과 대식세포가 관련된 非特異的 免 훌反應으로 대별되는데

,

특이적 연역반용은 세포성 연역반용과 체액성 연역반웅으로 구분되고

,

비특이 적 연역반웅은 영중반용과 탑식작용으로 구분된다

.

세포성 연역반용은 T 임파구에 의해 이루어 지는 것 으로 세포가 행동인자로 작용하여 개체를 보호하는 연역올 말하며

,

체액성 연역 반용은 T 임와구의 도 움올 받아 B 임파구에 의해 생산된 항체에 의해 이 루어지고

,

세포보다는 혈청내에 존재하여 항원과 결 합하여 대식세포에 의해 탑식되게 하거나 補體에 의해 용해되기 쉽게 만드는 것으로 항체가 行動困 子로 작용하여 생체를 보호하는 연역올 말한다

49.

’ 2)

본 실험에서 升陽益氣꿇SI1) 올 투여하였올 때 흉 선세포의 세포생폰용은 대조군에 비해 증가되었으 나, 비장세포의 세포생존율은 감소되었다

.

이는 SIT 가 특이적연역반웅 중 細

R

힘性免훨能을 증강시킬 수 있음올 시사하는 것이다 .

흉선세포는 흉선의 皮質 및 顧質에서 중식 및 분 화과정을 거쳐 helper

T

임파구(rh) 및 cytoto 찌

c T

임 파구 (Tc) 로 분화되며 , 분화된 Th 1 cell 은 'i-interferon

( 'i-

πN) 및 interleukin-2

(D..-2)

를, π12

cell

은 11-4,

11-5, IL-6

및 11-10 둥의 cytOkine 을 분비하여 다른 T 세포,

B

세포 및 대식세포의 증식과 분화를 촉진하며 ,

cytotoxic T cell

은 twnor

cell

의 용해를 일으키며 대식

세포를 활성화시킨다’”

대조군의 흉선세포중 π1

(CD4 single positive cell)

세포는 12.2%,

Tc (CDS single positive cell)

세포는

3.1%

로 정상 생쥐 흉선에서 α

4+CDS' cells

은 약

12%, CD4'CDS+ cells

은 약 3% 로 보고된 내용과 비슷

한 결과를 나타내었으며

,)

SIT

투여시 흉선세포의

Tc

세포 population 이 중가되었으나

,

까

¹

세포는 변화 되지 않았다

.

비장세포의 T 및 B 임파구의 비율은 변화되지 않았으나 , 비장의 T 임파구중 Th 세포

population

은 대조군에 비해 증가하였다

.

이는 SIT 가

흉선세포에서는 Tc 세포를 비장세포에서는 Th 세포 를 활성화하여 연역반웅을 중강시킬 수 있음올 시 사하는 것이다

.

SIT

투여시 흉선세포 배양액에 Th1 세포에서 분 비되는 'i-IFN 및 IL-2 는 증가하였으나 , π12 세포에 서 분비되는 ι4 는 변화가 없었다

.

또한 비장세포 배양액에서도 'i-IFN 및 D..-2 는 증가하였으나 , 11-4 는

변화가 없었다

.

혈청 중의

'i -IFN

및 D..-2 는 증가하였

으나 ,

D..-4

는 변화가 없었다

.

이 결파는 SIT 가 Th1 세

포를 활성화하여

cytokines

의 분비를 촉진함으로써 免훌能올 증강시킬 수 있음올 시사하는 것이다 .

Nitric oxide(NO)

는 T 임와구가 생성하는 cytokine 을

조절하며 , in

vivo

에서 T 임파구의 생명을 조절하는 인자 중 하나로 알려져 있다’

)

또한 NO 는 heper

T cell

의 중식올 억제하며’

Q

자기 연역계를 억제하는 것으로 보고’

⁷⁾

되었다

.

본 실험에서 SIT 투여시 대조 군에 비해 NO 생성이 감소하였다 .

외부로부터 이물질이 첨입하게 되면 생체는 자기 방어를 위해 대식세포가 활성화되어 탑식작용이 촉 진된다 이러한 탑식작용은 polymo 빼

ⁿ

^띠ear

^leukocytes

에서도 일어난다 탑식작용은 연역적인 측면에서 중 요하지만, 상처치유 과정에서도 매우 중요하다 본 실 험에서 대식세포의 탑식능올 측정하는데 cheniJwninescence 를 측정하는 방법올 이용하였다 . 이 방법의 원리는 대식세포가 particle 을 탑식하는 동안 oxygen

radical

을 생성하는데 , 이때 생성된 oxygen

radical

과 lucigenin 이

반웅하여

lucigenin cI1emilwninescence

를 발생하는 것올

측정함으로써 탑식능이 진행되는 것올 확인하는 것 이다.뼈 _{대식세포로부터} 생성되는 che 뼈wninescence

(a.)

를 측정한 결과 SIT 투여에 의해 Q 양이 현저히 중가하였다

.

또한 F1TC-conjugated

E. ^{coli particles}

의 탑 식작용도 현저히 중가됩올 관찰할 수 있었다. NO 는 활성화된 대식세포의 pseudo 때ia 형성을 억제하는 것으로 알려져 있다’

⁹⁾

본 실험에서 SIT 가 NO 생성 올 억제하고 탐식능올 중가시켰다는 결과는 SIT 가 대식세포의 탑식능올 증가시키는데 NO 가 일부 관 여하고 있음올 시사하는 것이다. 이는 SIT 가 非特異 的免훨反應도 증강시킬 수 있음올 시사하는 것이다

.

이상의 실험결과 升陽益氣없은

Th1

세포를 활성 화하여 cytokines 의 분비를 촉진합과 동시에 대식세 포의 탑식작용올 촉진하여 免흉能올 증강시키는 작 용이 있는 약물이라 사료된다

.

v.

^結뚫

少陰 A 升陽益氣1쩌SI1) 올 투여하여 면역세포인 흉선세포, 비장세포 및 대식세포에 대한 작용올 관

110 -

-

유

&

밸 외 1 : 少

PtA 升톰훌훌遍의 SIt 훌해 II

作

II! -

찰한 結果는 다음과 같다.

1.

뼈線細뼈의 細

8

힘生存率은 증가하였으나 , 牌嚴細

8

밍의 細

8

셉生存率은 감소하였다

.

2.

흉선세포 중 Tc 세포의 비율이 , 비장세포 중 Th 세포의 비융이 중가하였다

.

3.

흉선세포중 1{

- IFN

및 IL-2 의 양은 중가하였으나

,

ι.-4 의 양은 변화하지 않았다

.

4.

비장세포중 앙IFN 및 IL-2 의 양은 증가하였으나

, IL-4

의 양은 변화하지 않았다

.

5.

혈청 중 앙IFN 및 IL-2 의 양은 증가하였으나

, IL-4

의 양은 변화하지 않았다 .

6.

복강 대식세포로부터 nitric

oxide

의 생성올 억제하 였다

.

7

복강 대식세포의 탑식능이 중가하였다

.

이상의 실험결과 少陰

A

升陽益氣없은 Th1 세포 로부터 cytokine 의 분비를 촉진하여 특이적 연역반용 을

,

대식세포의 탑식작용을 촉진하여 비특이적 연역 반웅올 증강시킬 수 있는 처방이라 사료된다

매

.

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