Abstract
Industrial applications using natural microorganism resources are being attempted in various industries.
One of the most useful microorganisms is the Metschnikowia persimmonesis KCTC 12991BP which is from Calyx of Diospyros kaki. This strain is a highly anti-bacterial yeast that has recently been separated by a Korean research team for the first time. In this study, antimicrobial activity of the strain against plant-contaminated microorganisms was tested. Microorganisms that can occur in the strain and plants were cultured by pure isolation and then competition tests of them were done.
As a result, these tests were established that the Metschnikowia persimmonesis KCTC 12991BP has
Metschnikowia persimmonesis
(KIOM G15050 strain) 을 이용한 한약자원식물 방제기술 개발 KCTC 12991BP강다정1, 이경민2, 김대욱3, 강영민4,5*
한남대학교 생명시스템과학과 1.
경북대학교 농업생명과학대학 응용생명과학부 2.
우석대학교 약학대학 한약학과 3.
과학기술연합대학원대학교 한국한의학연구원 캠퍼스 한의생명과학전공
4. (UST), ,
한국한의학연구원 한약연구부 5.
Development of herbal medicine plants for control technology using Metschnikowia persimmonesis (KIOM G15050 strain)
KCTC 12991BP
Kang Dajung1, Lee Gyungmin2, Kim Dae Uk3, Kang Youngmin4,5*
1. Bio-Science & Technology, Hannam Univ., Daejeon, Rep. of Korea 2. School of Applied Biosciences, Kyungpook National Univ., Daegu, Rep. of Korea
3. Oriental Pharmacy, College of Pharmacy, Woosuk Univ., Jeonbuk, Rep. of Korea
4. Univ. of Science & Technology (UST), Korean Medicine Life Science Major, Campus of Korea Institute of Oriental Medicine, Daejeon, Rep. of Korea
5. Division of Herbal Medicine, Korea Institute of Oriental Medicine, Daejeon, Rep. of Korea
Correspondence: Kang Youngmin
University of Science & Technology (UST), Korean Medicine Life Science Major, Campus of Korea Institute of Oriental Medicine, Daejeon 34054, Rep. of Korea
Tel: +82-42-868-9684, Fax: +82-42-863-9434, E-mail: [email protected] Received 2018-04-19, revised 2018-05-01, accepted 2018-05-04, available online 2018-05-08 doi:10.22674/KHMI-6-1-5
antimicrobial activity against not only Botrytis cinerea and Fusarium oxysporum which were already been reported before, but also Fungal endophyte, Paecilomyces inflatus, Colletoirichum higginsianum, Sclerotinia sclerotiourm, and Alternaria alternata. Based on the mycostasis effects of this strain, it can be used as natural preservatives which is much more safer than chemical preservatives. Doing so will ensure the nation’s safety and furthermore, it is believed that it will be served as a first mover in the global herbal medicine market by establishing medicinal values from microorganisms separated from herbal medicine resources.
서론
최근 다양한 생필품에서 유해 화학물질이 검출되는 사태로 인한 케미컬 포비아 화학물질 공포증 가 ‘ ’( ) 확산되는 가운데 화학원료의 역할을 대체하기 위해 다양한 분야에서 천연 미생물 자원을 이용한 산업, , 적 응용이 시도되고 있다 이러한 시도는 최근의 건강한 삶을 추구하는 소비문화의 정착에 따른 사회적 . 분위기를 대변해주고 있는데 특히 농업과 임업 축산업과 수산업 그리고 환경 분야와 의학 분야에서 , , 미생물 자원을 활용한 활발한 산업적 움직임이 나타나고 있다1).
예를 들어 농업과 임업에서는 유용미생물 발효에 의한 유기비료와 유기퇴비를 사용하여 고품질 다수, 확의 작물을 재배하고 화학농약을 대체하여 병충해를 예방하는 동시에 토양의 개량으로 연작을 가능하 게 하는 시도가 행해지고 있다1-6). 또한 축산업과 수산업에서는 사료나 음용수에 유용미생물을 첨가하 여 가축과 어류의 병원성 미생물에 대한 내성을 증가시키고 육질을 개선시키려는 시도도 행해지고 , 있다1,7-9).
환경 분야에서는 미생물을 이용하여 수질 정화 악취 제거 및 음식물 쓰레기의 효율적 처리를 도모 , 하고 있고1,10-12), 의학 분야에서도 미생물로 발효시킨 항산화 음료인 EM-X를 사용하여 인체 내 활성 산소를 제거하여 노화를 방지하고 염증 수치를 낮추려는 시도를 하고 있다1,13,14). 이처럼 다양한 산업 분야에서 친환경적인 접근법의 필요성이 부각되면서 필연적으로 미생물 제재의 개발과 사용량이 증가 하고 있다15).
위와 같은 산업에 이용될 수 있는 유용미생물 중에는 시체(柿蔕)라는 한약재에서 분리된 Metschnikowia persimmonesis KCTC 12991BP균도 속한다고 볼 수 있는데 이 균주는 최근에 국내 , 연구팀에서 최초 분리하여 동정한 항균활성이 높은 효모균이다16). 방제효과라는 것은 다양한 생물적 기법을 이용한 병해 방제법을 의미하는데 병원체에 대한 교차방어 이용 길항미생물 도입 등을 이용하, ,
고 있다17,18). 특히 최근의 생물학적 방제에는 산 생물자재에 의해 병원체의 생존이나 활성을 저하시켜
병해를 감소시키는 방법이 사용되고 있는데 이 생물학적 방제에는 크게 가지 방법이 있다 첫 번째로 3 . 자연적인 생물적 방제 두 번째는 길항생물 도입 그리고 세 번째로 환경개선 원래 토양에 생식한 , , , 길항미생물의 영양을 위한 유기물을 토양에 첨가 토양수분 토양산도의 교정 열 또는 화학물질을 , , ,
Keywords: biotechnology, herbal medicine, plant, microorganism, biopesticide
(Metschnikowia persimmonesis KCTC 12991BP)균과 식물체에서 발생할 수 있는 균을 순수 분리하 여 배양한 후 각각 , MP균과 식물에서 발생할 수 있는 균을 대치 배양하였다 또한 부분적으로 대치배. , 양의 방법을 다양하게 수행하여 여러 측면에서의 실험결과를 도출하였고 이를 이용하여 MP균이 가진 항균력으로 인체에 무해하고 환경문제로부터 자유로운 저렴한 한약기반의 천연항균제의 개발 가능성 을 살펴보았다.
본론 균 배양 1. MP
실험에 앞서 대치배양에 사용된 Metschnikowia persimmonesis (KIOM G15050 Strain) KCTC 을 하여 계대배양 하였다 균주는 년 월 일 국내 특허출원 출원번
12991BP Stricking . MP 2016 10 21 (
호: 10-2016-0137873)와 국제 출원PCT (출원번호: PCT/KR2017/003811)로 출원된 감나무 묵은꽃, 받침에서 분리한 Metschnikowia persimmonesis 특허균주이다. 미생물 순수배양을 위해 LB
배지와 배지에서 공동배양 하였다 배양 조건은
(Luria-Bertani) broth PD (Potato Dextrose) broth .
에 배지를 넣은 후 암 조건에서 시간 하였다 현탁된 배양액
50mL tube 15mL 100rpm 48 incubation .
을 하여 가 포함된 와 배지에 차 계대 배양하였다 자세한 배양 방법 및
2mL transfer agar LB PD 1 .
균 생육방법은 Kang et al. (2017)16) 과 Choi et al. (2018)21)에 확인 할 수 있다.
차적으로 계대된 미생물들은 를 얻기 위해 멸균된 을 이용하여
1 single colony streaking stick 3-4
회 이상 지속적으로 계대 배양을 하였다 최종적으로 . LB에서 자란 미생물과 PD에서 자란 미생물들은 각각 1.5mL E-tube에 보관하여 대치배양 진행 전까지 glycerol 25%에 현탁하여 실험 전까지 – ℃20 에 보관하였다.
식물 오염 미생물 순수분리 및 균주동정 2.
식물 조직배양 실험 중 발생한 미생물 오염을 바탕으로 PDA (Potato Dextrose Agar) 배지와 LBA 배지에 각각 배양하였다 각 배지에서 생육된 미생물을 바탕으로 육안으로 확인 (Luria-Bertani Agar) .
할 수 있는 미생물들을 각각 분리하였다(Fig. 1). 육안으로 확인 가능한 종류의 미생물들만 남아있다고 보일 때까지 계대배양을 실시하였다 한 종류의 균만 남아있다고 확인될 때 각각의 균들을 유전자 . , 동정하기 위한 샘플링을 실시하였다.
순수 분리를 통해 배양한 균들을 PDA와 LBA 배지별로 시료확인번호를 부여하였다. PDA와 LBA 배지에서 순수 분리된 박테리아와 곰팡이는 각각 16s rDNA와 18s rDNA를 통하여 염기분석을 실시 하였다 본 연구에서 사용된 . DNA sequencing은 Kang et al.16)과 Kim et al.19)의 논문에서 사용된 분석법을 이용하였다 이 때 사용한 . 16s rDNA의 universal primer는 27F (5 -AGAGTTTGATCCTG′
와 이고 의 는
GCTCAG-3 )′ 1492R (5 -GGTTACCTTGTTACGACTT-3)′ , 18s rDNA universal primer
와 이다 각각의
27F (5 -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 )′ ′ 492R ('GGTTACCTTGTTACGACTT-3 )′ . 대상시료는 Nucleotide BLAST (NCBI: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)를 이용하여 균동정을 실시 하였다 동정되지 않은 미생물의 경우 재분석을 통해 분류하였으며 그 후 동정된 시료는 . , Table 1에 나타내었다.
식물 조직배양 중 발생한 미생물 위 과 순수분리 된 미생물 아래
Figure 1. ( ) ( )
결과 Table 1. DNA sequencing
S/NO Scientific name rDNA type
1 Arthrobacter protophormiae 16s
2 Bacillus aryabhattai 16s
3 Curtobacterium citreum 16s
4 Exiguobacterium acetylicum 16s
5 Klebsiella oxytoca 16s
6 Kurthia gibsonii 16s
7 Microbacterium sp. 16s
8 Pantoea agglomerans 16s
9 Pantoea sp 16s
10 Pantoea vagans 16s
11 Staphylococcus saprophyticus 16s
12 Stenotrophomonas rhizophila 16s
13 Streptococcus sp. 16s
14 Actinoplanes sp. 16s
15 Pseudomonas sp. 16s
S/NO Scientific name rDNA type
1 Aureobasidium pullulans 18s
2 Aureobasidium sp. 18s
3 Bacillus safensis 18s
4 Coprinellus radians 18s
5 Discosia sp. 18s
6 Fungal endophyte 18s
7 Fusarium oxysporum 18s
8 Pestalotiopsis mangiferae 18s
9 Rhizopus oryzae 18s
10 Verticillium dahliae 18s
11 Ganoderma mirabile 18s
12 Phanerochaetesordida 18s
13 Paecilomyces inflatus 18s
14 Chaetomiaceae sp. 18s
15 Plectosphaerella cucumerina 18s
대치배양 3.
처음으로 계대배양을 실시한 Metschnikowia persimmonesis과 이전 연구에 소개된19) 식물 오염 미생물 group을 bacteria는 bead, fungi는 punch를 이용하여 대치배양을 실시하였고 균의 특성으, 로 인해 두 가지 방법 모두를 이용하였다 그 예로 . MP균과 identification된 식물 오염 미생물을 각각 stricking 혹은 drop 시켜서 접종하는 두 방법을 이용하여 대치배양을 실시하였다.
또한 한천배지에 시험 균주를 골고루 접종시키고 일정 양의 항균제를 처리한 페이퍼디스크 등을 올려 세균을 배양한 후 항균제가 페이퍼디스크로부터 한천배지로 확산되는 원리를 이용하였다 페이퍼디스. 크 등으로부터 멀리 확산되어 갈수록 항균제의 농도는 낮아지며 미생물의 생장이 이루어지게 된다.
이 때 세균의 생장이 가능한 최소의 농도를 MIC(최소 저해 농도 라고 하며 생장이 이루어지지 않는 ) 구역을 생장저해구역(Zone of Inhibition)이라고 한다 생장저해구역의 직경은 페이퍼디스크에 가한 . 항균제의 농도 및 용해도 확산 상수 및 전반적인 효능에 비례하며 이러한 직경의 크기를 비교함으로써 , 항균제의 활성정도를 비교할 수 있다.
또한 농업 및 임업에서 문제가 되고 있는 종 병원성 4 Botrytis cineria, Colletoirichum higginsia- num, Sclerotinia sclerotiourm 그리고 Alternaria alternata과 MP균의 길항효과를 실험하였고 대치 배양 결과 전체적으로 종 모두 저해하는 길항효과를 나타내고 있음을 확인할 수 있었다4 .
유전자 된 식물오염균과
Table 2. identification Metchnichonia persiomensis의 대치배양결과
No. rDNA Scientific Name Korean Name
Result of test
Inhibition Control Treatment
1 16s Arthrobacter
protophormiae
아르테르박테
르속 균 세균( ) △
2 16s Bacillus aryabhattai
바실러스 아리아바타이
세균 ( )
X
3 16s Curtobacterium citreum
코르토박테리
아 세균( ) - - -
4 16s Exiguobacterium acetylicum
엑시구옴박테
리움 세균( ) X
5 16s Klebsiella oxytoca
클레브시엘라 옥시토카
세균 ( )
X
6 16s Kurthia gibsonii
쿠르티아 기브소니
세균 ( )
△
7 16s Microbacterium sp. 마이크로박테
리움 세균( ) - - -
8 18s Pantoea agglomerans 등나무혹병균 진균
( ) △
9 16s Pantoea sp. 판토에아속 균
세균
( ) - - -
10 16s Pantoea vagans 판토에아속 균
세균
( ) △
11 16s Staphylococcus saprophyticus
비병원 포도상구균
세균 ( )
X
12 16s Stenotrophomonas rhizophila
스테노트로포 모나스 라이조필라
세균 ( )
- - -
13 16s Streptococcus sp. 연쇄상구균 세균
( ) △
14 16s Actinoplanes sp. 액티노플레인
즈 세균( ) - - -
15 16s Pseudomonas sp. 슈도모나스속
균 세균( ) △
No. rDNA Scientific Name Korean Name
Results of test
Inhibition Control Treatment
1 18s Aureobasidium
pullulans 흑효모 진균( ) X
2 18s Aureobasidium sp. 아우레오바시
즘속 균 진균( ) △
3 18s Bacillus safensis
바실러스 사펜시스
진균 ( )
X
4 18s Coprinellus radians 노랑쥐눈물버
섯 진균( ) X
5 18s Discosia sp. 디스코시아속
균 진균( ) X
6 18s Fungal endophyte 균질 내생식물
진균
( ) O
7 18s Fusarium oxysporum 토마토시들음
병균 진균( ) △
8 18s Pestalotiopsis mangiferae
페스탈로티옵
시스 진균( ) - - -
9 18s Rhizopus oryzae 누룩곰팡이
진균
( ) △
10 18s Verticillium dahliae
시들음병균, 딜리애균
진균 ( )
X
Luria-Bertani Agar (LBA) and Potato Dextrose Agar (PDA) was used for this study.
O: Highly Inhibited, △: Medium Inhibited, X: Not Inhibited, ★: Over growth 11 18s Ganoderma mirabile 애귀방귀버섯
진균
( ) ★
12 18s Phanerochae tesordida
파네로차에 테소디다
진균 ( )
- - -
13 18s Paecilomyces inflatus 패실로마이세
스속 균 진균( ) O
14 18s Chaetomiaceae sp. 체토미아세균
진균
( ) △
15 18s Plectosphaerella cucumerina
내생진균속 균 진균
( ) △
Fig 2. Botrytis cineria 외 종의 병원성 균에 대한 3 MP균의 대치배양 결과
결론
최근 소비자의 건강 지향적 성향과 함께 천연물에 대한 수요가 급증하고 있는데 이와 같은 경향과 , 일치하게 천연 항균제 등 천연물을 이용한 다양한 제품을 요구하는 소비자의 욕구를 충족할 수 있는 고기능성 자원의 개발이 필요하다 특히 화장품 의약품 식품 등에 들어가는 인공 합성보존제의 사용을 . , , 가능한 한 줄이려는 추세이고 화학 보존제를 대체할 역할로 안정성이 확보된 천연방부제의 개발이 , 필수적이다 세계 화장품용 방부제 시장규모는 . 2014년 39억 달러 규모에서 2016년에는 43억 달러 규모로 국내 화장품용 방부제 시장은 , 2014년 1,03억 달러에서 2017년에는 1.12억 달러 규모로 성장 할 것으로 보인다.
더 나아가 각종 한약재의 저장성 향상과 안정성 확보라는 견지에서도 천연방부제의 개발의 중요성이 강조되고 있는데 현재까지 한약재의 포장 보관 및 가공 후 저장 시 충해와 곰팡이 같은 미생물 생장의 , 억제는 주로 이산화황과 같은 화학 약제의 살포로 이루어졌다 비록 이산화황이 한약재를 탕제로 달인 . 경우 거의 검출되지 않아 안전하지만 우리나라 소비되는 한약재의 , 70-80%가 수입한약재로서 원료 한약재를 직접 사용하는 환 산제의 경우 이산화황 , 10ppm이상을 흡수하게 되면 몸속에서 산으로 바뀌어 위염 위궤양 인후통을 일으키는 부작용이 있을 수 있다 또한 , , . Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus, Aspergillus nomious 등의 Aspergillus속 곰팡이에 의해 생성된 아플라톡신과 같은 맹독 소에 의한 오염을 다 방지할 수는 없는 실정이다 그래서 한약유래 천연물질의 항균제로 한약재의 . 포장 유통 저장 시 안전하게 품질을 관리할 수 있는 보존제의 개발이 필요한 실정이다, , .
따라서 본 연구의 목적은 인체에 무해하고 환경문제로부터 자유로운 저렴한 한약기반의 천연항균제 를 개발하는 것으로서 이를 위해 시체, (柿蔕) 추출물로부터 분리된 Metschnikowia persimmonesis
균을 이용하여 항균력을 알아보았다 그 결과 균주의 항균 활성은 기 보고된
KCTC 12991BP . MP
Botrytis cinerea 및 Fusarium oxysporum 곰팡이균 뿐만 아니라 본 연구에서 추가적으로 , Fungal endophyte, Paecilomyces inflatus, Colletoirichum higginsianum, Sclerotinia sclerotiourm 그리고 Alternaria alternata에 대한 항균활성을 가진 것으로 나타났다 이 특허균주 및 길항물질이 가지는 . 정균작용(靜菌作用, mycostasis)22)과 선택적 방제효과를 이용해 식품 의약품 화장품에 활용되는 화, , 학보존제를 대체하여 안정성이 확보된 한약재 유래 천연 방부제를 개발할 수 있을 것이다 그렇게 . 한다면 한약재 유래 미생물 천연 보존제 이용확대로 인한 국민 보건 및 안정성이 확보되고 더 나아가 한약자원으로부터 분리된 미생물에 대한 약용가치를 발굴하여 산업 소재화를 하여 세계전통의약 시장 을 선점하는 역할을 할 것으로 사료된다.
감사의 글
본 연구는 한국한의학연구원 기술수요 맞춤형 한약재 유래 특허균주(KIOM G15050 Strain)를 이용한 화장품 보존제 개발(K18720&K18721) 및 아토피 피부염 한의치료기술 과학적 근거 구축을 위한 장내
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