74 책임저자：노주원, 210-340, 강원 강릉시 대전동 290번지
한국과학기술연구원 기능성천연물센터 Tel: 033-650-3651, Fax: 033-650-3679 E-mail: cwnho@kist.re.kr
접수일：2011년 1월 27일, 1차 수정일：2011년 2월 1일, 2차 수정일：2011년 2월 7일, 게재승인일：2011년 2월 11일
Correspondence to：Chu Won Nho
Functional Food Center, Korea Institute of Science and Technology, 290, Daejeon-dong, Gangneung 210-340, Korea
Tel: ＋82-33-650-3651, Fax: ＋82-33-650-3679 E-mail: cwnho@kist.re.kr
다래나무의
tert-
butyl Hydroperoxide로 유도된 산화적 스트레스에 대한 간 보호 효과1한국과학기술연구원 천연물소재센터, 2강릉원주대학교 해양응용생명공학부
조은혜1,2ㆍ강경수1ㆍ이희주1ㆍ김철영1ㆍ신일식2ㆍ노주원1
Hepatoprotective Effects of Actinidia arguta against Oxidative Stress Induced by tert-butyl Hydroperoxide
Eun Hye Jho1,2, Kyungsu Kang1, Hee Ju Lee1, Chul Young Kim1, Il-Shik Shin2 and Chu Won Nho1
1Natural Products Research Center, Korea Institute of Science and Technology, Gangneung 210-340, 2Department of Applied Marine Biotechnology and Engineering, Gangneung-Wonju National University, Gangneung 210-702, Korea
The fruits and leaves of Actinidia arguta are a well-known Korean folk medicine for treatment of jaundice, fever, acute hepatitis and bleeding by an external wound. The purpose of this study was to investigate the hepatoprotective effect of A. arguta on tert-butyl hydroperoxide (t-BHP) induced oxidative stress in HepG2 human liver cancer cells. Cell viability, generation of reactive oxygen species, quantification of total glutathione, total polyphenolic compounds were evaluated in this study. Pretreatment of the extract from A. arguta extract, butanol and ethyl acetate fractions strongly prevented cytotoxicity induced by t-BHP. Reactive oxygen species generation induced by t-BHP was significantly decreased when the cells were pretreated for 24 h with either 10∼40μg/ml extract or hexane, ethyl acetate, butanol fractions. In addition, lower levels of total glutathione (GSH) caused by t-BHP in HepG2 cells were recovered by a pre-treatment with extract and 3 fractions. The contents of total polyphenolic compounds were also determined using a modified Folin-Ciocalteu colorimetric method. The ethyl acetate and butanol fractions had high phenolic compounds, and they showed 136.61μg/100 g and 211.64μg/100 g, respectively, suggesting that these antioxidants content was correlated with their hepatoprotective activity.
Therefore, these result suggest that the A. arguta could be a potential candidate of hepatoprotective agents against oxidative stress. (Cancer Prev Res 16, 74-79, 2011)
Key Words: Hepatoprotection, Dietary antioxidant, Oxidative stress, tert-butyl hydroperoxide
서 론
산소는 세포가 호흡하는 과정에서 필수적이지만, 불 완전하게 환원되면 강력한 산화제가 되어 활성 산소종 (reactive oxygen species, ROS)이 생성하기도 한다. 한편, 인
체 내에서 활성산소를 조절하는 효소계열의 catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GPx)와 비효소계열의 vitamin C, glutathione (GSH) 등 항 산화 물질이 존재한다.1) ROS는 세포 내 기본적인 대사과 정에서도 생산되는데, 라디칼 생성과 라디칼 소멸의 불 균형으로 인한 ROS의 축적이 인체에 산화적 스트레스를
유도하여 암, 노화, 심혈관질환, 간질환, 당뇨병을 일으 키기도 한다.2∼4)
간은 인체 내에서 영양소의 대사, 해독작용 기능을 담 당하는 중요한 조직으로 간 손상은 알코올, 바이러스에 의한 감염, 약물의 오남용, 산화적 스트레스에 의한 ROS 의 생성 등 여러 가지 원인이 될 수 있다.5∼7) 생성된 ROS 의 표적이 될 수 있는 단백질과 핵산, 세포막 등을 손상 시키게 되는데 대표적으로 tert-butyl hydroperoxide (t-BHP) 는 지질과산화반응을 촉진하고 세포의 DNA에 손상을 주어 세포독성을 유도하는 등 세포손상과 세포사멸을 유도한다.1)
현재까지 인체에 무해하면서 항산화 효과가 있는 천 연물을 이용하여 산화적 스트레스에 의해 유발되는 여 러 질병과 손상을 예방, 치료하는 물질 연구가 활발히 이루어 지고 있다. 다래나무(Actinidia arguta)는 다래나무 과(一科 Actimidiaceae)에 속하는 낙엽이 지는 덩굴식물로 서 우리나라 곳곳의 깊은 산의 숲 속에 나며, 일본ㆍ중국 에도 분포한다. 다래나무의 열매는 다래라고 하며 이 열 매를 햇볕에 말린 것을 미후도(彌猴桃)라 하여 발열, 황 달, 소화를 돕는데 쓰였다.8) 다래나무의 연구는 A. arguta 의 열매에서 분리한 caffeic acid, quercetin, esculetin 등 다양 한 organic acid와 coumarin, flavonoids에 대한 간단한 항산 화작용과 산화질소의 생성을 억제하는 활성이 보고되어 있고,9) A. arguta의 뿌리에서 분리된 ursolic acid, 2,3-hy- droxyursolic acid, corosolic acid, asiatic acid and betulinic acid 등 다양한 triterpene류의 화합물이 췌장의 lipase 억제에 관여한다는 연구가 보고되어 있다.10) 본 연구에서는 다 래나무 잎의 추출물 및 분획물이 t-BHP에 의해 유도된 산화적 스트레스에 대해 간 보호 효과를 나타내는지 확 인하고자 인간 간암세포주인 HepG2 세포에서 MTT assay 를 통해 세포 생존율을 조사하고, 직접적인 ROS 생성의 변화와 total GSH의 level을 확인하였다. 또한 식물에서 항산화 성분으로 잘 알려져 있는 total polyphenol 함량을 확인하였다. 이와 함께 해열제와 진통제로 많이 사용되 고 있는 화합물로 Acetaminophen (AP)의 높은 농도처리에 의한 간세포독성 보호효과를 알아보고자 하였다.11,12)
재료 및 방법 1. 식물시료
본 실험에서 사용된 다래나무(A. arguta)의 잎은 강원도 평창에서 2009년 7월에 채집하여 건조한 후 94% ethanol 로 추출하여 감압농축장치에서 건조하였고 이 추출물을 증류수로 현탁한 후 n-hexane, ethly acetate, n-butanol 순서
로 분획하였고 모든 시료는 dimethyl sulfoxide (DMSO)에 녹여 사용하였다.
2. 세포배양
본 실험에서 사용한 인간 간암 세포주인 HepG2 세포 는 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)으 로부터 분양 받아 사용하였다. HepG2 세포는 10% fetal bovine serum (FBS, Hyclone, Logan, UT, USA), 100 units/ml penicillin, 100μg/ml streptomycin이 포함된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)을 사용하였고 37oC, 5%
CO2 incubator에서 배양하였다. 배양된 세포는 2∼3일 간 격으로 계대 배양하여 실험에 사용하였다.
3. Total polyphenol 화합물 함량
다래나무의 추출물 및 분획물의 total polyphenol 화합 물 함량은 널리 사용되고 있는 Folin-Ciocalteu방법13)을 변 형하여 측정하였다. 즉, 96 well plate에 1,000 ppm 농도의 각 시료를 넣고 Folin-Ciocalteu reagent 20μl와 증류수 60 μl를 혼합하고 상온에서 5분 방치하고 20% Na2CO3 100 μl를 가하여 상온에서 30분 동안 방치한 후 730 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 시료의 total polyphenol 함량 은 gallic acid로 표준곡선을 작성하여 mg gallic acid equiv- alent/100 g로 계산하였다.
4. t-BHP와 AP로 유도된 간독성에 대한 간세포 보호
활성
배양한 인간 간암 세포주인 HepG2 세포에서 t-BHP에 의한 산화적 손상과 Acetaminophen (AP)에 의한 간손상에 대한 다래나무의 추출물 및 분획물의 보호효과를 MTT 를 이용하여 측정하였다. 배양한 세포를 1×105 cells/ml로 96 well plate에 분주하고 37oC CO2 incubator에서 24시간 배양하였다. 배지를 제거한 후 시료가 농도별로 첨가된 FBS-free DMEM 배지를 24시간 전처리 하였다. 그 후에 배지를 제거하고 Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) 1번 wash하고 FBS-free DMEM 배지에 200μM의 t-BHP, 40 mM의 AP를 넣어 처리한 후 각각 3 또는 24시 간 동안 37oC CO2 incubator에서 배양한 후 MTT assay를 통하여 세포의 생존율을 측정하였다.
5. t-BHP로 유도된 ROS의 생성에 대한 억제활성
세포의 ROS 생성은 fluorescent microplate reader (Power- WaveTM XS, Bio-Tek Instruments, Winooski, VT, USA)를 이 용하여 2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCFDA) assay를 통해 정량하였다. HepG2 세포를 1×105 cells/ml로
Table 1. Total phenolic contents of A. arguta (extract and fractions (mg/100 g)a
Total polyphenolic compound contents
A. aruguta extract 82.45±3.06b
Hexane fraction 17.05±3.81
Ethyl acetate fraction 136.61±2.15
Butanol fraction 211.64±6.23
aPhenolics contents was expressed as mg GAE/100 g. bEach value is mean±from three independent experiments with triplicates determination.
96 well plate에 분주하고 37oC CO2 incubator에서 24시간 배양한 후 시료를 농도별로 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지에 넣고 24시간 전처리한다. 그 후 10μM 10μl 의 H2DCFDA를 첨가하고 30분 동안 37oC CO2 incubator에서 배양하고 DPBS로 wash한 후에 200μM t-BHP를 첨가한 배지를 처리하고 시간대별로 측정하였다. DCF 형광은 485 nm와 530 nm에서 Synergy HT Multi-Mode Microplate Reader (Bio-Tek Instruments, Winooski, VT, USA)를 이용하 여 측정하였다.
6. 세포내 GSH의 측정
세포내 GSH은 항산화 활성의 지표로 recycling enzy- matic assay14,15)를 일부 변형하여 96 well plate에서 측정하 였다. 시료처리 후 HepG2 세포는 ice cold DPBS로 wash하 고 143 mM sodium phosphate buffer (0.1% Triton-X and 8 mM EDTA 첨가)로 세포를 용해시켰다. 세포 용해물은 5% sulfosalicylic acid를 넣고 5분 후에 120μl의 1.68 mM 5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoic acid (DTNB)와 3.33 U/ml gluta- thione reductase (GR)을 넣고 반응시키고, 60μl의 895μM β-NADPH를 첨가한 후, 450 nm에서 흡광도를 측정하였 다. Glutathione의 농도는 GSH의 표준곡선을 통하여 계산 되었다. 단백질 농도는 Bio-Rad Protein Assay kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 측정하였다.
7. 통계
각 실험결과는 평균 및 표준편차를 구하고, student t-test를 이용하여 통계 처리한 후 p＜0.05 수준에서 유의 성을 검정하였다.
결과 및 고찰
1. 시료의 total polyphenolic 화합물 함량 측정
Polyphenolic 화합물은 식물에 함유되어 있는 대표적인 항산화 물질로 콜레스테롤 저하작용, 항암작용 등 다양 한 기능을 가지고 있다.16) 특히 항산화 작용과 관련하여 최근 생체 내에서의 산소 free radical반응이 생체조직의 노화나 질병과 관련이 있으며 polyphenolic 화합물의 hy- droxyl group은 유지의 유리기 수용체로서 유지 산패의 초기 단계에 생성된 유리기들이 안정된 화합물을 형성 하도록 하여 산화억제 작용을 한다.17)
다래나무 추출물 및 각 분획물의 total polyphenolic 화 합물의 함량은 Table 1과 같다. 특히 butanol 분획물과 ethyl acetate 분획물은 각각 211.64 mg GAE/100 g, 136.61 mg GAE/100 g로 polyphenolic 화합물 함량이 높음을 알
수 있었다. 다래나무의 열매와 잎에는 kaempferol, querce- tin 등 다양한 flavonoid가 분리된 것으로 알려져 있다.9)
2. 간세포의 산화적 손상에 대한 A. arguta 의 보호 효과
t-BHP는 간세포 내에서 cytochrome P450에 의해 peroxyl 및 alkoxyl radical로 대사되며 이러한 radical이 지질과산화 를 일으켜 세포 손상을 준다고 알려져 있다.18) 본 실험에 서는 t-BHP에 의한 A. arguta의 간세포 보호효과를 규명 하기 위해서 간암세포인 HepG2 세포에 다양한 농도로 A. arguta의 추출물 및 분획물을 전 처리한 다음, t-BHP 200μM을 3시간 동안 처리 후, MTT assay를 통해 세포 생존율을 측정하였다. 그 결과, t-BHP만을 처리한 군은 생존율이 28%로 현저하게 감소한 반면, 추출물의 경우 2.5∼80μg/ml 농도에서 70∼96%의 생존율을 보였다.
Hexane 분획물 10μg/ml 처리시 64.95%의 생존율을 보였 고, 농도가 높아질수록 세포생존율이 감소하였는데, 이 는 Hexane 분획물이 가지는 세포생장저해효과에 기인한 것으로 생각된다. Ethyl acetate 분획물에서는 20μg/ml 농 도에서 가장 높은 104.98% 생존율을 보였다. 특히 buta- nol층은 다른 분획물 중 가장 좋은 보호효과를 나타내었 는데 butanol 분획물 10∼40μg/ml 처리시 101.25∼116.37%
의 생존율을 나타내었다(Fig. 1). 요약하면, A. arguta의 추 출물및 ethyl acetate, butanol 분획물이 t-BHP에 의해 유도 된 세포독성에 대해 강력한 보호효과를 보이는 것으로 판단된다. 한편 국내산 참다래(Actinidia deliciosa)과실 (Kiwifruit) 추출물의 t-BHP로 유도된 산화적 스트레스에 서 신경세포 PC12 세포주에 대한 보호효과가 최근 연구 된바 있다.19)
3. Acetaminophen (AP)에 의한 세포독성에 대한 보 호효과
진통제와 해열제로 쓰이는 Acetaminophen (AP)은 치료
Fig. 1. Hepatoprotective effects of A. arguta extract (A) and fractions (B) against on t-BHP induced cytotoxicity in HepG2 cells.
HepG2 cells were pre-treated with the extract (2.5∼80 μg/ml) and hexane, ethyl acetate, butanol fractions (H, EA, B, 10∼40 μg/ml) and quercetin (10 μM), epigallocatechin gallate (EGCG, 10 μM) for 24 h, and then the cells were treated t-BHP (200 μM) for another 3 h. Cell viability was determined by using MTT assay. Quercetin, EGCG was used as positive controls. The graphs were representatives from three independent experiments. Each bar represents the mean±SD from triplicate experiments.
*p＜0.05, significant with respect to t-BHP treatment.
Fig. 2. Hepatoprotective effects of A. arguta extract and frac- tions against Acetaminophen induced cell death in HepG2 cells. HepG2 cells were pre-treated with the extract (2.5∼80 μg/ml) and hexane, ethyl acetate, butanol fractions (H, EA, B, 10∼40 μg/ml) and sulforaphane (5 μM), epigallocatechin gallate (EGCG, 10 μM) for 24 h, and then the cells were treated acetaminophen (APAP, 40 mM) for another 24 h. Cell viability was determined by using MTT assay. Sulforaphane, EGCG was used as positive controls. The graphs were representatives from three independent experiments. Each bar represents the mean±SD from triplicate experiments. *p
＜0.05, significant with respect to APAP treatment.
효과가 있는 농도에서는 안전한 약물이지만, 높은 농도 에서는 간에 손상을 줄 수 있다. AP는 cytochrome P450에 의해 유독한 대사산물인 N-acetyl-p-benzoquinone imine (NAPQI)로 산화된다.20) 다래나무 추출물 및 분획물의 AP 에 의해 유도된 세포독성에서 HepG2 세포주에 대한 간 세포 보호효과에 대한 결과는 Fig. 2와 같다. 40 mM의 AP를 24시간 처리하였을 때 세포의 생존율은 50% 수준 으로 감소하였다. 이때 추출물 및 ethyl acetate, butanol 분 획물 전 처리시 세포사멸이 억제되었다. 따라서, 다래나 무 추출물은 t-BHP에 유발된 산화적 스트레스에 의한 간 손상뿐만 아니라, 약물독성에 의한 간 손상에 대한 보호 효과도 가짐을 시사한다.
4. 활성산소종(Reactive oxygen species)의 생성 억제 효과
비형광의 2’,7’-dichlorofluorescin (DCFH)은 세포내의 ROS 와 반응하여 강한 형광을 가지는 DCF를 형성하는데, 따 라서 이의 형광을 세포내 ROS를 측정할 수 있다.
HepG2세포에 200μM의 t-BHP를 60 min간 처리하여 ROS생성량을 관찰하였다. HepG2 세포에 10∼40μg/ml 의 다래나무 추출물 및 분획물을 전 처리한 결과 t-BHP 만 단독 처리한 세포에 비해 ROS생성이 현저하게 감소 하였다. 이는 양성 대조군인 quercetin (10μM)과 Epigallo-
Fig. 4. Effects of A. arguta extract and 3 fractions on total glutathione (GSH) level. HepG2 cells were pre-treated with the extract (EXT, 10 μg/ml), 3 fractions (H, EA, B, 10 μg/ml) for 24 h, and then the cells were treated t-BHP (200 μM) for another 3 h. Quercetin (10 μM), epigallocatechin gallate (EGCG, 10 μM) was used as positive controls. The graphs were representatives from three independent experiments.
Each bar represents the mean±SD from triplicate experiments.
*p＜0.05, significant with respect to t-BHP treatment.
Fig. 3. Effects of A. arguta extract and fractions on intracellular reactive oxygen species (ROS) generation. (A) HepG2 cells were pretreated with the extract (EXT, 10∼40 μg/ml), 3 fractions (H, EA, B, 10∼40 μg/ml) for 24 h, and then the cells were treated t-BHP (200 μM) for 60 min. (B) HepG2 cells were pretreated with the extract (EXT, 40 μg/ml), 3 fractions (H, EA, B, 40 μg/ml) for 24 h, and then the cells were treated t-BHP (200 μM) for 0∼90 min. Quercetin (10 μM), epigallocatechin gallate (EGCG, 10 μM) was used as positive controls. The graphs were representatives from three independent experiments. Each bar represents the mean±SD from triplicate experiments. *p＜0.05, significant with respect to t-BHP treatment.
catechin gallate (10μM)을 전 처리한 것과 거의 비슷한 수 준을 보였다(Fig. 3A). 또한 t-BHP으로 생성된 라디칼을 통해서 ROS생성이 처리시간(0∼90 min)에 따라 점차 증 가하였고 시료가 지속적으로 ROS의 생성을 강력하게 감 소 하는 것을 확인하였다(Fig. 3B). 이 결과는 다래나무가 t-BHP에 의해 유도된 세포독성을 ROS의 생성을 억제함 으로써 보호하는 효과를 갖는 것을 시사한다. 또한 다래 나무 과일에서 분리된 phenolic acid 및 coumarin, flanonoid 계열의 화합물의 DPPH radical scavenging activity를 측정 했을 때 강력한 라디칼 소거효과가 보고된바 있다.9)
5. 총 glutathione (GSH) 수준 측정
Glutathione (GSH)은 세포내 비효소적인 항산화 방어분 자로 산화적 스트레스를 보호하는데 중요한 역할을 한 다. 보통 세포내에 생성, 유입되는 라디칼에 의해 GSH가 감소하게 되는데,21) 이에 대비하여 세포에 GSH을 증가 시켜 세포를 보호하는 것을 확인하였다. t-BHP를 처리한 HepG2 세포내 총 GSH 수준을 측정한 결과 현저하게 낮 은 농도를 나타내었으나, 양성 대조군인 quercetin (10μM) 과 EGCG (10μM)와 다래나무 추출물 및 분획물(10μg/
ml)을 전 처리한 군에서 총 GSH의 농도가 회복되는 것을 확인하였다(Fig. 4). 이는 다래나무 추출물이 t-BHP에 의
한 간세포의 세포독성을 ROS생성의 억제뿐만 아니라 항 산화 방어분자인 GSH의 총농도를 증가시켜 간세포의 산화적 손상을 억제하는 것으로 생각된다.
결 론
본 연구에서는 산화적 스트레스로 인해 유도되는 세 포손상을 다래나무 잎의 추출물 및 분획물의 보호효과 를 알아보기 위하여 인간 간암세포주인 HepG2 세포를 이용하여 조사하였다. 다래나무 추출물 및 분획물의 전 처리가 t-BHP 또는 AP에 의해 유도되는 세포사멸을 억 제하여 세포생존율을 증가시킴을 확인하였다. 또한 t- BHP에 의한 ROS생성 억제와 세포내 총 GSH 수준을 높 임을 확인하였다. 아울러 total polyphenolic 화합물함량 조 사를 통해 특히 butanol 분획물에 항산화 물질이 많이 함 유되어 있음을 확인하였다. 따라서 이 연구를 바탕으로 할 때 다래나무는 산화적 스트레스 및 약물독성에 의해 유발되는 간 손상에 대해 효과를 갖는 간 보호제의 후보 군이 될 수 있을 것이다.
감사의 글
본 연구는 한국과학기술연구원 강릉분원 자체연구사 업인 대관령프로그램(과제번호: 2Z03411)에 의해 연구를 수행하였음.
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