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이학 석사학위 논문
간세포암종에서
소포체스트레스에 의해 유도되는 CAP2의 역할 및 작용 기전
아 주 대 학 교 대 학 원
의 생 명 과 학 과
신 보 람
간세포암종에서
소포체 스트레스에 의해 유도되는 CAP2의 역할 및 작용 기전
지도교수 우 현 구
이 논문을 이학 석사학위 논문으로 제출함
2021년 8월
아 주 대 학 교 대 학 원
의 생 명 과 학 과
신 보 람
신보람의 이학 석사학위 논문을 인준함
심 사 위 원 장 우 현 구 인
심 사 위 원 백 은 주 인
심 사 위 원 이 수 환 인
아 주 대 학 교 대 학 원
2021년 06 월 21일
- i -
국문요약
간세포암종에서 소포체 스트레스에 의해 유도되는 CAP2의 역할 및 작용 기전
Cyclase-associated protein 2 (CAP2)는 간세포암종(Hepatocellular carcinoma)의 바이오 마커 후보 유전자이다. CAP2는 다단계의 간암 발생과정동안 차등 발현되며, 전체 생존 기간(overall survival, OS) 또는 무재발 생존 기간(recurrence-free survival, RFS)이 임상 결과에서 일관되게 상관 관계가 있다.
그러나 간세포암종 진행과정에서 CAP2의 조절이나 작용 기전은 명확히 규명되어 있지 않다. 본 연구에서는 간암세포에서 소포체 스트레스 신호에 의해 CAP2의 발현이 증가하고 그 결과, 상피 간엽 이행(Epithelial-mesenchymal transition)을 유도하는 것을 확인하였다. 소포체 스트레스의 증가는 protein kinase C epsilon (PKCε)을 통해 Activating transcription factor 2 (ATF2)를 활성화시켰고, 활성화된 ATF2는 CAP2 프로모터에 직접적으로 결합하여 CAP2의 mRNA 발현을 증가시켰다. 또한, CAP2는 Rac1 활성화를 통해 ERK를 인산화하여, 간암 세포의 상피 간엽 이행을 촉진하였다.
종합적으로, 본 연구는 간세포암종에서 소포체 스트레스가 PKCε과 ATF2의 순차적인 활성화을 통해 CAP2의 발현을 유도하고, 결과적으로 Rac1-ERK 신호의 활성화를 통해 상피 간엽 이행을 촉진하는 것을 보여주었다. 이를 통해 소포체 스트레스와 CAP2의 상관 관계와 그 기전을 밝히고, CAP2를 간세포암종 바이오마커 후보로써 가능성을 제시하고 있다*.
핵심어 : 간세포암종, 소포체 스트레스, CAP2, 상피 간엽 이행, ATF2, PKCε, Rac1, ERK
* 이 논문은 2021년 5월 5일에 국제학술지 [Molecules and Cells]로부터 개재 승인된
“ Endoplasmic reticulum stress induces CAP2 expression promoting epithelial- mesenchymal transition in liver cancer cells”논문을 수정 보완하였다.
- ii -
차 례
국문요약 ... i
차 례 ... ii
그 림 차 례 ... iv
표 차 례 ... v
사 용 약 어 ... vi
I. 서 론 ... 1
간세포암종 치료를 위한 새로운 바이오 마커의 필요성 ... 1
소포체 스트레스가 간암 발생 과정에 미치는 영향 ... 3
CAP2(Cyclase-associated protein 2)발현과 암 발생의 상관관계 ... 5
Rac1(Rac Family Small GTPase 1)과 세포 운동성 ... 6
암과 EMT(Epithelial-Mesenchymal Transition) ... 7
간세포암종 바이오 마커로서의 CAP2 ... 9
II. 실험재료 및 방법 ... 11
2.1. 세포주 배양 ... 11
2.2. 유전자 발현 벡터의 제작 및 세포주 확립 ... 11
2.3. 일시적 형질주입 및 Luciferase reporter assay ... 15
2.4. 염색질 면역침강법(chromatin immunoprecipitation assay) ... 16
2.5. 실시간 중합효소 연쇄반응 ... 18
2.6. 항체 및 그 외 시약 ... 20
2.7. 면역침강법과 Western blotting ... 21
- iii -
2.8. 공초점 현미경(Confocal microscopy) ... 22
2.9. Rac1 GTPase activity assay ... 23
2.10. 세포 증식 측정(Cell proliferation assay) ... 23
2.11. 세포의 이동성 및 침습성 측정(Cell migration/invasion assay) ... 23
2.12. 상처 치유 분석(Wound healing assay) ... 24
2.13. 통계적 분석 ... 25
III. 결 과 ... 26
3.1. CAP2 유전자 발현은 HCC 발달에 대한 예측 마커이다 ... 26
3.2. CAP2 의 발현은 간암 세포에서 이동성과 침습성에 영향을 미친다 .. 30
3.3. 소포체 스트레스는 PKCε-ATF2 신호 전달을 통해 CAP2 발현을 유도한다 ... 37
3.4. CAP2 는 ERK-Rac1 신호를 통해 간암세포의 EMT 를 조절한다 ... 47
IV. 고찰 및 결론 ... 56
V. 참고문헌 ... 61
영문요약 ... 71
- iv -
그 림 차 례
Figure 1. ER stress induces CAP2 expression ... 28
Figure 2. Expression of CAP2 in liver cancer cell lines ... 31
Figure 3. CAP2 increases migration and invasion of liver cancer cells . 33 Figure 4. The effect of CAP2 on cell migration ... 34
Figure 5. Effect of ER stress on cell invasion ability in HCC cells ... 35
Figure 6. The effect of CAP2 on cell proliferation ... 36
Figure 7. ATF2 binds to CAP2 promoter in ER stress ... 41
Figure 8. Expression of ATF2 in HCC cells ... 43
Figure 9. Effect of inhibitors of stress-activated protein kinases on CAP2 mRNA expression ... 45
Figure 10. Expression of PKCε in HCC cells ... 46
Figure 11. CAP2 induces EMT in liver cancer cells via ERK activation 50 Figure 12. CAP2-mediated EMT occurs through the Rac1-ERK signal pathway ... 52
Figure 13. Rac1 is involved in CAP2-mediated EMT ... 54
Figure 14. Schematic diagram of ER stress-CAP2-EMT signaling pathway ... 55
- v -
표 차 례
Table 1. The primers used for PCR of the cloning ... 13
Table 2. The targets of CAP2 shRNA ... 14
Table 3. The primers used for PCR of the ChIP fragments ... 17
Table 4. The sequences of primers used for qPCR ... 19
- vi -
사 용 약 어
CAP2 Cyclase-associated protein 2 HCC Hepatocellular carcinoma HGDN High grade displastic nodule
eHCC early HCC
ER Endoplasmic reticulum UPR Unfolded protein response
EMT Epithelial-mesenchymal transition PKCε Protein kinase C epsilon
ATF2 Activating transcription factor 2 Rac1 Rac Family Small GTPase 1
ERK Extracellular Signal Regulated Kinase
- 1 -
I.
서 론
간세포암종 치료를 위한 새로운 바이오 마커의 필요성
간암(Liver cancer)은 전 세계적으로 여섯 번째로 많이 진단되는 암으로, 예후가 좋지 않아 암과 관련된 사망의 세 번째 주요 원인이다 (Li et al., 2019;
Ferlay J, 2020). 간세포암종(Hepatocellular carcinoma, HCC)은 간암의 가장
주요한 유형으로 전체 환자의 약 75%를 차지하고,
담관암(cholangiocarcinoma)이 그 뒤를 이어 10-20%를 차지한다(ASCO, 2008; Li et al., 2019). 만성간질환(chronic liver disease) 또는 간경변증(liver cirrhosis)은 B형 간염과 C형 간염 바이러스, 음주, 비알코올성 지방간질환, 자가면역 간질환, 유전성 간질환 같은 다양한 요인에 의해 발생하여 간에 만성적인 염증 및 섬유화를 초래함으로써 간암 발생의 위험인자로 작용한다(Heimbach et al., 2018).
간세포암종은 진단 후 5년 생존률이 18% 이하인 악성 종양임에도 불구하고 절제 수술 외에 치료 방법이 매우 제한적이다 (Heimbach et al., 2018; Kim et al., 2019). 대부분의 만성 간질환의 마지막 단계에선 간경변(cirrhosis)이 발생한다. 따라서 간경변으로 인해 만성적으로 변화된 간 미세 환경은 원발성 간암에서 암 발달을 위해 필요한 선행요인이라 할 수 있다(Marquardt et al., 2015). 간세포암종은 간경변에서 이형성 결절(dysplastic nodule), 조기 간세포암종(early HCC, eHCC), 마지막의 진행성 간세포암종(progressed HCC, pHCC)으로 진행되는 다단계의 간암 발생 과정 (hepatocarcinogenesis)을 통해 형성되는 것이 특징이다(Nam et al., 2005; Marquardt et al., 2015; Jee et al., 2019). 다단계의 간세포암종 발생 및 발달과정에는 다양한 요인들이 관여할 수 있으며, 그 과정에서 종양내 세포 다양성과 이질성을 획득하게 된다. 이는 면역 시스템과 치료 약물에 대한
- 2 -
반응성 차이를 유발함으로써, 간세포암종의 치료에 있어 수술 외 다른 치료 방법을 어렵게 하는 주된 요인으로 작용하게 된다. 따라서, 간세포암종을 효율적으로 치료 및 진단하기 위해서는 간암의 발생과 발달을 이해하고 그 과정에 관여하는 새로운 바이오 마커의 발굴과 그 작용 기전에 대한 연구들이 요구되고 있으며, 밝혀진 핵심 바이오 마커들은 치료 및 진단에 활용될 수 있다.
- 3 -
소포체 스트레스가 간암 발생 과정에 미치는 영향
소포체(Endoplasmic Reticulum, ER)는 진핵세포의 막성소기관으로, 주로 리보솜이 붙어 있는 조면 소포체(rough ER)에서 단백질 합성, 가공, 분류 및 N-글리코실화가 일어나고, 리보솜이 없는 활면 소포체(smooth ER)에서 지질 및 스테롤의 합성이 일어난다. 낭포성 섬유증, 알츠하이머, 혈우병 등 많은 유전 질환들은 소포체에서의 단백질 접힘 이상(misfolding)이 원인이라는 보고가 있다(Thomas et al., 1995). 특히, 스트레스 조건하에서 세포의 소포체 내에는 잘못 접힌 단백질(misfolded proteins)이 축적된다. 이때, unfolded protein response(UPR)이 활성화되어 잘못 접힌 단백질의 수를 줄여 소포체 내 과부하를 최소화함으로써 세포가 생존할 수 있게 한다. 한편, 소포체는 다양한 환경 신호에 반응하여 Ca2+을 저장 또는 방출함으로써 세포 신호 전달에 관여한다(Kaufman, 1999). 따라서 소포체는 단백질 접힘(folding)과 세포내 항상성 유지에 매우 중요하다.
세포가 소포체 스트레스를 받으면 생존하기 위한 방어 기전으로서 mRNA의 전사 및 번역에 즉각적인 변화가 일어난다. 다양한 요인에 의해 활성화되는 소포체 스트레스는 항상성 회복 또는 세포사멸을 유도하는 UPR를 유발한다. 포도당 고갈, 저산소증, 화학요법 약물 등의 다양한 조건이 소포체 스트레스를 유발할 수 있으며, 이것은 결국 UPR을 활성화하여 세포의 회복을 돕는다(Dauer et al., 2019; Mao et al., 2019). 그러나 UPR은 암의 미세 환경을 조절하여 암 치료에 대한 내성을 부여하는 기전 중 하나로도 알려져 있다(Clarke et al., 2014; Yadav et al., 2014). 특히, 간세포암종의 발생 및 발달 과정 동안 소포체 스트레스 신호의 역할들이 밝혀지고 있다. 간세포암종 형성의 여러 단계에서 ATF6(activating transcription factor 6)와 XBP1s(X- box binding protein 1), Grp78(glucose-related protein, 78-kDa) 같은
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소포체 스트레스 마커 유전자들의 발현이 활성화된다(Shuda et al., 2003;
Vandewynckel et al., 2015).
ATF(activating transcription factor 또는 cAMP-dependent transcription factor) family는 스트레스에 반응하여 세포 반응을 활성화하는 전사 인자들로 알려져 있는데, 그 중 ATF2는 핵에서 세포 발달(development), 증식(proliferation), 사멸(death)과 같은 전반적인 전사 활성 외에도 DNA 손상 반응에도 기여한다. 심각한 유전 독성 스트레스에 노출되면 세포질로 이동하여 마이토콘드리아의 세포막전위를 손상시키고 마이토콘드리아 기반 세포사멸을 촉진한다. 특히 PKCε의 ε isoform에 의한 ATF2의 인산화는 ATF2의 세포 내 위치와 기능을 조절하는 중요한 스위치 역할을 한다(Lau and Ronai, 2012).
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CAP2(Cyclase-associated protein 2)발현과 암 발생의 상관관계
CAP(Cyclase-associated protein)은 효모와 포유류 사이에 보존도가 높은 단백질로, adenylyl cyclase와 G-actin(monomer)에 결합함으로써 액틴 중합(polymerization)을 매개하는 역할 및 여러 세포 과정에 관여한다(Ono, 2013; Kosmas et al., 2015). 포유류에서는 64%의 아미노산 일치를 보이는 두개의 CAPs가 존재하는데, 골격근을 제외하고 광범위하게 발현하는 CAP1과, 주로 뇌, 심장, 골격근, 고환 및 피부 같은 특정 조직에만 발현하는 CAP2가 있다(Swiston et al., 1995; Bertling et al., 2004; Ono, 2013).
세포 이동과 세포질 분열은 암세포에서 비정상적으로 조절된다. CAP은 세포 이동과 세포질 분열 모두와 관련이 있지만, 특히 이동중인 세포의 액틴이 풍부한 lamellipodia에 풍부하게 존재하는데, CAP의 knock down은 lamellipodia의 형성을 억제하고 세포의 이동속도를 감소시킨다고 보고되어 있다(Rogers et al., 2003; Bertling et al., 2004; Yamazaki et al., 2009; Ono, 2013). 그러나 이러한 과정에서 CAP이 세포의 이동을 조절하는 기전은 아직 완전히 밝혀져 있지 않다. 포유류의 CAP은 여러 유형의 암에서 과발현되어 있으며, 이는 CAP의 발현 증가와 암 발생의 상관관계를 보여주는 바이다(Ono, 2013). 그 중 CAP2는 갑상선암과 신장암, 방광암에서 매우 높게 발현되며, 특히 비종양성 조직과 비교하여 HCC 조직에서 과발현되어 있다고 보고되어 있다(Shibata et al., 2006; Sakamoto et al., 2010; Effendi et al., 2013; Fu et al., 2015). HCC에서 CAP2의 과발현은 전체 생존기간(overall survival, OS), 무병생존기간(disease free survival, DFS)과 유의미한 연관성을 보였고(Fu et al., 2015), HCC의 침습적 행동 양상(behavior)을 촉진시켰다(Effendi et al., 2013). 그러나 이러한 병리학적 역할에도 불구하고 HCC 진행과정에서 CAP2의 발현이 어떻게 조절되는지, 세포의 이동 과정에서 CAP2가 어떤 역할을 하는지에 대한 연구는 아직 미흡한 상태이다.
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Rac1(Rac Family Small GTPase 1)과 세포 운동성
Rho family의 GTPases는 Ras superfamily의 subfamily로, ~21kDa의 작은 G proteins이다. 모든 G protein들은 GAP와 GEF에 의해 비활성 GDP 결합 형태 또는 활성 GTP 결합 형태로 전환되는 “분자 스위치”로써, 그 중 Rho proteins은 세포 소기관 발달, 세포골격 역학(dynamics), 세포 이동 및 기타 일반적인 세포기능에서 역할을 한다(Boureux et al., 2007; Bustelo et al., 2007). 특히, 세포가 세포외기질(extracellular matrix)로 이동하는 침습적 성질을 가질 때 세포골격, 세포기질 접착 및 세포 외 기질구성요소의 변화를 포함하는 다단계 과정을 거치는데, 이 세포 이동 과정을 Rho family GTPases가 조절할 수 있다고 보고되어 있다(Parri and Chiarugi, 2010).
포유류에서 Rho GTPases를 구성하는 대표적인 구성은 Cdc4, Rac1, RhoA이며, 이들은 각자 actin filament에 작용하여 이동하는 세포들의 특징인 filopodia, lamellipodia (membrane ruffling), stress fibres(focal adhesion)를 조절한다. 그 중 단일 세포의 중간엽 세포 형태로의 전환은 Rac1 매개의 세포 양극화(polarization)와 lamellipodia 형성을 위한 세포의 형태 변형이 일어나고 단백질 분해 및 integrin이 결합하는 과정이 필요하다. 종양세포를 포함한 여러 움직이는 세포들은 일시적으로 Rho family GTPases 발현 및 중간엽의 특성을 보인다(Parri and Chiarugi, 2010). `
Rho family 중 Rac1은 대부분의 조직에서 보편적으로 발현되며, GEF에 의해 활성화된 Rac(Rac-GTP)은 F-actin filament를 G-actin monomers로 전환하는 역할을 하여 Lamellipodia 형성을 유도함으로써 세포 운동성을 촉진한다(Parri and Chiarugi, 2010; Bid et al., 2013; Ridley, 2015).
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암과 EMT(Epithelial-Mesenchymal Transition)
상피세포에서 중간엽 세포로의 전환, 즉 상피 간엽 이행(Epithelial- Mesenchymal Transition, EMT)은 배아 발생, 상처 치유 및 암의 악성 진행에 중요한 역할을 하는 가역적 세포 프로그램이다. 이 과정에서 EMT를 대표하는 바이오 마커들의 발현을 통해 상태를 확인할 수 있는데, EMT가 활성화 되면 E-cadherin발현이 억제되어 단층 상피세포의 전형적인 조약돌 형태가 손실되는 반면, N-cadherin, Vimentin, fibronectin 등과 같은 마커들의 발현이 증가하며 중간엽의 방추형 세포 형태를 띄게 된다(Dongre and Weinberg, 2019). 중간엽 세포로 전환되기 위한 유전자 발현의 전환은 SNAIL(inducer), ZEB(retaining), Twist(retaining) 같은 전사인자 및 복잡한 세포 내 네트워크에 의해 조절된다(Craene and Berx, 2013).
종양형성(neoplasia)과정에서 EMT는 운동성, 화학요법에 대한 내성 확산 및 증가 같은 암세포의 악성 진행에 필수적인 특성들을 부여한다(Smith and Bhowmick, 2016; Dongre and Weinberg, 2019; Lu and Kang, 2019). 전립선 암과 폐암, 간암, 췌장암 및 유방암을 포함한 다양한 암의 종양 형성에 있어 EMT의 역할이 입증되었다(Hugo et al., 2007; Dongre and Weinberg, 2019).
암에서 EMT를 유도하는 인자들로는 종양 미세환경과 기질 교란, 대사 변화, 선천/후천 면역 반응에 의한 저산소증, 사이토카인, 성장인자 등이 있다(Roche, 2018). 최근 연구에 따르면 EMT가 진행중인 세포는 항종양 면역(anti- tumor immunity)을 조절할 수 있으며, 특히 중간엽 종양 세포는 적응 면역
체계에 의한 제거에 대하여 저항력이 증가되어 있는 것으로
확인되었다(Dongre and Weinberg, 2019). 또한 여러 상피종양에서 EMT 마커의 높은 발현은 종양 성장과 전이, 재발 가능성 증가 및 생존율 저하와 관련이 있다고 보고되어 왔다(Moody et al., 2005; Satelli and Li, 2011).
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이러한 이유에서 암 세포 생물학을 이해하고 표적 치료를 위해 EMT의 특성을 이해하는 것이 중요하다.
- 9 -
간세포암종 바이오 마커로서의 CAP2
간세포 암종을 효율적으로 치료 및 진단하기 위한 바이오마커를 찾기 위해 유전자 발현 프로파일링을 진행하였고 그 결과, 고등급 이형성결절(High grade dysplastic nodule, HGDN)병변의 소포체 스트레스 관련 유전자와 조기 간세포암종(eHCC)의 종양형성 유전자(oncogenes) 사이의 중간 역할을 할 것으로 예상되는 유전자들을 확인하였다(Jee et al., 2019). 특히, cyclase associated protein(CAP) 2의 발현이 암이 발생하기 전 단계인 이형성 결절 병변에서 조기 간세포암종으로 악성 전환되는 과정에서 점차 증가하고, 비종양조직에 비해 종양조직에서 발현이 현저히 증가하는 것을 확인하였다.
이러한 결과는 기존에 보고된 연구들과 일치하며, 더 나아가 CAP2가 간암발달과정에 있어 진단 마커 또는 치료 타겟이 될 수 있다는 가능성을 보여준다(Shibata et al., 2006; Ojima et al., 2016; Jee et al., 2019). HCC에서 CAP2의 과발현은 간세포암종 환자의 나쁜 예후와 상관관계를 보일 뿐만 아니라(Fu et al., 2015), HCC의 침습성을 촉진시켰다(Effendi et al., 2013).
따라서 본 연구에서는 간세포암종이 형성 및 발달하는 과정에서 공격적인 성질을 부여할 것으로 예상되는 CAP2 발현 조절과 종양촉진 유전자로서의 역할에 집중하고자 하였다. 그 결과, HCC 발달 중 발생한 소포체 스트레스가 PKCε-ATF2 신호전달을 활성화하여CAP2의 발현을 유도한다는 것을 처음으로 보고한다.
EMT 마커의 높은 발현은 종양 성장과 전이, 재발 가능성 증가 및 생존율 저하와 관련이 있기 때문에 EMT의 특성을 이해하는 것은 매우 중요하다. 본 연구에서는 CAP2 과발현에 의한 간암세포의 이동과 침습 능력의 증가를 증명하기 위해 EMT 마커들의 발현과 이를 조절하는 세포 신호 기전을 확인하였다. 그 결과, 소포체 스트레스에 의한 CAP2의 발현이 Rac1-ERK 신호 전달 경로를 활성화하여 궁극적으로 EMT를 촉진한다는 것을 확인하였다.
- 10 -
이러한 결과는 HCC 발달에 기초가 되는 새로운 기전을 제시하며, CAP2가 잠재적인 oncodriver로써 치료 표적 후보 또는 진단 마커로 활용될 수 있음을 보여준다.
- 11 -
II.
실험재료 및 방법
2.1. 세포주 배양
본 연구에 사용된 인간 간암 세포주 SNU423(catalog number KCLB00423) 와 Huh7(catalog number KCLB60104)은 한국세포주은행(Korea)에서 분양 받았으며, 10% FBS(catalog number 12483-020, Invitrogen), 100 U/ml penicillin, 그리고 100 μg/ml streptomycin(catalog number 15140122, Invitrogen)을 넣은 DMEM (catalog number 11965084, Invitrogen)를 사용하여 배양하였다. 인간 간 세포주 THLE-2(catalog number CRL-2706)는 ATCC(USA)에서 분양 받아 성장 인자를 넣은 BEGM(catalog number CC3170, Lonza)을 사용하여 배양하였다. 모든 세포는 5% CO2가 포함된 37℃ 배양기에서 배양하였다.
2.2. 유전자 발현 벡터의 제작 및 세포주 확립
유전자 발현 벡터를 만들기 위한 CAP2 (NM_001363533.1)의 cDNA constructs를 얻기 위해 HepG2로부터 추출한 total RNA(catalog number 74104, Quiagen)를 역전사반응(catalog number RR037A, Takara)하여 CAP2 primer로 PCR(catalog number 639298, Clontech)하였다(Table 1). 증폭된 cDNA를 전기영동 한 뒤 아가로스 겔로부터 추출(catalog number 740609, Macherey-Nagel)하였고, Infusion HD cloning kit(catalog number 011614, Clontech)를 사용해 linearized pCDH-CMV-EF1-EP1- Puro(Xba1·Not1)(catalog number CD510-1, System Biosciences)에 클로닝하였다. CAP2 shRNA를 발현하는 lentiviral constructs는 Dharmacon에서 구매하였다(Table 2). Rac1-wild type (Rac1-WT,
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NM_006908.5)-HA는 (Yoon et al., 2019)에 나온 방법을 참조하여 클로닝 하였으며, Rac1-Q61L-HA 와 Rac1-N17-HA는 Rac1-WT을 주형으로 하여 site-directed mutagenesis를 통해 만들어졌다(Table 1).
유전자를 영구적으로 발현할 수 있는 세포주를 확립하기 위해 lentiviral vector들을 Lipofectamine 3000 transfection reagent(catalog number L3000015, Invitrogen)를 사용하여 293TN(System Biosciences)에 각각 형질주입 하였다. 이틀 뒤, 만들어진 렌티 바이러스를 모아 세포주로 만들고자 하는 간암 세포주를 감염시켰다. 렌티 바이러스에 감염된 간암 세포들은 일주일 동안 1μg/ml puromycin (Sigma)이 추가된 배지에서 배양하였다 (Yoon et al., 2019). 이렇게 만들어진 세포주들은 10%FBS, 100 U/ml penicillin, 100μg/ml streptomycin, 1μg/ml puromycin이 첨가된 배지에서 배양하였다.
Reporter assay를 위해 필요한 프로모터 발현 벡터들은 다음과 같이 만들어졌다. 인간 CAP2 프로모터 서열은 SNU423의 genomic DNA로부터 증폭하였다. 2.5 kb 길이의 프로모터 (-2500/+100bp) 와 잘려진 프로모터 유도체들 (-2000/+100, -1500/+100, -1000/+100, 500/-100)들은 pGL3-basic luciferase reporter vector(catalog number E1751, Promega)에 삽입 후 DNA sequencing으로 확인하였다(Table 1). 유전자의 프로모터 부분에서 전사인자 결합 부위를 추정해주는 PROMO 컴퓨터 프로그램*으로 분석한 결과, pGL3-CAP2(-2.5kb)의 ATF2가 부착할 것으로 예상되는 서열(-2185 ATGACGTTAA -2176)은 site-directed mutagenesis를 통해 변형시켰고, DNA sequencing으로 확인하였다(Table 1).
* http://alggen.lsi.upc.es/cgibin/promo_v3/promo/promoinit.cgi?dirDB=TF_8.3
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Table 1. The primers used for PCR of the cloning
Gene 5’primer 3’primer
-2,500/+100 5'- CTTACGCGTGCTAGCCCAG ACA AAGGGAAGCAAAGACT -3'
5'- TCTTACGCGTGCTAGCTA GGACCTTTGGTTTTATAGTT ATGGAAATGC -3'`
-2,000/+100
5'- TCTTACGCGTGCTAGCTGT TTATAAAATACTTTTTAAAAA TGTCATCACACGC -3'
-1,500/+100 5'- TCTTACGCGTGCTAGCGCG ACTC TCCCCTGGAGC -3'`
-1,000/+100 5'- TCTTACGCGTGCTAGCGCG CCGCCGCCC -3'
-500/+100
5'- TCTTACGCGTGCTAGCTAG GACCTTTGGTTTTATAGTTAT GGAAATGC -3'
ATF2-Mut 5'- CAATGCTTTCCTTCTAGAA CGAGAAGAGAAAAGCCTCC -3'
5'- GGAGGCTTTTCTCTTC TCGTTCTAGAAGGAAAGCA TTG -3'`
CAP2 5'- CATAGAAGATTCTAGAAT GGCCAACATGCAGGGAC -3'
5'- CAGATCCTTGCGGCCGCT TAG GCCATAATTTCTGCAGG TTCAGTG -3'
Rac1-WT 5'- CATAGAAGATTCTAGAAT GCAGGCCATCAAGTGTGT -3'
5'- CAGATCCTTGCGGCCGC TTA CAACAGCAGGCATTTT CTCTTCCT -3'`
Rac1-Q61L 5'- TGGGATACAGCTGGACTA GAAGATTATGACAG -3'`
5'`-CTGTCATAATCTTCTA GTCCAGC TGTATCCCA -3'`
Rac1-N17 5'- GAGCTGTAGGTAAAAATT GCCTACTGATCAG -3'`
5'`-CTGATCAGTAGGCAAT TTTTAC CTACAGCTC -3'
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Table 2. The targets of CAP2 shRNA
CAP2
shRNA Target site Mature Antisense
#1 3’UTR 5'- TACATCTTAGATTCTCAAAGG - 3'
#2 ORF 5'- TTGAGAAGGATAAGATTTAGG -3'`
#3 ORF 5'- TTGGGCAAATAAAGCTGAGCG -3'`
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2.3. 일시적 형질주입 및 Luciferase reporter assay
ATF2 knockdown 또는 PKCε knockdown을 위한 small interfering RNA (siRNA)는 모두 Santa Cruz Biotechnology에서 구매하였다. 100 nM의 음성 대조군 siRNA (siNeg, catalog number sc-37007), siATF2 (catalog number sc-29205) 또는 siPKCε (catalog number sc-36251)를 Lipofectamin 3000 (catalog number L3000015, Invitrogen)을 이용하여 간암세포주에 형질주입(transient transfection) 하였다. 형질주입 48시간 뒤, 다음 실험을 위해 세포를 회수하였다.
Luciferase reporter assay를 위해 6 well plates에 Huh7 세포들을 깔고 다음 날 Lipofectamin 3000 (Invitrogen)을 사용하여 형질주입 하였다.
CAP2 프로모터 영역을 조사하기 위해 세포에 pGL3-basic vector (Promega) 또는 잘리거나 변형된 CAP2 프로모터 유도체 그리고 형질주입 효율의 정규화를 위한 pTurbo-GFP plasmid (catalog number SHC003, Sigma aldrich)를 공동 형질주입(co-transfection)시켰다. 형질주입 24시간 후, 세포에 100 nM의 thapsigargin (catalog number T9033, Sigma aldrich)을 24시간동안 처리하여 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응(qRT-PCR)을 통해 luciferase의 발현을 분석하였다. 상대적인 luciferase 발현은 pGL3-basic vector control 또는 thapsigargin을 처리하지 않은 벡터 대조군과 비교하여 유도된 변화 정도를 계산하였다. 모든 luciferase 발현 데이터는 GFP mRNA으로 정규화 되었다. Luciferase reporter assay는 원 논문 제1저자가 단독으로 진행한 실험 결과를 바탕으로, 데이터 생산자의 동의를 얻어 본 학위논문에 사용되었다.
- 16 -
2.4. 염색질 면역침강법(chromatin immunoprecipitation assay)
Huh7을 150-mm dish에 12–16시간(overnight)동안 배양하여 ~70%
정도 찬 상태에서 100 nM thapsigargin (Sigma Aldrich)를 24시간 동안 처리 또는 처리하지 않았다. 그 후 formaldehyde cross-linking, 회수, 염색질 면역침강(ChIP) assay를 수행하였다. ChIP assay를 위해 SimpleChIP enzymatic Chromatin IP kit (catalog number 9003, Cell Signaling technology)을 사용하였다.
면역침강반응(Immunoprecipitation)은 ATF2에 대한 polyclonal antibody를 사용하여 수행되었다. 양성 대조군으로서 histone-bound RPL30 promoter (catalog number 7014, Cell Signaling technology)를 침전시키기 위해 Histone H3 antibody(catalog number 4620, Cell Signaling technology)를 사용하였다. 음성 대조군으로서는 normal rabbit IgG (catalog number 2729, Cell Signaling technology)를 사용하였다. 분리한 DNA는 예상되는 전사 인자 부착 부위를 타겟하는 primer를 사용하여 PCR을 통해 분석하였다(Table 3). ChIP assay는 원 논문 제1저자가 단독으로 진행한 실험 결과를 바탕으로, 데이터 생산자의 동의를 얻어 본 학위논문에 사용되었다.
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Table 3. The primers used for PCR of the ChIP fragments
Primer 5’ primer 3’ primer
ChIP-1 5'- CCTGGCATTCATTC AATAAAGAGCTTC -3'
5'`- GCATATTTG TGGCCACT -3'`
ChIP-2 5'- TGGTAGTTCCT ACGGCACCAA -3'`
5'- TGGAGAAGTCGC CTTTCCTTGC -3'`
- 18 - 2.5. 실시간 중합효소 연쇄반응
실시간 중합효소 연쇄반응(qRT-PCR)을 위해 세포를 회수 후 RNeasy kit (catalog number 74104, Qiagen, Venlo, Netherlands)를 사용하여 total RNAs를 분리하였다. PrimeScript RT kit (catalog number RR037A, Takara)를 사용하여 1μg total RNA을 cDNA로 역전사 하였다. qRT-PCR은 IQ SYBR® Green Supermixes (catalog number BR170-8882, Bio-Rad)를 사용하여 CFX96 Real Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories)으로 수행하였다. 모든 샘플에 대한 분석은 각 실험에 대해 최소 3회 실시했으며, figure의 데이터는 2-ΔΔCT±S.D. (standard deviation)의 평균 값에 대해 상대 정량(relative quantitation)법으로 나타내었다. 사용한 primer는 다음과 같다 (Table 4).
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Table 4. The sequences of primers used for qPCR
Gene 5’primer 3’primer
CAP2 5'- TTGCCCAACTT AACCAGGGA -3'`
5'- GGTGGGAGAT TGAGTTTGCC -3'`
GRP78 5'- GTGGTAGTGC AAGCTGAAGG -3'
5'- TTCAGCCAGT TGCCCATCTA -3'`
Luc 5'- AGCTGTTTCT GAGGAGCCTT -3'
5'- GATGGAACCT CTTGGCAACC -3' GFP 5'- AGAGGGTGAA
GGTGATGCAA -3'
5'- GTACATAACCT TCGGGCATGG -3' β-actin 5'- TGGCACCCA
GCACAATGAA -3'
5'- CTAAGTCATAGTC CGCCTAGAAGCA -3'
- 20 - 2.6. 항체 및 그 외 시약
면역침강, western blotting, confocal microscopy 및 GTPase activity assay 실험에 사용한 항체는 다음과 같다. Cell signaling Biotechnology (Danvers, MA, USA)사의 Anti-ERK (1:1,000, catalog number 9102), anti- phospho-ERK (T202/Y204) (1:1,000, catalog number 9101), anti-AKT (1:1,000, catalog number 9272), anti-phospho-AKT (S473) (1:1,000, catalog number 4060), anti-phospho-SAPK/JNK (T183/Y185) (1:1,000, catalog number 4668), anti-p38 (1:1,000, catalog number 9212), anti- phopho-p38 (T180/Y182) (1:1,000, catalog number 4511), anti- PKCε(1:1,000, catalog number 2683), anti-phospho-threonine (1:1,000, catalog number 9386), anti-vimentin (1:1,000, catalog number 5741), anti-E-cadherin (1:1,000, catalog number 3195), anti-ATF2 (1:1,000, catalog number 35031), anti-mouse IgG, HRP-linked antibody (1:1,000, catalog number 7076), anti-rabbit IgG, HRP-linked antibody (1:1,000, catalog number 7074), 및 Dylight594 Phalloidin (1:20, catalog number 12877), Abcam (Cambridge, UK)사의 Anti-phospho-PKCε(S729) (1:1,000, catalog number ab63387), anti-N-cadherin (1:1,000, catalog number ab76057), 및 anti-snail (1:1,000, catalog number ab180714) antibodies, Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA)사의 anti-CAP2 (1:1,000, catalog number sc-100916), anti-SAPK/JNK (1:1,000, catalog number sc-7345), 및 anti-β-actin (1:1,000, catalog number sc-47778) antibodies, 그리고 Invitrogen (Waltham, MA, USA)사의 anti-Rac1 antibody (1:1,000, catalog number PA1-091), donkey anti-mouse IgG (H+L) antibody, alexa fluor 488 (1:500, catalog number R37114), and donkey anti-rabbit IgG (H+L) antibody 및 alexa fluor 594 (1:500, catalog
- 21 - number R37119)을 사용하였다.
그 외 실험에서 처리했던 저해제 및 약물은 다음과 같다. Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)사의 SB203580 (catalog number S8307), GF109203X (catalog number G2911), thapsigargin (catalog number T9033), tunicamycin (catalog number T7765), SP600125 (catalog number S5567), 및 dithiothreitol (DTT) (catalog number D9779), MERK (Darmstadt, Germany)사의 U0126 (catalog number 662005), 그리고 TOCRIS (Minneapolis, MN, USA)사의 NSC23766 (catalog number 2161)을 사용하였다.
2.7. 면역침강법과 Western blotting
면역침강법을 위해 500µg의 단백질을 anti-ATF2 antibody (catalog number 35031, 1:100, Cell signaling technology)과 12- 16시간(overnight)동안 반응시킨 후, protein A/G agarose beads (catalog number sc-2003, Santa Cruz Biotechnology)와 1시간 동안 반응시켰다. 2X SDS sample buffer로 면역 침전물을 추출하고 beads 세척을 다섯번 진행하였다.
Western blot에 사용할 Total cell lysates를 준비하기 위해 lysis buffer [20 mM Tris-HCl [pH 8.0], 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 그리고 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride]로 4℃(on ice)에서 20분동안 세포를 용해하였다. 그 후 20분동안 원심분리(13,000rpm, 20분, 4℃)하여 상층액을 분리였다. SDS-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)에 전체
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세포 용해물의 20μg을 사용하였다. 분리된 단백질은 nitrocellulose membrane으로 electro-transfer하여 4°C에서 항체와 하루 동안 반응시켰다.
그 후, 2차 항체(anti-mouse IgG, HRP-linked antibody, catalog number 7076, 1:1,000, Cell signaling technology; anti-rabbit IgG, HRP-linked antibody, catalog number 7074, 1:1,000, Cell signaling technology)와 membranes을 1시간 동안 상온(RT)에서 반응시키고 enhanced chemi- luminescence detection kit (catalog number 34580, PIERCE, Meridian, Rockford, USA)을 사용하여 신호를 검출하였다.
2.8. 공초점 현미경(Confocal microscopy)
단백질의 공동 국소화(co-localization)를 확인하기 위해, Lab-Tek four- well glass chamber slides (catalog number C6807, NUNC, Rockford, IL, USA)에 세포를 24시간 배양시킨 후, 차가운 methanol로 5분동안 고정 및 투과화(permeabilization)시켰다. 그 후 phosphate-buffered saline (PBS)로 세척하고 1차 항체 (1:100) 와 2차 항체 (1:500)로 반응시켰다. 40X 수침 대물렌즈(water immersion objective lens) 와 argon (488 nm) and krypton (568 nm) lasers가 장착된 laser scanning confocal microscope LSM710 (Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)를 사용하여 이미지를 수집하였다.
이미지는 ZEN 2009 light edition (Carl Zeiss)으로 처리되었다. Confocal microscopy는 원 논문 제1저자가 단독으로 진행한 실험 결과를 바탕으로, 데이터 생산자의 동의를 얻어 본 학위논문에 사용되었다.
- 23 - 2.9. Rac1 GTPase activity assay
Rac1 activity는 Cell Biolabs (catalog number STA-401-1, San Diego, CA, USA)사의 kit를 사용하여 측정하였다. 간략히, 세포 용해물을 p21- activated protein kinase (PAK)의 p21-binding domain (PBD)와 결합된 agarose beads와 반응시켰다. 부착된 형태의 Rac1의 양은 anti-Rac1 antibody를 사용하여 western blot analysis로 측정하였다. Rac1 GTPase activity assay는 원 논문 제1저자가 단독으로 진행한 실험 결과를 바탕으로, 데이터 생산자의 동의를 얻어 본 학위논문에 사용되었다.
2.10. 세포 증식 측정(Cell proliferation assay)
세포 증식 능력을 측정하기 위해 세포를 96-well plates에 5x103 로 seeding하고 10% FBS가 포함된 배지에서 48시간 동안 배양하였다. 세포의 증식은 WST-1 assay (catalog number 05015944001, Roche, Gangnam-gu, Seoul. Korea)을 사용하여 측정하였다. 각 실험은 네 번 반복으로 최소 세 번 수행하였다.
2.11. 세포의 이동성 및 침습성 측정(Cell migration/invasion assay)
세포의 이동성 및 침습성 측정법은 24-well modified Boyden chamber (8-μm pore size; catalog number 3422 Coastar; Corning Life Sciences,
- 24 -
Lowell, MA)를 사용하여 수행되었다. 침습성 측정을 위해 희석한 collagen type I (catalog number A10644-01, Invitrogen)으로 transwell filter inserts를 코팅하였다. 이동성 측정을 위해 0.2 ml의 serum-free DMEM에 suspension된 1x105 개의 세포를 upper chamber (inserts)에 깔고, lower chamber에 10% FBS를 포함한 0.6 ml DMEM로 채운다. 6시간 후, inserts의 아랫면을 4% formaldehyde로 고정 및 1% crystal violet으로 염색한다.
사진은 광학현미경 (x5)을 사용하여 찍었고, 정량분석을 위해
분광분석법(spectrophotometry)을 진행하였다. Crystal violet으로 염색된 세포는 15분동안 200μl의 10% acetic acid (v/v; catalog number 414, Ducksan pure chemicals, Danwongu, Gyunggido, Korea)에 의해 용해되었다.
50µl의 추출물(3반복)을 96-well plate에 분주하고 Versamax microplate reader(Molecular Devices, USA)로 570nm에서 흡광도를 측정하였다.
2.12. 상처 치유 분석(Wound healing assay)
상처 치유 분석법을 통해 세포의 운동성을 측정하였다. 8x105를 60mm dishes에 깔고 10% FBS가 포함된 배지에서 24시간동안 배양하였다.
단일층을 형성한 세포는 200ul pipette tip을 이용하여 단일층을 긁은 후 1%
FBS가 포함된 배지에서 24시간 또는 48시간동안 배양하였다. 사진은 광학현미경(x4)을 사용하여 찍었고 긁은 부위의 폭은 양쪽 가장자리 사이의 평균거리로 측정되었다. 척도막대는 모든 사진에서 동일하게 적용되었으며, 모든 실험은 재현가능한 결과를 위해 최소 세 번 수행되었다.
- 25 - 2.13. 통계적 분석
데이터는 평균(Mean) ± 평균의 표준오차(standard error of the mean, SEM)로 제시되었다. 통계분석은 SigmaPlot 12.5 software를 사용하여 수행하였으며, 차이(differences)는 대응표본 t 검정(paired t-test)로 평가하였다. 모든 데이터는 적어도 세 번의 독립적인 실험을 통해 도출되었다.
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III.
결 과
3.1. CAP2 유전자 발현은 HCC 발달에 대한 예측 마커이다
이전 연구에서 HGDN과 eHCC의 DEGs의 유전 네트워크 분석을 실시하였으며, 이를 통해 CAP2가 HGDN에서 eHCC로 진행되는 과정에서 소포체 스트레스 관련 종양형성유전자로 확인되었고, 간암발생과정동안 단계적으로 증가하는 발현을 보여주었다 (permuted t test, P < 0.05, fold difference > 0.3)(Jee et al., 2019). 이를 검증하기 위해 HCC 환자 데이터에서 CAP2의 발현을 확인한 결과, 전암성 조직(pre-tumorous tissues) 또는 비암성 조직(non-tumor tissues)과 비교했을 때 HCC에서 mRNA발현이 확연히 증가함을 확인할 수 있었다(Shibata et al., 2006; Jee et al., 2019).
이러한 연구 결과들은 CAP2가 간암발생과정에서 잠재적인 oncodriver 역할을 할 수 있다는 것을 보여주었다. 그러나 현재까지 소포체 스트레스가 어떤 기전을 통해 CAP2를 유발시키는지, CAP2가 어떤 신호 경로의 활성화를 통해 간암 세포에 영향을 미치는지에 대한 연구는 보고되어 있지 않다. 따라서 본 연구에서는 간암세포주에서 소포체스트레스에 의해 CAP2 발현이 유도되고, 종양 형성 활성(oncogenic)을 유발하는 기전들을 밝히고자 하였다.
CAP2 발현이 소포체 스트레스와 관련이 있다는 것은 이미 보고된 바 있다(Jee et al., 2019). 이와 일관되게 SNU423과 Huh7세포에 thapsigargin, tunicamycin, 또는 dithiothreitol(DTT) 같은 소포체 스트레스 유도제를 처리하여 CAP2 mRNA발현이 증가하는 것을 확인하였다(Figure 1A, B).
동시에 소포체 스트레스에 대한 마커인 GRP78의 mRNA 발현을 확인하여 유도제에 의해 소포체 스트레스가 유발되었다는 것을 검증하였다(Figure 1C, D). 또한 소포체 스트레스 유도제가 처리된 SNU423과 Huh7 세포에서 CAP2
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mRNA뿐만 아니라 CAP2 단백질 발현이 증가된 것을 확인하였다(Figure 1E).
CAP2가 정상 간세포와 HCC세포에서 차등 발현된다는 것을 확인하기 위해 thapsigargin을 처리 또는 처리하지 않은 세포들에 대해 qPCR을 수행하였다.
소포체스트레스 유도제를 처리한 HCC 세포들에선 CAP2의 mRNA발현이 증가한 반면에 정상 간 세포주인 THLE-2는 유도제 처리에도 불구하고 CAP2의 mRNA발현이 유의미한 변화를 보여주지 않았다(Figure 1F). 이러한 결과는 간암세포에서 CAP2의 발현이 소포체 스트레스로부터 유도될 수 있다는 것을 다시 한번 보여주는 것이며, 더 나아가 소포체 스트레스에 반응하는 정상 간세포와 간암세포의 반응이 서로 다름을 추측할 수 있다. 예를 들어, 정상 간세포는 소포체 스트레스에 반응하여 세포 방어 작용인 UPR이 정상적으로 작용하여 세포 내 항상성을 조절에 성공함으로써 세포의 생존을 매개하지만, 암세포에서는 주위 미세환경과 특이적인 생물학적 반응을 가지고 있으므로 같은 소포체 스트레스 상황에 놓인다 하더라도 그에 반응하는 UPR과 그로 인한 생물학적 영향이 정상세포와는 다르게 나타나게 된다(Madden et al., 2019). 따라서, Figure 1F의 결과는 정상 간세포와 간암세포가 소포체 스트레스에 대해 다른 생물학적 반응을 보인다는 것을 시사하고 있다.
- 28 -
Figure 1. ER stress induces CAP2 expression. (A)SNU423, (B)Huh7 cells are treated with/without thapsigargin (50 nM and 100 nM, respectively), tunicamycin (50 ng/ml), or DTT(1 mM) for 24 h. Expression of CAP2 mRNA was measured by qRT-PCR and normalized to β-actin mRNA. Data represent mean ± SEM of 4 independent experiments. (C)SNU423, (D) Huh7 cells were treated with or without thapsigargin (50 nM and 100 nM,
- 29 -
respectively), tunicamycin (50 ng/ml), DTT (1 mM) for 24 h. The GRP78 mRNA expression levels were measured by qRT-PCR. Values were means
±SEM of three independent experiments. (E) SNU423 and Huh7 cells were treated thapsigargin (50 nM or 100 nM, respectively) for indicated times.
Cell lysates were examined by western blotting with the indicated antibodies. * is indicated CAP2. (F) Normal liver cell (THLE-2) and HCC cells (SNU423 and Huh7) were treated with or without thapsigargin (10 nM for THLE-2, 50 nM for SNU423, and 100 nM for Huh7, respectively) for 24 h. The CAP2 mRNA expression levels were measured by qRT-PCR.
Values were means ±SEM of three independent experiments. *p<0.05,
**p<0.01, and ***p<0.001.
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3.2. CAP2의 발현은 간암 세포에서 이동성과 침습성에 영향을 미친다
CAP2는 eHCC 및 pHCC에서 모두 과발현되어 있다고 보고되어 있다(Chuma et al., 2003; Shibata et al., 2006; Jee et al., 2019; Ueno et al., 2020). 본 연구에서는 간암세포주에서 CAP2의 소포체 스트레스 관련 종양 형성 특성을 조사하였다. CAP2가 간암세포에 미치는 영향을 확인하기 위해 CAP2 과발현 또는 knock down 세포주를 제작하여 실험에 활용하였다(Figure 2). 그 결과, 흥미롭게도 CAP2 과발현 간암세포주들의 이동 및 침습 능력이 대조군 간암세포주(control vector)에 비해 현저하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다(Figure 3A, B). 대조적으로 CAP2 발현이 감소된 knock down 간암세포주에선 대조군(non-targeting)에 비해 이동성과 침습성이 상당히 감소하였다(Figure 3C, D). 이러한 CAP2 과발현에 의해 상향된 전이 능력은 wound healing assay를 통해서 다시한번 재현되었다(Figure 4). 또한 앞서 보여주었던 소포체 스트레스에 의한 CAP2의 유도와 이 과정에서 얻게 되는 간암세포의 침습적 특성을 다시 한번 확인하기 위해 CAP2 과발현 또는 knock down 한 세포에 thapsigargin을 처리하여 invasion assay를 진행하였고, 그 결과 CAP2를 knock down 한 HCC세포는 소포체 스트레스 유도 물질을 처리해도 침습성에 큰 차이를 보이지 않았으나 vector 또는 CAP2를 과발현 한 세포에서는 소포체 스트레스에 의해 더욱 침습적인 성질을 보였다(Figure 5). 이러한 결과는 소포체 스트레스에 의한 침습성에 CAP2가 관여하고 있음을 의미한다. 반면에 CAP2 과발현 또는 knock down은 간암세포의 증식에는 일관성 있는 영향을 미치지 않는 다는 것을 확인하였다(Figure 6). 상기 연구 결과들을 정리하자면, 소포체 스트레스에 의해 유도된 CAP2의 발현 증가가 이동과 침입을 촉진시킴으로써 HCC에 공격적인(aggressive) 특성을 부여할 수 있다는 것을 시사한다.
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Figure 2. Expression of CAP2 in liver cancer cell lines. (A) SNU423 and Huh7 cells stably expressing empty vector (Vec), or CAP2 (CAP2) were western blotted with anti-CAP2 (53kDa) and anti-β-actin (42kDa) antibodies. * is indicated CAP2. (B) SNU423 or Huh7 cells stably expressing non-targeting (NT) shRNA or CAP2 shRNA were established.
qRT-PCR for CAP2 was performed. Values were means ±SEM of three independent experiments. *p<0.05, **p<0.01, and ***p<0.001.
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Figure 3. CAP2 increases migration and invasion of liver cancer cells. (A) and (C) Migration and (B) and (D) invasion were measured in transwell migration/invasion assays. Migrated/invaded cells were fixed with 10%
formaldehyde and stained with 1% crystal violet. Images were captured under a light microscope (magnification, ×5). Bar, 500 μm. The data are presented as mean ± SEM for triplicate determinations. *p<0.05, **p<0.01, and ***p<0.001.
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Figure 4. The effect of CAP2 on cell migration. (A and B) Motility of cells was measured by wound healing assay. 8 Χ 105 cells of SNU423 (A) or Huh7 (B) were cultured into 60 mm dishes until forming a monolayer. The cells were scratched with 200 μl tip and changed media containing 1% FBS.
Wound area was captured (magnification, x4) from 0 hr to indicated time.
The wound width was measured average distance between edges of the gap and all experiments were performed at least three times for reproducible results.
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Figure 5. Effect of ER stress on cell invasion ability in HCC cells. (A) SNU423 and (B) Huh7 cells were treated with or without thapsigargin (50 nM for SNU423 and 100 nM for Huh7 cells) for 24 h. Invasion was measured in transwell invasion assay. Invaded cells were fixed with 10%
formaldehyde and stained with 1% crystal violet. Images were captured under a light microscope (magnification, ×50). The data are presented as mean ± SEM for triplicate determinations.
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Figure 6. The effect of CAP2 on cell proliferation. Indicated cells (5 Χ 103) were split into 96-well plates and incubated in media containing 10% FBS for 48 h. Cell proliferation was measured by WST-1 assay. Values were means ±SEM of three independent experiments.
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3.3. 소포체 스트레스는 PKCε-ATF2 신호 전달을 통해 CAP2 발현을 유도한다
앞선 실험들을 통해 CAP2가 소포체 스트레스에 의해 유도된다는 기존의 보고를 검증하였으며, 이러한 소포체스트레스에 의한 CAP2의 전사 조절 과정에 관여하는 분자 메커니즘을 조사하기 위해 SNU423의 genomic DNA를 주형(template)으로 사용하여 CAP2 유전자의 5’-flanking region을 PCR 및 cloning하였다. 5’-flanking region의 서열은 전사 시작 부위로 추정되는 -2.5kb부터 +100bp를 포함한다. 이 부위가 소포체 스트레스에 반응하여 CAP2의 전사를 유도하는 프로모터 활성을 가진 부분 인지 확인하기 위해, luciferase reporter 유전자를 가진 pGL2-basic vector의 5’-end에 CAP2 유전자의 5’-flanking region을 serial deletion한 형태를 부착한 구조체를 합성하였다(Figure 7A). 합성한 reporter 구조체를 Huh7 세포에 일시적 형질주입 후 100nM의 thapsigargin을 처리하였다. -2.5kb에서 +100bp 부분을 온전히 포함하는 구조체는 소포체 스트레스를 받았을 때 가장 높은 프로모터 활성을 보인 반면, 5’ region이 500bp 이상 제거되면 프로모터 활성은 소포체 스트레스를 받기 전 수준으로 떨어졌다(Figure 7B). 이러한 결과는 -2.5kb ~ -2.0kb 영역 사이에 소포체 스트레스에 대한 CAP2 발현을 유도하기 위한 cis-regulatory elements(CRE)를 가진 결합 부위를 포함하고 있음을 시사하고 있다. PROMO software를 이용하여 -2.5kb ~ -2.0kb 영역 사이에 전사 인자가 부착할 수 있는 부위의 유무를 분석한 결과, ATF2(activating transcription factor 2)가 결합할 것으로 추정되는 서열의 존재를 예측하였다. CAP2의 전사를 유도하는데 ATF2의 기능적 중요성을 밝히기 위해 CAP2 프로모터의 -2.5kb에서 -2.0kb에 이르는 영역 내 ATF2가 부착할 것으로 예상되는 부위를 변형시키기 위해 site-directed mutagenesis를 수행하였다(Figure 7A). ATF2 결합 부위의 돌연변이는 소포체 스트레스 자극에도 프로모터 활성을 감소시켰다(Figure 7C). in
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vivo에서 ATF2가 이 CAP2 프로모터 영역 내에 결합하는 것을 확인하기 위해 thapsigargin을 처리 또는 처리하지 않은 Huh7세포에서 chromatin immunoprecipitation (ChIP)를 수행하였다. 면역 침강된 염색질은 CAP2 프로모터 특이적 primer를 이용하여 PCR하여 증폭하였다(ChIP-1 primer와 ChIP-2 primer, Table 3). 그 결과, thapsigargin 처리 후 ATF2가 CAP2의 프로모터 부위에 결합하고 있음을 확인한 반면(ChIP-1). 음성 대조군으로는 CAP2 유전자의 ATF2 부착 부위로부터 -2.5kb downstream에 결합하는 ChIP-2 primer를 이용한 PCR을 수행하였을 때, 예상대로 면역 침강된 시료로부터 어떠한 신호도 보이지 않았다(Figure 7D). 이러한 결과는 소포체 스트레스 자극에 의해 활성화된 전사인자 ATF2가 CAP2 프로모터에 결합하여 복합체를 형성함으로써 CAP2의 전사 발현을 조절할 수 있음을 의미하는 것이다. 이를 검증하기 위해 ATF2를 knockdown 시킨 간암세포에 thapsigargin을 처리한 결과, CAP2의 mRNA발현 및 단백질 발현이 감소되었다(Figure 8A-C). 상기 결과들을 종합하면, CAP2 전사 유도를 위해 ATF2의 활성화가 필요하다는 것을 시사한다.
ATF2는 다양한 자극에 반응하여 ERK1, JNK, p38, protein kinase epsilon(PKC)같은 스트레스 활성 단백질 인산화 효소에 의해 즉각적으로 인산화된다(Yamasaki et al., 2009; Lau and Ronai, 2012). 또한 전사인자인 ATF2는 암종에 따라서 종양 억제 활성 또는 종양 유발 활성을 유도 할 수 있다고 알려져 있다(Lau and Ronai, 2012). 이에 관련하여 소포체 스트레스가 유발된 간암 세포에서 ATF2 활성화에 관여하는 단백질 인산화 효소가 무엇인지 확인하고자 하였다. 이를 위해 SNU423과 Huh7 세포에 thapsigargin을 처리하였고, western blot 분석을 통해 활성화된 단백질 인산화 효소를 조사하였다. 그 결과, Figure 9A 와 같이 thapsigargin 처리된 세포에서 ERK, JNK, p38, PKC의 활성 형태(phospho form)가 검출되었다.
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검출된 인산화 효소 중 ATF2–CAP2 전사에 관련하여 소포체 스트레스에 의해 활성화되는 단백질 인산화 효소를 좀 더 특정하기 위해 스트레스에 의해 활성화되는 단백질 인산화 효소의 억제제를 처리하였다. 흥미롭게도, 소포체
스트레스에 의해 증가되었던 CAP2 mRNA 발현은 PKC
억제제(GF109203X)의 단독 처리만으로도 감소되었으나(Figure 9B), ERK1 (U0126, 20mM)이나 JNK (SP600125, 25mM), p38 (SB203580, 10mM) 억제제들을 단독으로 처리했을 경우에는 유의미한 발현 변화를 보이지 않았다(Figure 9C). 특히 JNK 억제제는 오히려 Huh7과 SNU423에서 공통적으로 CAP2의 발현을 증가시키는 효과를 보여주었는데, 이것은 JNK 억제제의 부작용에 대해 고려하지 못한 결과이다. SP600125는 JNK의 인산화를 억제하는 효과도 가지고 있지만 동시에 ATF2를 인산화 시킬 수 있는 p38을 인산화 시키는 효과도 가지고 있음을 확인하였다. 따라서 drug을 처리할 때에는, drug의 효과가 어떠한 작용에 의한 것인지, target-specific한 약물인지, 부작용은 무엇인지 확인하는 것이 필수적이다. 또한 drug은 target effect 외에 다른 효과를 보일 수 있다는 단점을 가지고 있어 target 억제 실험에 있어서 specific한 targeting이 가능한 siRNA를 가지고 검증하는 것이 더욱 좋은 방법이다. 이 경우엔 drug을 처리 후 ATF2의 인산화가 실제로 억제되었는지 검증하는 과정을 거치지 않은 것이 큰 오류로 작용하였다.
따라서 drug을 사용할 경우 target이 원하는 방향으로 억제 또는 유도되었는지 확인하는 과정이 필요하다는 것을 보여준다.
억제제 처리를 통해 얻은 결과를 검증하기 위해 siPKC을 형질 주입시켜 PKC을 knock down 시킨 결과, 앞서 보여준 데이터와 동일하게 thapsigargin에 의한 CAP2의 mRNA발현이 억제되는 것을 확인하였다(Figure 10A, B). 소포체 스트레스에 의해 활성화된 PKC이 ATF2의 인산화를 조절하여 CAP2 발현을 유도한다는 가설을 입증하기 위해 ATF2
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활성화(pATF2)가 PKC의 활성화를 통해 유도되었는지 여부를 조사했다.
예상대로, siPKC 처리는 thapsigargin 처리된 간암세포에서 ATF2의 활성화를 유의하게 억제하였다(Figure 10C). 이러한 결과는 소포체 스트레스를 받은 간암세포에서 CAP2의 전사를 조절하는데 있어 활성화된 PKC이 조절하는 ATF2의 활성화가 중요한 역할을 한다는 것을 보여준다.
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Figure 7. ATF2 binds to CAP2 promoter in ER stress. (A) Schematic representation of the CAP2 luciferase reporters. ChIP primer sets were also shown. (B and C) Huh7 cells were transiently co-transfected with pTurbo-GFP and deleted constructs (B) or ATF2 binding site mutated construct (ATF2-Mut) (C) of the CAP2 promoter. After treatment with 100 nM thapsigargin for 24 h, total RNA was extracted. Luciferase expression was monitored by qRT-PCR; all luciferase expression data were normalized to that of GFP mRNA (right). Data represent mean ± SEM of 3 independent experiments. (D) Cross-linked chromatin
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preparation from control and thapsigargin (100 nM, 24 h) treated cells were immunoprecipitated with anti-ATF2, anti-Histone H3 (H3), or normal rabbit IgG (IgG) antibodies. The ATF2 binding sites on the immunoprecipitated DNA was determined by RT-PCR using the primers.
Amplification of input chromatin (input) prior to immunoprecipitation were served as controls for chromatin extraction and PCR amplification.
Chromatin immunoprecipitation using a Histone H3 antibody served as a positive control (P.C) and a non-specific antibody (normal rabbit IgG) served as a negative control (N.C).
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Figure 8. Expression of ATF2 in HCC cells. (A) Huh7 cells were transient transfected with 100 nM siNegative control (siNeg) or siATF2. After 48 h post-transfection, the cells were harvested. The ATF2 mRNA expression levels were measured by qRT-PCR. Values were means ±SEM of three independent experiments. *p<0.05, **p<0.01, and ***p<0.001. (B and C) Huh7 cells were transiently transfected with siNegative control (siNeg) or siATF2 and after 24 h, thapsigargin (100 nM) was treated for 24 h. CAP2 expression was monitored by qRT-PCR (B) and western blotting. * is indicated CAP2 (C). Data represent mean ± SEM of 3 independent experiments. *p<0.05, **p<0.01, and ***p<0.001.
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Figure 9. Effect of inhibitors of stress-activated protein kinases on CAP2 mRNA expression. (A) SNU423 and Huh7 cells were treated with thapsigargin (50 nM and 100 nM, respectively) for the indicated times and cell lysates were examined by western blotting with the indicated antibodies. (B) SNU423 and Huh7 cells were treated with thapsigargin (50 nM and 100 nM, respectively) alone or with thapsigargin plus the PKCε inhibitor GF109203X (GF, 20 mM) for 24 h. Relative expression of CAP2 mRNA was measured by qRT-PCR. Data represent mean ± SEM of 3 independent experiments. (C) SNU423 and Huh7 cells were treated with thapsigargin (50 nM and 100 nM, respectively) alone, or with of ERK1 inhibitor (U0126, 20 μM), JNK inhibitor (SP600125, 25 μM), p38 inhibitor (SB203580, 10 μM), or PKCε inhibitor GF109203X (GF, 20 μ M) for 24 h. Relative mRNA expression levels of CAP2 were measured by qRT-PCR. Values were means ±SEM of three independent experiments.
*p<0.05, **p<0.01, and ***p<0.001.
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Figure 10. Expression of PKCε in HCC cells. SUN423 and Huh7 cells were transfected with 100 nM siNegative contol (siNeg) or siPKCε. After 48 h post-transfection, the cells were harvested. The PKCε mRNA levels were measured by qRT-PCR. Values were means ±SEM of three independent experiments. *p<0.05, **p<0.01, and ***p<0.001. (B and C) SNU423 and Huh7 cells were transiently transfected with siNegative control (siNeg) or siPKCε and after 24 h, thapsigargin (100 nM) was treated for 24 h. CAP2 expression was measured by qRT-PCR. Data represent mean ± SEM of 3 independent experiments (B). ATF2 activation was monitored by western blotting with the indicated antibodies (C). *p<0.05, **p<0.01, and
***p<0.001.
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3.4. CAP2는 ERK-Rac1 신호를 통해 간암세포의 EMT를 조절한다
Figure 3, 4에서 보여준 것처럼, CAP2의 과발현은 간암세포의 이동성과 침습성을 증가시켰다. 이동성과 침습성의 증가는 상피세포로부터 중간엽 세포로 전환되는 EMT의 특징이다. E-cadherin 과 cytokeratin의 감소, 그리고 vimentin, N-cadherin, twist, snail, slug의 발현 증가와 같은 바이오 마커의 식별을 통해 EMT를 확인할 수 있다(Zeisberg and Neilson, 2009;
Dongre and Weinberg, 2019; Ahmed et al., 2020). 이를 바탕으로 CAP2 과발현 간암 세포에서 E-cadherin, vimentin, N-cadherin, snail의 발현을 통해 EMT 여부를 확인하고자 하였다. 그 결과, CAP2 과발현 간암세포주에서 vimentin, N-cadherin, snail의 발현은 높게 나타나고 E-cadherin은 낮은 발현을 보이는 것을 확인할 수 있다(Figure 11A). 또한 EMT와 관련된 CAP2의 하위 신호 경로를 조사하기 위해 CAP2 과발현 세포에서 활성화되어 있는 신호를 스크리닝하여 ERK 활성형태(pERK)의 발현이 크게 증가한 것을 확인하였다(Figure 11B). ERK 억제제(U0126, 20μM)는 CAP2 과발현 세포에서 증가한 vimentin, N-cadherin, snail의 발현을 억제하였다(Figure 11C). 이러한 연구 결과는 간암세포에서 CAP2에 의한 EMT가 ERK 신호의 활성화에 의해 조절될 수 있음을 시사한다.
CAP2는 액틴 역학(dynamics)에 주요 역할을 하는 보존도가 높은 단백질이다(Ono, 2013; Kosmas et al., 2015). 본 연구에서는 CAP2 과발현 세포의 lamellipodia와 ruffles에서 CAP2가 발현하고 있는 것을 발견하였다(Figure 12A, 흰색 화살표). Lamellipodia와 ruffles은 활발하게 이동하는 세포의 특징으로, Rac1에 의해 조절된다(Parri and Chiarugi, 2010;
Bid et al., 2013; Ridley, 2015). 또한 Rac1은 p21-activated kinase (PAK)- cofilin 신호 경로를 통해 F-actin filaments를 G-actin monomers로
