대한비과학회

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마우스에서 반복적인 오존노출에 의한 Th-2 면역반응의 유발

연변대학교 의과대학 이비인후과학교실,

충남대학교 의과대학 이비인후과학교실

김영덕¹·박영규²·김용민²·박석원²·나기상²·박찬일²

Repeated Ozone Exposure Induces Th2 Immune Responses in Mice

Yong-De Jin, M.D.

, Young-Kyu Park, M.D.

, Yong-Min Kim, M.D.

, Seok-Won Park, M.D.

, Ki-Sang Rha, M.D.

and Chan-Il Park, M.D.

1Department of Otolaryngology, College of Medicine, Yanbian University, Yanji, China,

2Department of Otolaryngology, College of Medicine, Chungnam National University, Daejeon, Korea

ABSTRACT

Backgrounds and Objectives：It has been reported that ozone exposure exacerbate allergic rhinitis symptoms and may contribute to increase allergic rhinitis prevalence. However, a causal relationship still remained unsolved. The purpose of this study is to investigate whether prolonged exposure to ozone induce Th2 immune response without allergen. Materials and Methods：Fourteen BALB/c mice were divided into two groups：control group and ozone exposure group. Mice were exposed to 0.3 ppm of ozone for 4 hours a day, 3 times per week, for 4 weeks. At 24 hour after the last ozone exposure, nasal lavage fluid (NLF) was obtained to measure the levels of cytokine IL-4, IL-5, and IFN-γ. After lavage fluid was obtained, blood was obtained via inferior vena cava to measure the amount of total IgE and IgG1. The concentration of cytokines and immu- noglobulins was measured using the ELISA method. In addition, Luna staining was performed to identify eosinophils infiltrated in nasal mucosa. Results：The levels of IL-4 and IL-5 in NLF were significantly increased in ozone exposure group compared with control group. But the level of IFN-γ in NLF shows no significant difference between two groups. Serum total IgE and IgG1 were significantly increased in ozone exposure group compared with control group. On histologic examination, number of eosinophils infiltrating nasal mucosa was significantly increased in ozone exposure group. Conclusion：These results suggest that repeated ozone exposure induces Th2 response in the nasal mucosa of mice.

KEY WORDS：Ozone·Th2 response·Immunoglobulin·Cytokine·Mouse.

서 론

알레르기 질환의 발생에 유전적인 요인이 중요하게 작용 하나 최근 알레르기 질환의 유병률이 증가하는데에는 대기 오염 등의 환경적인 요인도 중요한 역할을 할 것으로 생각 되고 있다.

실제로 교통이 혼잡한 거리에 사는 사람들에 게서 천식이 더 잘 발생하며, 천식의 발작은 오존, 이산화 질소, 미세분진 등의 대기오염물질의 농도와 연관성을 보 인다.

대표적인 대기오염물질 중의 하나인 오존은 광화학적 스

모그의 주된 성분을 이루는 자극적인 산화기체로, 기도 점 막의 상피를 손상시키고 염증반응을 초래하는것으로 알려져 있다. 정상인이 0.5 ppm의 오존에 노출하였을 때 비세정액 에서 호중구가 증가되고

호흡 상피의 투과성이 증가된다.

또한 오존은 T 림프구의 면역반응을 알레르기 반응 시 증 가되는 Th2 반응으로 이동시킨다고 알려져 있다. Biagini 등

은 platinum에 감작된 원숭이를 오존에 노출하였을 때 platinum에 대한 피부반응이 증가하고 metacholine에 대한 기도반응이 증가된다고 보고하였으며, Neuhaus-Steinmetz 등

은 BALB/c 마우스를 난알부민과 오존에 노출하였을 때 난알부민 단독노출군보다 기관지 폐포 세정액에서 IL-4, IL-5 및 호산구가 증가하였고, 혈청 내 항원 특이 IgE가 증 가된다고 보고하여 오존이 항원에 대한 알레르기 반응을 유 발하거나 증강시킬 수 있음을 시사하고 있다.

그러나 하부 기도에서와 마찬가지로 비점막에서도 오존

교신저자：나기상, 301-721 대전광역시 중구 대사동 640 충남대학교병원 의과대학 이비인후과학교실

전화：(042) 220-7698・전송：(042) 253-4059 E-mail：[email protected]

노출에 의해 Th2 면역반응이 증강되는지, 그리고 항원노출 없이 오존단독 노출만으로도 Th2 반응이 유발되는지는 아직 잘 알려져 있지 않다.

본 연구는 오존노출에 의해 비점막에서도 Th2 반응이 유 발되는지를 확인하고자 마우스를 4주간 오존에 반복적으로 노출한 후 비세정액을 채취하여 Th2 관련 cytokine인 IL- 4와 IL-5, 그리고 Th1 관련 cytokine인 IFN-γ를 측정하 였고, 비점막에 침윤된 호산구의 수를 측정하였다. 또한 혈 액을 채취하여 혈청 IgE와 IgG

을 측정하여 비교하였다.

대상과 방법

실험 동물

무균상태로 사육된 18~22 g의 6주령 BALB/c 마우스 14 마리를 사용하였다. 실험 1주일 전부터 온도 20~23도, 습도 45~70%의 실험실에서 사육하여 실험실 환경에 적응하도 록 하였으며, 이 기간 내에 상기도 감염의 증상이나 다른 질 환이 관찰되는 마우스는 실험에서 제외하였다. 실험동물은 대조군과 오존노출군으로 나누어 각 군마다 7마리씩 배정 하였다.

오존 폭로

오존 폭로상자는 전신흡입상자(whole-body inhalation chamber)의 형태로 30×20×17 cm의 크기로 제작하였다.

오존발생기로는 SMO-200 ozone generator(삼성 매직 오존, Korea)를 사용하였다. 발생된 오존은 10 L/min의 의료용 공 기와 섞여 상자내로 유입되도록 하였다.

Porta-sens model B16-14(Analytical Technology, Oaks, PA) 오존측정기를 사용하여 상자내의 오존농도를 측정하였 다. 오존의 유입량을 조절하여 농도를 0.3 ppm으로 맞춘 다 음 폭로시간 내내 일정한 농도가 유지되는지 감시하였다. 그 리고 배출구로 나오는 오존은 활성탄을 통하도록 하여 정화 한 다음 배출되도록 하였다.

오존노출군은 0.3 ppm의 오존에 하루 4시간씩 일주일에 3차례, 4주간 노출하였고, 대조군은 같은 시간에 의료용 공 기를 흡입하도록 하였다.

비세정액과 혈액의 채취

마지막 오존 폭로 24시간 후 비세정액을 채취하였다. 케타 민 (250 mg/kg)을 복강 내로 주입하여 마취한 다음 머리를 신전하여 전비공이 가장 낮게 위치하도록 하였다. 기관절개 를 하고 기관절개 창을 통해 cut-down tube를 삽입하여 관 의 끝을 후비공에 위치한 다음 0.1 M PBS 용액 1 mL를 5분

이상에 걸쳐 점적한 후 전비공으로 흘러나오는 비세정액을 받았다. 비세정액은 평균 0.9 mL가 회수되었다. 세정액을 원 심분리(100 g, 5분)한 다음 cytokine을 측정하기 위하여 상 청액 0.5 mL을 채취하여 측정 전까지 -70℃에서 냉동보관 하였다.

비세정액을 채취한 다음 개복하여 하대정맥을 노출시킨 후 26 G 1 cc 주사기를 이용하여 혈액을 채취하였다. 평균 채취 량은 0.5 mL이었다. 채취 후 4℃에서 2~4시간 동안 보관 한 다음 원심분리(1200 g, 15분)를 시행하였다. 혈액내의 총 IgE와 IgG

의 양을 측정하기 위하여 혈장 성분만을 분리한 후 측정 전까지 -70℃에서 냉동보관 하였다.

비세정액에서 ELISA를 이용한 cytokine의 측정

96-well ELISA plate에 0.1 mL carbonate coating buffer 로 희석한 rat anti-mouse IL-4 antibody, rat anti-mouse IL-5 antibody 혹은 rat anti-mouse INF-γ antibody(BD Biosciences, San Diego, CA) 용액을 넣은 후 4℃에서 하룻 밤 동안 배양하였다. 완충액(0.1% Tween 20/PBS, pH7.2) 으로 3회 반복하여 세척한 다음 비특이적인 반응을 억제하 기 위하여 Assay Diluent(10% FBS/PBS, pH7.0)(BD Bios- ciences, San Diego, CA)를 넣고 실온에서 1시간 동안 배양 하였다. 다시 완충액으로 3회 세척한 다음 cytokine에 대 한 표준용액(BD Biosciences, San Diego, CA)이나 비세정액 을 넣은 후 2시간 동안 실온에서 배양하였다. 다시 완충액 으로 5회 세척하고 이차항체와 avidin-HRP가 혼합된 용액 을 넣은 후 1시간 동안 실온에서 배양하였다. 다시 7회 세척 하고 기질 용액을 넣은 다음 어두운 곳에 30분 동안 보관 하였고, 그 후 중지용액(2N H

SO

)을 이용하여 반응을 정 지시키고 microplate spectrophotometer(SPECTRA MAX Plus, Molecular Devicies, Sunnyvale, CA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

혈청 내 면역글로불린의 측정

혈청 내의 IgE, IgG

의 농도도 ELISA를 이용하여 위와 유사한 방법으로 측정하였다. 항체로는 rat anti-mouse IgE antibody 혹은 rat anti-mouse IgG

antibody(BD Biosci- ences, San Diego, CA)를 이용하였으며, IgE를 측정하기 위 하여 혈장을 1：100으로 희석하고, IgG

을 측정하기 위하여 혈장을 1：2000으로 희석하였다.

비점막에 침윤된 호산구의 측정

마우스의 머리를 몸통에서 절단한 후 비강을 둘러싸고 있

는 골을 포함한 조직을 채취하였다. 하악, 피부와 근육을

제거한 다음 4% paraformaldehyde 용액에 24시간 동안 고정하고 0.25 M ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA) 용액에 넣어 1주간 탈회하였다. 상절치 바로 뒤에서부터 경 구개의 절치유두(insicive papilla)의 약 2 mm 전방부위까 지 절단하여 블록을 만들고 파라핀 포매 후 5 μm의 두께로 절편을 만들었다. 호산구를 관찰하기 위하여 Luna 염색을 하 였고, video micrometer(VM-30, Olympus, Tokyo, Japan) 를 이용하여 maxilloturbinate의 내측 점막에 침윤된 호산 구의 수를 측정하였다. 결과는 10

μm

당 호산구의 수로 표 현하였다.

자료 분석 및 통계처리 방법

각 군 사이에 유의한 차이가 있는지를 알아보기 위하여 SPSS version 10.0의 분산 분석(independent T-test)를 이용 하였고, 유의수준은 p<0.05로 하였다.

결 과

비세정액 내의 cytokine

비세정액 내의 IL-4의 양은 오존노출군에서는 14.33±

12.54 pg/mL, 대조군에서는 1.83±1.71 pg/mL로 오존노출 군에서 대조군 보다 통계적으로 유의하게 증가되었다. IL-5의 양은 오존노출군에서는 19.81±13.41 pg/mL, 대조군에서는 6.12±2.26 pg/mL로 오존노출군에서 대조군보다 통계적으로 유의하게 증가되었다. 그러나 IFN-γ의 양은 오존노출군에서 는 60.57±16.01 pg/mL, 대조군에서는 47.52±12.29 pg/mL 로 오존노출군과 대조군 간에 통계적으로 유의한 차이는 없었 다(p=0.257)(Fig. 1).

혈청 내의 면역글로불린

혈청 내의 IgE의 양은 오존노출군에서는 2.71±0.79 μg/mL, 대조군에서는 1.33±0.29 μg/mL로 오존노출군에서 대조군

Fig. 2. Total serum IgE and IgG1 con- centrations in serum. *：p<0.05.

Control Ozone

000 010 020 030 040 050 060 070 080 090 100 110 120 130 140 150

Total IgG1 in serum (ug/mL)

*

Control Ozone

00 01 02 03 04 05

Total IgE in serum (ug/mL)

*

A A A

A B B B B

Total IgE Total IgG1

Control Ozone Control Ozone Control Ozone 0

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Cytokine in nasal lavage fluid (pg/mL)

*

*

IL-4 IFL-γ IL-5

Fig. 1. Cytokine contents in nasal lavage fluid. *：p<0.05.

Control Ozone

0 10 20 30 40 50 60

Number of eosinophils in nasal mucosa /10⁴ μm²*

Fig. 3. Number of eosinophils in nasal mucosa of mice. *：p<

0.05.

보다 통계적으로 유의하게 증가되었으며, IgG

의 양도 오존 노출군에서는 87.18±4.78 μg/mL, 대조군에서는 57.14±

12.22 μg/mL로 오존노출군이 대조군보다 통계적으로 유의 하게 증가되었다(Fig. 2).

비점막 내의 호산구의 수

비점막 내의 호산구의 수는 오존노출군에서는 31.75±

15.42/10

μm

, 대조군에서는 0.6±0.24/10

μm

로 오존노출 군에서 대조군보다 통계적으로 유의하게 증가되어 있었다 (Fig. 3, 4).

고 찰

최근 알레르기 비염이나 기관지 천식 등 알레르기 질환의 유병률이 전세계적으로 급속하게 증가되고 있다. 이러한 현상 을 유전적인 감수성 만으로는 설명하기 어려우며, 최근 생활 습관이나 환경의 변화, 대기 오염 물질 증가 등이 유병율의 증가원인으로 생각되고 있다.

그러나 대기 오염 물질이 알레르기 질환에 미치는 영향은 서로 다르다. NO

나 SO

의 경우 이들 단독으로는 알레르기 반응을 유발하지 않으나, 이 두 가지 성분이 함께 흡입될 경 우에는 다른 알레르기 항원에 대한 민감도가 증가한다고 알 려져 있다.

또한 디젤연소분자(Diesel exhaust particles, DEP)는 항원을 기도 내로 운반하는 매개체로 작용하며 항원 특이 IgE 항체 생산을 증가시켜 알레르기 질환의 유병율을 증가시키고 알레르기 비염의 증상을 악화시키는 것으로 알 려져 있다.

그러나 오존이 알레르기 질환을 증가시키는가에 대해서는 아직 의견이 분분하다. 마우스를 0.8 ppm의 오존에 노출 하였을 때 오존노출군의 폐에서 IgE를 가진 세포의 수가 대 조군에 비해 유의하게 증가되고,

항원과 오존에 동시에 노 출하였을 때 오존이 항원에 대한 알레르기 반응을 증강시 킨다고 보고되어 있다.

그러나 낮은 농도(0.12 ppm)의 오 존은 천식환자에서 기도 항원 반응에 영향을 미치지 않는다 는 상반된 결과가 보고되어 있다.

본 연구에서는 반복적인 오존노출이 혈청 내 IgE와 IgG

의 증가를 초래하는지 알아 보았다. 그 결과 대조군에 비해 오존 노출 군에서 IgE과 IgG

모두 유의하게 증가하였다. 마우스 에서 알레르기 반응은 IgE뿐만 아니라 IgG

에 의해서도 매 개된다고 알려져 있으며,

IgG

은 IL-4 자극에 의해 생산 이 증가되며 비만세포에 대한 결합력이 강한것으로 알려져 있다. 따라서 반복적인 오존노출이 알레르기 질환에 관계된 면역글로불린의 생산을 증가시킨다고 생각한다.

Th(T helper) 세포는 Th1 세포와 Th2 세포로 구분된다.

이 두 아형은 각각에서 생산되는 cytokine의 종류에 따라 구별되는데, Th1 세포는 주로 IL-2나 IFN-γ을 생산하고, Th2 세포는 주로 IL-4, IL-5나 IL-10 등의 cytokine을 생 산한다. IL-4는 B세포에서 항원 특이 IgE가 생성되도록 자 극하고 CD4+T세포에서 IL-4와 IL-5의 생산을 유발하며, IFN-γ등의 Th1 관련 cytokine의 생산을 억제한다.

그 리고 IL-5는 알레르기 반응에서 중요한 기능을 하는 호산구 의 증식, 분화, 활성화, 생존에 중요한 역할을 한다.

Neuhaus-Steinmetz 등

은 마우스를 오존에 노출하였을 때 기관지폐포세정액에서 IL-4, IL-5, 호산구 수의 유의한 증가를 보여 Th2 면역반응이 유발됨을 보고하였으며, 본 연 구에서도 오존노출군의 비세정액에서 Th2 관련 cytokine 인 IL-4, IL-5가 유의하게 증가하였으며 비점막에 침윤된 호산구의 수도 유의한 증가를 보였다. 그러나 Th1 관련 cytokine인 IFN-γ는 대조군과 유의한 차이를 보이지 않았 다. 따라서 반복적인 오존노출이 비점막에서도 Th2 면역반 응을 유발하는 것으로 생각된다.

오존이 어떠한 기전에 의해 Th2 반응을 유발하는지는 아직 잘 알려져 있지 않다. 그러나 반복적인 오존 노출은 비점 막의 상피세포를 손상시켜 염증반응을 유발하고 산화 질소 (nitric oxide)와 같은 세포독성 매개체의 생산을 증가시킨다 고 알려져 있다.

산화 질소는 Th1/Th2 세포의 균형에 영 향을 미쳐 Th1 관련 cytokine인 IFN-γ와 IL-2의 생산을 억제한다고 알려져 있다. 그리고 오존은 비점막의 상피를 손 상시켜 투과성을 증가시킨다고 알려져 있다.

따라서 더 많은 항원이 점막 내의 비만세포나 항원제공세포(antigen- A

A A

A B B B B

Fig. 4. Light micrographs of the maxil- loturbinate mucosa. Tissues were st- ained with Luna staining method. Lots of eosinophils (arrows) are infiltrated in nasal mucosa of a mouse of ozone exposure group (B), but not in those of control group (A). Bar：15 μm.

presenting cells)로 이동하게 되어 항체의 생산을 증가시 키고 알레르기 반응을 유발할 수 있을 것으로 생각한다.

결 론

마우스에서 반복적으로 오존을 노출하였을 때 혈액 내의 총 IgE와 IgG

이 유의하게 증가하였고, 비세정액에서 Th2 관련 cytokine인 IL-4, IL-5는 증가하였으나 Th1 관련 cy- tokine인 IFN-γ는 증가하지 않았으며, 비점막에 침윤된 호 산구의 수도 유의하게 증가하였다.

따라서 반복적인 오존 노출은 비점막에서 Th2 면역반응 을 유발할 수 있으며 알레르기 비염 등의 유병률을 증가시킬 수 있을 것으로 생각한다.

중심 단어：오존・Th2 반응・면역글로불린・사이토카인・

마우스.

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