322 서 론
발기부전은 세계적으로 약 1억 명 이상이 지니고 있는 것 으로 추정되는 매우 흔한 질환으로 한국에서도 대규모 역 학 조사 결과는 없지만, Son 등1, Kim 등2이 시행한 지역사 회의 역학조사 결과에 의하면 30-40대 이상의 남성 중
52-84%가 이 질환에 이환된 것으로 추정되는 흔한 질환이 다. 인구의 고령화와 삶의 질을 중시하는 사회풍조로 인해 이 질환에 대한 사회적 관심은 계속 증가하고 있으며 실데 나필로 대표되는 효과적인 경구용 발기부전치료제인 유형 5 phosphodiesterase 억제제의 등장은 발기부전치료에 대한 대중의 요구를 한층 더 가중시켰다.
그러나 이와 같이 높은 사회적 관심과 효과적인 발기부
의한 혈관성 발기부전의 예방효과
Prevention of Vasculogenic Erectile Dysfunction in Rat Model by the Chronic Administration of Oral Rho Kinase Inhibitor
Kwanjin Park1, Min Young Park, Soo Woong Kim, Jae-Seung Paick
From the Department of Urology, Seoul National University College of Medicine, Seoul and 1Department of Urology, Korea Cancer Center Hospital, Seoul, Korea Purpose: Since Rho-Rho kinase calcium sensitizing pathway is being regarded as a potential target not only for the treatment of erectile dysfunc- tion but also atherosclerosis, we designed a study to prevent vasculogenic erectile dysfunction in an atherosclerotic rat model by chronic admini- stration of fasudil, oral Rho kinase inhibitor.
Materials and Methods: Rats (3 months old) were divided into 3 groups (n=10 in each group): control (group 1), atherosclerosis (group 2), and fasudil- treated (group 3). The group 2, 3 received atherosclerosis-prone treatment but group 3 was concurrently treated by fasudil (30mg/kg/day) for 6 weeks. Following the treatment, the erectile function and the amount of pelvic atherosclerosis amount were determined. Cavernosal tissues were prepared for Western blot and malondialdehyde (MDA) assay.
Results: Compared to group 2, the progression of atherosclerosis in iliac and pudendal arteries was significantly suppressed by the chronic admini- stration of fasudil. Also the treatment lowered the level of malondialde- hyde in the cavernosal tissue. The results of Western blot revealed that systemically administered fasudil could ameliorate cavernosal molecular environment characterized by the decreased expression of Rho A, trans- forming growth factor-beta 1 and overexpression of endothelial nitric oxide synthase. As a result, erectile function was maintained by the treat- ment.
Conclusions: These results indicate that Rho/Rho kinase pathway is sub- stantially involved in the development of penile erection and pelvic athero- sclerosis, both of which could be prevented by chronic treatment of fasudil.
Thus, Rho-kinase might be considered as a novel target for prevention of vasculogenic erectile dysfunction. (Korean J Urol 2006;47:322-330) ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ
Key Words: Vasculogenic Impotence, Atherosclerosis, Rats, Rho GTP binding proteins
대한비뇨기과학회지 제 47 권 제 3 호 2006
서울대학교 의과대학 비뇨기과학교실,
1원자력병원 비뇨기과
박관진1․박민영․김수웅․백재승
접수일자：2005년 8월 2일 채택일자：2005년 11월 15일
교신저자: 백재승
서울대학교병원 비뇨기과 서울시 종로구 연건동 28 ꂕ 110-744
TEL: 02-2072-2422 FAX: 02-762-2428 E-Mail: [email protected] 이 논문은 2003년도 서울대학교병원 집중 육성연구비 지원에 의해 이루어짐.
전치료제의 등장에도 불구하고 발기부전을 지닌 환자 중 치료를 원하는 경우는 30%에 불과하며 그중 약 30%만이 실제 치료를 받게 된다는 연구결과는 현재의 발기부전치료 의 문제점을 잘 보여주고 있다.3,4 물론 동반된 내과적 질환 이나 배우자의 문제로 발기부전치료를 받을 수 없는 경우 도 있지만, 치료를 받지 않는 환자의 상당수는 현재의 발기 부전 치료방법에 불만을 가지고 있는 것으로 생각한다. 또 한 Padma-nathan 등5과 Son 등6의 실데나필 장기투여 결과에 의하면, 발기부전에 대한 치료를 시작한 경우에도 약 30%
의 도중탈락률을 보여 현재의 발기부전치료법이 우수한 효 과에도 불구하고 높은 만족도를 보이는 방법은 아니라는 것을 잘 드러내고 있다.
현재의 발기부전치료제는 병태생리를 회복하여 성욕에 따른 발기를 유도하기보다는 필요 시 복용법으로 약물에 의한 발기를 유도한다는 것이 특징이므로 일부 환자에게는 자연스럽지 않은 느낌을 줄 수도 있을 것이다. 그 예로 Son 등6이 지적한 실데나필의 중단원인 중 가장 흔한 원인이 부 작용이나 가격이 아닌 장기간 성교를 갖지 않다가 시작하 게 되면서 느끼는 부담감 (37%)이었으며 필요 시 복용법과 약물에 의한 발기에 대한 부자연스러움에 대한 불만을 호 소한 경우도 11%나 된다는 사실은 단순한 발기의 유도만으 로는 환자가 만족하는 발기부전의 치료로 불충분하다는 사 실을 잘 보여주고 있다. 이와 같은 문제점을 해결하기 위해 서는 병태생리를 교정 또는 예방하여 자연스러운 발기를 유도할 수 있는 새로운 치료법의 등장이 필요하다.
발기는 호르몬과 심리의 영향을 받아 신경계와 혈관계의 복잡한 상호작용으로 발생하는 현상이지만 가장 중요한 과 정은 nitric oxide (NO)-cGMP 축의 작용에 의한 음경해면체 와 해면체 소동맥평활근의 이완이다. 따라서 현재 발기부 전의 치료는 이 축의 작용을 강화시키는 약물의 일종인 유 형 5 phosphodiesterase 억제제가 주도적인 역할을 담당하고 있으며 그 외에도 현재 연구 중인 약물의 대부분이 이 과정 을 강화시키는 데 목표를 두고 있다. 그러나 현재의 경구 약물은 음경에 이미 존재하는 cGMP의 대사를 억제하는 기 능만 가지고 있으므로 cGMP를 발생시키는 NO의 공급이 심하게 저하되는 상태, 예를 들면 당뇨와 전립선 수술로 인 한 신경차단 등에서는 그 효과가 기대에 미치지 못하는 것 으로 알려져 있다.7
세포내 신호전달체계를 담당하는 G 단백의 일종인 Rho/Rho kinase는 평활근 수축, 유전자 전사, 세포이동과 증식 등8을 담당하므로 죽상경화의 발생에 중요한 역할 을 하며 Rho kinase억제제를 장기투여한 경우 내피 과증 식과 염증세포의 침윤을 억제하여 죽상경화의 발생이 억제되는 것으로 보고된 바 있다.9 음경에서도 Rho/Rho
kinase계가 존재하며 Rho kinas 억제제는 기존 발기부전치 료제의 주요 목표경로인 NO-cGMP 경로와는 독립적으로 또 는 NO의 기능을 강화하여 효과적으로 음경해면체평활근의 이완을 유도하는 것으로 알려져 있다.10 따라서 저자들은 Rho/Rho kinase 억제제가 전신적으로 투여되는 경우 죽 상경화의 진행을 억제하고 발기능을 호전시킬 가능성이 있다고 예상하였다.
저자들은 기존의 음경발기실험에 국소투여법으로 사 용되던 Y-27632 대신에 경구용 Rho kinase 억제제로 심 혈관계에서 만성투여실험 결과가 있는 것으로 알려진 fasudil (HA1077, 5-Isoquinolinesulfonyl homopiperazine)을 혈 관성 발기부전을 지닌 백서모델에서 죽상경화의 초기단 계에 만성적으로 투여하여 죽상경화의 진행을 억제하고 발기부전을 예방할 수 있을지 조사해 보았다.
대상 및 방법
저자들은 백서에서 1% cholesterol 식이를 6주간 투여하면 서 비특이성 nitric oxide synthase (NOS) 억제제인 NG-nitro- L-arginine methyl ester (L-NAME, 3 mg/ml)를 초기 2주간 병 합투여했을 때 전신성 죽상경화에 의한 혈관성 발기부전을 지닌 백서모델의 개발이 가능함을 이미 보인 바 있다.11 L-NAME (1mg/ml)을 3-7일간 투여한 경우에도 관상동맥 에서 죽상경화의 특징적인 초기 병변이 발생하였다고 하였 던 Tomita 등12의 결과에 따라저자들은 이전 실험에서 실험 백서에게 안전하게 투여할 수 있었던 최대의 농도인 3 mg/ml의 L-NAME과 1% cholesterol 식이를 2주간 투여한다 면 전신적인 혈관에 죽상경화의 초기 변화를 유도할 수 있 을 것으로 가정하고 이를 확인하기 위한 예비실험을 진행 하였다.
1. 예비실험
체중이 250-300g인 12주령 백서 (Sprague-Dawley) 10마리 를 5마리씩 두 군으로 나누어 대조군은 정상식이를 죽상경 화군은 1% 콜레스테롤 사료 (CRF-1; Oriental yeast co. Ltd, Osaka, Japan)와 음용수에 L-NAME (3mg/ml)를 혼합하여 2 주간 투여하고 2주가 경과된 다음에 백서를 희생시켜 내장 골동맥과 내음부동맥을 적출하여 hematoxylin & eosin (H&E) 염색을 시행하였고 내피탄성섬유의 변화를 확인하 기 위해 탄성섬유염색법인 Elastic van Gieson (EVG) 염색을 시행하여 두 군 간의 intima to media ratio (I/M)를 비교하였다.
2. 대상군의 선정과 처치
체중이 250-300g인 12주령 백서 (Sprague-Dawley) 30마리
를 대조군 (n=10), 죽상경화군 (n=10), 약물투여군 (n=10)으 로 나누어 대조군은 정상식이를 죽상경화군과 약물투여군 은 6주간 1% 콜레스테롤사료를 투여하면서 초기 2주간 L-NAME (3mg/ml)을 투여하여 죽상경화를 유도하였다.
약물투여군은 2주간의 투여로 죽상경화의 초기변화가 발생하였다고 판단되는 L-NAME투여 직후 4주간 fasudil (30mg/kg/day)를 경구주입용 zonde를 통해 매일 투여하였 다.
3. 음경해면체 신경자극
6주의 사육기간이 지난 다음 urethane (1.6g/kg)으로 마취 후 앙와위에서 음경주위를 박리하여 우측 음경각을 노출시 켜 polyethylene tube (PE-50)를 삽입하고 30분간 안정화시켰 다. 그 동안 좌측 대퇴동맥에 24G angiocatheter를 삽입하여 전신혈압을 측정할 수 있는 통로를 확보하였다. 이후 복부 정중절개로 우측 전립선의 외측에 위치하는 주골반신경절
(major pelvic ganglion)을 확인한 다음 양극성 전기자극기 (Grass SD9, Grass Instrument, Quincy, USA)를 이용하여 6V, 30Hz, 0.5msec의 조건으로 해면체신경을 60초간 자극하였 다. 전신혈압과 해면체내압 (intracavernosal pressure; ICP)은 실 험 동안 지속적으로 측정하였다. 최대해면체내압 (peak ICP), 최대해면체내압/평균동맥혈압 (peak ICP/mean arterial pres- sure: ICP/MAP), 최대해면체내압에 이르는 시간 (time to peak ICP)을 조사하였다. 해면체신경 전기자극은 최소 5회 이상 을 반복하였으며 각 전기자극 간의 시간 간격은 최소 10분 이상을 유지하였다. 해면체신경자극을 마친 후 혈액을 3cc 채혈하고 urethane을 다량 주입하여 희생시킨 후 내장골동맥 과 내음부동맥을 적출하여 10% formalin에 보관하였다. 음 경은 적출하여 -70oC에 냉동보관 하였다.
4. 혈관조직 염색
파라핀에 포매된 혈관조직은 8μm microtome으로 5 μm의 두께로 100μm 간격을 두고 절제하여 슬라이드에 부착한 후 hematoxylin and eosin (H&E) 염색을 시행하였 다. 복부대동맥과 내장골동맥의 조직절편은 40배 확대 된 영상으로 스캔한 다음 Image-Pro PlusTM(Media Cyber- netics, Carlsbad, USA)를 이용하여 혈관의 intima와 media 의 단면적을 계산하여 I/M을 구하였다. 한 개의 슬라이 드당 4군데의 조직절편의 평균을 구하여 해당 혈관의 평 균 I/M을 결정하였다.
5. 음경해면체조직의 malondialdehyde level 측정 적출되어 보관된 음경은 둘로 나누어 하나의 절편으로 Western blot을 시행하고 다른 하나의 절편으로 음경 내
oxidative stress를 측정하였다. Oxidative stress를 측정하기 위해 MDA-586 colorimetric assay kit (OXIS International, Portland, USA) 사용하였으며 구체적인 방법은 다음과 같다.
세포질 분획을 얻기 위해 조직을 ice-cold 20mM Tris-HCl buffer (pH 7.4)에 균질화시키고 4oC에서 3,000g으로 20분간 원심분리를 시켜서 상층액을 분리하였다. 분리된 상층액을 malonaldehyde가 포함된 chromogenic agent와 45oC에서 60분 간 반응시켜서 안정적인 발색화합물이 생길 수 있도록 하 였다. 이 발색화합물의 흡광도는 586nm에서 microtiter plate reader (Dynex Technologies, Chantily, USA)를 이용하여 측정 하였고 malonaldehyde의 양은 표준곡선을 이용하여 결정하 며 nmol MDA/ml의 단위로 표시하였다.
6. Cavernosal Western blot
동결된 음경해면체 조직을 0.32M sucrose, 10mM Tris- HCl pH 7.4, 2mM EDTA가 포함된 buffer에서 균질화시켰고 10μl/ml의 protease inhibitors (Bio-rad, Hercules, USA)를 첨 가하였다. 이후 10,000g에서 15분간 원심분리한 후 상층액 을 수거하였고 (막단백 분리) Bradford assay (Bio-rad)로 정 량하였다. 막단백을 95oC에서 5분간 변성시킨 후 60μg의 단백을 12%, 7%의 SDS-PAGE gel에서 전기영동하였다. 이 후 0.45-μm PVDF 막에 1시간 동안 wet blot 하였다. 이후 비특이적 반응을 차단하기 위하여 5% nonfat dry milk가 포 함된 TBST (Tris buffered saline containing Tween-20) 용액에 서 1시간 동안 상온에서 배양하였다. 전달된 단백에 대해서 5% nonfat dry milk, 1:200으로 희석된 transforming growth factor (TGF-β1) rabbit polyclonal IgG (SC-146; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA), 1:100로 희석된 C-19 hypo- xia induced factor 1α(HIF-1α) goat polyclonal IgG (SC-8711;
Santa Cruz Biotechnology), 1:200으로 희석된 rabbit monoclo- nal Rho A antibody (SC-418; Santa Cruz Biotechnology) 그리 고 1:200으로 희석된 rabbit anti-endothelial nitric oxide syn- thase (eNOS) antibody (Transduction Laboratories, Lexington, USA)이 포함된 TBS와 상온에서 2시간 동안 배양하고 TBST에서 35분간 3차례 세척을 거친 다음 horseradish peroxidase (HRP)가 결합되어 있는 1:4000의 anti-goat IgG (Santa Cruz Biotechnology), 1:4,000의 anti-rabbit IgG (Santa Cruz Biotechnology)가 포함된 TBST와 한 시간 동안 상온에 서 배양하였다. 배양이 끝난 후 TBST로 35분 동안 3차례 세척을 하고 ECL plus kit (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, USA)로 화학적 발광반응을 유발시켜 X-ray film
(Kodak BioMax ML)에 노출시켰다.
7. 자료의 분석과 통계적 검정
측정된 해면체내압과 혈압의 신호는 Power LabTM(ADIns- truments, Colorado Springs, USA)을 통하여 증폭되어 개인용 컴퓨터에서 전산화된 자료로 입력되고 분석되었다. 정상 대조군과 죽상경화군의 혈중 콜레스테롤치, 혈압, 각종 발 기지표의 비교는 Student's t-test를 이용하였고 형태학적 지 표인 I/M의 비교는 비모수검정인 Mann-Whitney U-검정을 사용하였다. 통계분석 및 그래프의 작성은 GraphPad Prism
(version 4.0 for windows, GraphPad Softwar, San Diego, USA) 을 이용하였고 p＜0.05인 경우를 통계적으로 유의한 경우 로 판정하였다.
결 과
1. 예비실험 결과
죽상경화군의 내장골동맥은 2주간의 치료 후에 내피두 께 의 증가와 내피탄성섬유 간격의 증가, 일부 내피섬유의 파괴 를 보였으며 그 결과 I/M이 대조군에 비해 유의하게 증가하 였다 (0.59±0.05 vs 0.83±0.07, p＜0.05). 반면 내음부동맥은 내피세포의 핵이 방추형으로 변화하고 내피세포밀도 (cellu- arity)가 일부 감소하였으나 죽상경화의 특징인 뚜렷한 내피 의 두께의 변화를 보이지 않았다 (0.77±0.13 vs 0.86±0.11, p＜0.05). Fig. 1에 대표적인 혈관염색 결과를 도시하였다.
Fig. 1. Photomicrographs of re- presentative cross sections of the arteries of the rats in the pilot study. (A) No intimal lesion in the control group. The internal iliac artery (H&E, x200). (B) Well preserved elastic lamella in the control group. The internal iliac artery (EVG, x1,000). (C) Normal cellularity and a well preserved internal elastic lamella are ob- served in the control group. The internal pudendal artery (H&E, x400). (D) Asymmetrical intimal irregularity and focal thickening of the intima are observed in the 2 week treated rats. The internal iliac artery (H&E, x200). (E) Wid- ening of the interlamellar spaces and the gradual loss of elastic fiber are observed after a 2 week treatment. The internal iliac artery EVG, x1,000). (F) No significant intimal change is observed after a 2 week treatment (H&E, x400).
H&E: hematoxylin and eosin, EVG:
Elastic van Gieson staining, I:
intima; M: media.
Control Two week-treated
A D
E B
C F
2. 체중, 혈중 콜레스테롤 농도, 평균혈압의 변화 (Table 1) 정상 대조군은 체중의 계속적인 증가를 보였으나 평균 혈압과 콜레스테롤농도는 유의한 상승을 보이지 않았다.
죽상경화군은 체중은 대조군과 비슷하게 증가하였으나 대 조군에 비해 평균 혈압과 콜레스테롤 농도가 유의하게 상 승하였다 (p＜0.01). Fasudil을 투여한 군은 혈중 콜레스테롤 농도는 죽상경화군과 차이가 없었으나 혈압증가가 유의하 게 억제되었고 체중 증가도 죽상경화군이나 대조군에 비해 적었다 (p＜0.05).
3. 해면체 신경자극 유도발기 검사 (Fig. 2)
약물투여군이 최대해면체내압에 도달하는 평균 시간은 죽상경화군에 비해 유의하게 단축되어 대조군과 차이가 없 었다. 최대해면체 내압은 대조군＞fasudil 투여군＞죽상경 화군의 순이었다. Fasudil의 투여는 혈압의 증가를 억제하였 으므로 최대해면체내압을 전신동맥압으로 보정한 ICP/
MAP는 대조군≥fasudil 투여군＞죽상경화군의 순으로 나 타나서 fasudil 투여군과 대조군 간의 유의한 차이를 보이지 않았다.
4. 혈관조직 분석 (Fig. 3)
내장골동맥과 내음부동맥 모두에서 I/M은 대조군＜
fasudil투여군＜죽상경화군의 관계를 보였다. 따라서 fasudil 의 투여로 죽상경화의 진행이 부분적으로 억제되는 소견이 었다. 내장골동맥의 평균 I/M은 0.62±0.08 (대조군), 1.28±
0.13 (죽상경화군), 0.94±0.85 (fasudil 치료군)로 나타났다.
또한 내음부동맥의 평균 I/M은 0.88±0.12 (대조군), 1.94±
0.17 (죽상경화군), 1.24±0.10 (fasudil 치료군)으로 나타났다.
내장골동맥 (p=0.003)과 내음부동맥 (p=0.004) 모두 평균 I/M 이 유의한 차이를 보였다.
5. 음경 내 oxidative stress (Fig. 4)
조직내 oxidative stress를 의미하는 MDA를 측정하였을 때 약물투여군은 평균 MDA 양이 3.5±0.8μM/ml로 나타나 죽상경화군 (6.6±0.7μM/ml)에 비해 유의하게 낮은 MDA 농도를 보였으나 대조군 (1.8±0.4μM/ml)에 비해 높은 수 치를 보였다 (p=0.001 ANOVA with Tukey post hoc test).
6. 음경해면체 Western blot (Fig. 5)
음경해면체조직에 대한 Western blot을 시행하여 그 결과 Table 1. Comparisons of sequential changes of serum cholesterol,
the mean arterial pressure and body weight between the control and treated rats
ꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚ Control Atherosclerosis Fasudil treated
(n=5) (n=10) (n=10)
ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ Cholesterol (mg/dl) 66.2±3.8 148.2±5.2* 143.6±4.5*
Mean arterial
105.5±3.2 135.4±4.5* 112.7±3.9*† pressure (mmHg)
Body weight (g) 395.6±10.8 382.5±15.7 344.6±7.1*† ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ Statistically significant differences from control and 2 weeks AS are marked as *(p＜0.05) and †(p＜0.05) respectively. Student's t test.
Fig. 2. Results of cavernous nerve electrostimulation. Treatment with fasudil effectively ameliorates the deterioration of erectile function. *denotes statistical difference versus atherosclerosis (AS).
†denotes statistical difference versus fasudil.
를 반정량 (semiquantitative) 분석법인 densitometry로 분석해 본 결과 fasudil을 투여한 약물투여군에서 hypoxia induced factor 1α(HIF-1α)의 양은 죽상경화군과 의미있는 차이를 보이지 않았으나 TGF β1과 Rho A단백의 양은 죽상경화군 에 비해 유의한 감소를 보였으며 eNOS는 대조군보다도 높 은 발현을 보였다.
고 찰
저자들은 경구용 Rho kinase 억제제의 전신적 만성 투여 법으로 발기부전의 예방을 최초로 시도했으며 본 연구결과 를 통하여 밝혀진 새로운 사실은 다음과 같이 크게 두 가지 로 요약할 수 있다. 첫째, 경구용 Rho kinase 억제제의 전신 적인 만성 투여방법으로도 음경해면체에의 국소적으로 존 Fig. 3. Photomicrographs of representative cross sections of rat internal iliac (left sided panel) and internal pudendal (right side panel) arteries. The progression of atherosclerosis is substantially attenuated by the fasudil treatment (H&E, x200 (internal iliac artery) and x400 (internal pudendal artery)).
A B
D C
E F
Internal iliac artery Internal pudendal artery
Control
Atherosclerosis
Fasudil treated
재하는 Rho-Rho kinase 경로의 작용을 억제할 수 있었으며 그 결과 발기능의 악화를 예방할 수 있었다는 것 둘째, Rho kinase 억제제의 전신적인 만성투여법은 죽상경화와 혈관 성 발기부전의 병태생리를 동시에 조절할 수 있었다는 것 이다.
Rho는 세포 내 신호전달체계의 일종인 Ras 계열의 GT- Pase로 Angiotensin II, endothelin-1, thrombin, serotonin 등에 의해 활성화되어 주요 활동경로인 Rho kinase를 활성화시 킨다.10 활성화된 Rho kinase는 myosin light chain phospha- tase (MLCP)를 인산화시켜서 억제함으로써 인산화되어 actin 과 결합되어 있는 myosin light chain (MLC)의 분리를 방지 함으로써 칼슘의 도움 없이 평활근의 수축상태를 유지하는 것으로 알려져 있다.10 또한 Rho 단백은 Rho kinase의 활성 화뿐만 아니라 ERM (ezrin, radixin, moesin), adducin, inter- mediate filament (vimentin) 등도 활성화시켜 세포의 증식과 부착 등의 역할을 하는 것으로 알려져 있으므로 각종 심혈 과계 질환의 병태생리에 중요한 역할을 한다.10 따라서 죽상 경화에서 Rho kinase의 억제로 이를 조절하려는 여러 방법 들이 이미 시도되었다. Rho kinase의 발현을 억제하는 유전 자요법 (dominant-negative Rho-kinase) 또는 Rho kinase억제 제인 fasudil의 투여는 손상 후 내피의 증식 또는 내피의 constrictive remodeling을 억제하는 것으로 보고되어 죽상경 화에서 Rho-Rho kinase의 경로는 유망한 치료목표라고 생 각한다.13,14
음경에 투여한 Rho kinase 억제제 (Y-27632) 또는 domi- nant negative Rho A는 음경해면체평활근을 이완시켜 발기 를 유발하였으며, 이와 같은 현상은 NOS억제제를 투여한 상태에서도 나타나 음경해면체평활근의 주 이완기전인
NO-cGMP 경로와는 별개의 경로로 발기를 유발하는 것으 로 보고되었다.10,15 또한 음경 내 NO-cGMP 경로와 Rho-Rho kinase 경로는 음경해면체평활근의 긴장도에 따라 서로를 억제하며, Rho kinase 억제제의 투여는 NO donor의 발기유 도를 강화시키는 것으로 나타나 Rho-Rho kinase 경로가 기 존의 NO-cGMP 경로와 함께 음경해면체평활근의 긴장도를 조절하는 주요 경로로 밝혀졌다.16,17
서론에서 밝힌 바와 같이 현재의 발기부전치료는 병태생 리를 교정하여 자연적인 발기를 회복하는 것이 아닌 일회 성으로 강제적인 발기를 유발하는 것에만 초점이 맞춰져 있으므로 상당수의 환자들이 치료에 순응하지 않는 것이 현실이다. 만일 병태생리를 교정하여 자연적인 발기의 회 복이 가능한 방법이 있다면 이에 대한 대안이 될 수 있을 것이다. Rho kinase 억제제는 음경과 죽상경화에 미치는 긍 정적인 영향이 확인된 바 있으므로 저자들의 목적에 합당 한 모델이었고, 심혈관계 분야에서의 연구결과에서 만성적 인 투여로 죽상경화의 호전을 보였으므로 저자들은 처음에 는 이미 확립한 혈관성 발기부전을 지닌 백서모델에 Rho kinase 억제제의 만성투여로 치료하는 연구를 계획하였다.
그러나 음경에서 만성투여 결과가 없었고 죽상경화를 호 전시킨다고 해서 음경에서도 같은 변화가 발생한다고 단정 할 수가 없었다. 왜냐하면 혈관성 발기부전에 의해 음경섬 유화 등의 비가역적인 변화가 발생한 경우에는 현재까지 음경에서는 평활근 이완 효과만 알려진 Rho kinase 억제제 만으로는 긍정적인 효과가 나오지 않을 수도 있기 때문이 었다. 따라서 저자들은 우선 예방에 초점을 맞추고 치료시 점을 대혈관에만 일부 변화가 발생한 죽상경화의 초기 단 계로 설정하였다. 이 단계에서는 음경에 비가역적인 변화 가 발생할 가능성이 적으므로 음경에 미치는 만성투여의 Fig. 4. The results of malondialdehyde assay show that fasudil
significantly reduces oxidative stress compared to the atherosclero- sis (AS) group. *statistically significant differences from control,
†statistically significant differences from AS.
Fig. 5. The protein expression of our experimental groups is analysed by Western blotting. TGF-β1: transforming growth factor β1, HIF-1α: hypoxia induced factor 1α, eNOS: endothelial nitric oxide synthase, AS: atherosclerosis. Glyceraldehyde-3-phosphate de- hydrogenase (GAPDH) served as a control for the loading.
23 KD
Con Fasudil AS
37 KD 55 KD 118 KD 145 KD
Rho A GAPDH TGF- 1β HIF-1α eNOS
효과를 정확히 평가할 수 있을 것으로 생각하였다. 예비실 험에서 NOS억제제와 cholesterol 사료의 2주 투여는 대혈관 인 내장골동맥의 내피두께의 증가와 죽상경화의 특징적인 내피 탄력섬유의 변성을 유도하였으나 말초동맥인 내음부 동맥에서 유의한 변화를 유도하지 않았다. 따라서 이 단계 가 죽상경화의 초기 단계로 생각되었으며 이 시점이 Rho kinase 억제제의 예방효과를 시험할 수 있는 적기라고 생각 하였다. 저자들의 가설대로 Rho kinase억제제의 만성투여는 부분적이지만 죽상경화의 진행억제와 발기능의 유지라는 두 가지 목적을 달성하였다. Fasudil 투여군은 I/M이 죽상경 화군과 비교하여 유의한 차이를 보일 정도로 죽상경화가 억제되었고 발기능의 지표인 최대해면체내압도 죽상경화 군에 비해 의미있게 높았다. 게다가 가장 발기능을 잘 반영 하는 지표인 ICP/MAP는 fasudil 투여군과 정상대조군이 유 의한 차이를 보이지 않았다. 따라서 죽상경화의 측면에서 는 fasudil의 투여가 죽상경화를 완전히 정상화시키지는 못 하였지만 발기능의 보존이라는 측면에서는 일부 발기능이 정상화까지도 가능하게 되었음을 알 수 있다. 전신적인 Rho kinase 억제제의 투여가 죽상경화의 진행을 억제하고 발기능은 호전시킨다는 본 연구결과는 Rho-Rho kinase 경 로가 두 개의 질환을 동시에 치료하는 치료목표로 쓰일 수 있다는 것으로 의미하며 특히 발기부전의 경우는 지속적인 경구투여의 방식으로 즉각적인 회복이 가능하다는 것을 시 사한다. 또한 전신투여에도 불구하고 음경에 미치는 국소 효과도 우수한 것으로 나타나 발기부전치료에 있어서 이 경로의 중요성을 대변하고 있다.
본 연구에서는 Rho kinase 억제제 만성 투여의 결과로 음 경 내에 다양한 분자적 환경의 변화가 발생하였음을 알 수 있었다. 비록 전신적으로 투여했지만 음경 내 Rho A의 발 현이 뚜렷하게 감소되어 국소적 작용을 확인할 수 있었고 허혈성 변화에서 발현이 증가되며 이전 연구결과와 같이 죽상경화군에서 증가하는 것으로 생각되는 TGF-β1의 발 현이 억제되는 것도 확인할 수 있었다.11,18 음경 내 혈관과 해면체의 이완의 유지를 담당하는 것으로 생각하며 다양한 혈관성 발기부전에서 그 발현이 오히려 감소하는 것으로 알려진 eNOS는 죽상경화군은 그 발현이 감소되었으나 약 물투여에 의해서 대조군보다도 더 강한 발현을 보였다. 이 는 타 장기의 연구에서 이미 입증된 Rho kinase의 억제로 eNOS의 활성화가 유발되며 Rho A의 활성화는 eNOS mRNA의 불안정성을 증가시키고, cGMP의 증가에 의한 protein kinase G가 Rho A를 인산화시켜 억제한다는 두 경로 간의 상호관계와 일치하는 소견이다.16,19 따라서 본 연구결 과는 Rho kinase의 억제가 독립적인 음경의 이완경로를 지 니고 있을 뿐만 아니라 NO-cGMP 경로의 강화를 유도할 수
있다는 점에서 발기부전의 유용한 치료 목표로 쓰일 수 있 다는 것을 잘 보여주고 있다.
죽상경화에 의한 혈관성 발기부전의 일차적인 병태생리 는 내강의 폐색이 진행되면서 음경해면체에 공급되는 혈류 의 감소이며 그 결과 발생한 음경해면체의 허혈상태에 의 한 이차적인 음경해면체의 기능부전을 야기하는 것으로 생 각된다.20 따라서 죽상경화의 진행이 억제된다면 음경해면 체의 허혈상태를 반영하는 HIF-1α는 약물투여군에서 그 발현이 증가하지 않을 것으로 예상되었으나 본 연구에서는 죽상경화군과 발현의 차이가 없었다. 본 연구만으로는 그 이유를 정확히 알 수 없으나 약물투여군에서 죽상경화의 진행이 부분적으로 억제되었으므로 일부 감소한 혈류에 대 해 HIF-1α가 민감하게 반응하였을 가능성 또는 음경내 oxidative stress의 증가가 부분적으로 억제된 것 또는 죽상 경화에서 흔히 증가하는 oxidized low density lipoprotein에 기인하는 것으로 생각한다. 위에서 언급한 사항들이 모두 HIF-1α의 발현을 증가시킬 수 있는 요인이 되기 때문이 다.21,22
저자들의 연구는 발기부전도 병태생리를 조절하여 예방 이 가능할 수 있다는 것과 필요 시 복용법이 아닌 만성적인 투여법으로 발기능을 유지할 수 있음을 잘 보여준다. 따라 서 장기투여에도 안전하고 병태생리를 호전시킬 수 있으며 가격이 적정하다면 경구비타민을 복용하듯 지속적인 투여 로 발기부전을 예방하는 것이 가능할 수도 있을 것으로 생 각한다.
본 연구에서 흥미롭게도 fasudil을 투여받은 백서에서 체 중증가가 유의하게 억제되었다. 원인은 정확히 알 수 없으 나 내피기능에 긍정적인 영향을 미치는 fasudil의 효과를 생 각하면 이 효과가 체중증가의 억제 및 혈압의 감소와 연관 될 가능성도 있을 것 같다. 현재 관련연구 결과가 없으므로 이에 대한 연구가 필요하며 향후 비만쥐에서 비슷한 실험 을 한다면 이 효과를 분명히 검증할 수 있을 것으로 생각한 다.
Fasudil은 인간에서의 경구복용이 인정된 유일한 Rho kinase억제제이며 일본에서 이미 지주막하출혈 후 뇌혈관 수축을 예방하기 위해 사용되는 약물이다. 항협심증약물로 서의 가능성을 확인한 2상 임상시험에서는 120mg/day까지 투여하여도 의미있는 부작용의 발현이 나타나지 않았다.23 비록 백서에서의 실험이었지만 본 연구에서도 fasudil은 심 각한 부작용을 유발하지 않았으며 심한 혈압의 감소를 보 이지도 않았다. 인간에서 사용할 수 있는 용량이 다를지도 모르지만 인간에서도 이 약물의 안전한 사용은 가능할 것 으로 생각한다.
결 론
본 연구에서 최초로 시도한 혈관성 발기부전 백서모델에 서 경구용 Rho kinase 억제제인 fasudil의 만성투여결과는 죽상경화의 진행을 부분적으로 억제하고 음경해면체의 eNOS를 활성화시키고 Rho A의 발현을 억제하여 발기능을 유지시켰다. 따라서 Rho-Rho kinase 경로는 음경해면체평활 근의 이완효과 외에도 혈관성 발기부전의 병태생리적인 치 료를 가능케 할 수 있는 주요한 목표경로가 될 전망이다.
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