약학회지 제 27권 제 4 호 257〜261(1983) Yakhak Hoeji, Vol. 27，No. 4
藥物과 生體高分子間의 相互作用(VI)
N alid ix ic A cid 및 Probenecid와 牛血淸 蛋白間의 結合에 관한 研究
金 鍾 國•林 研 秀 •楊智善
서울;大學校 藥學ᄎ學 (Received May 12，1983)
Chong-Kook K im , Yun-Su L im and Ji-Sun Y an g College o f Pharmacy, Seoul National University, Seoul 151、Korea
Drug-Biomacromᄋlecule Interaction (V I) B ind ing of N alid ix ic A cid and Probenecid to
Bovine Serum A lb u m in
Abstract—Binding of nalidixic acid which is used primarily in the treatment of urinary infection and probenecid which is used as a uricosuric agent to bovine serum albumin were studied using difference spectrophotomeric method. 2~ (4,-Hydroxybenzeneazo) benzoic acid as a spectrophotometric probe was used for measuring the binding of nalidixic acid and probenecid to bovine serum albumin. The association constants of nalidixic acid and probenecid were 1. 58x 104 M_1 and 1.70 x 104 M_1, respectively.
藥物과 血清蛋白과의 結合에 관한 硏究는 藥効面에서나 製劑設計面에서 重要한 課題로 되어있
다 1 ^ . 이는 藥物이 生體內에서 血清蛋白과 結合하지 않은 遊離狀態의 藥物만이 作用部位에서
藥効를 發現하기 때 문 이 다 씨
本 硏究에서는 penicillin, cephalosporin 흑은 sulfonamide에 過敏性인 尿路疾患 患者에게 이러
한 藥物을 대체하여 使用하는 治療劑인 nalidixic acid6)와 尿酸의 排泄을 促進시키며 近位細尿
管에서 有機酸性藥物의 排池을 抑除하는 藥物인 probenecid7)를 體內에 各各 投與하였을 경우 에 藥物의 거동을 예측하고저 이들 藥物과 牛血清알부민 (BSA) 間의 結合樣狀을 U V difference spectrophotometry法으로 測定하였다.
實 驗 方 法
實驗 材 料 ᅳ 本 實驗에 서 使 用 한 牛 血 清 알 부 민 fraction V 는 Sigma Co. 製 品 을 購 入 하 여 使 用 하 였다 . BSA의 濃 度 는 280 nm 에 서 U V 吸 光 度 를 測定하여 몰 濃度 67을 基 準 으 로 하여 結 定 하 였 으 며 , BSA의 分 子 量 은 69, 000으로 計 算 하 였 다 . Nalidixic acid는 홍성제 약 (주 )에 서 提 供 받 았 으 며 , probenecid는 韓 美 藥 品工 業에 서 提 供 받 아 使 用 하 였 다 . U V probe로 使 用 한 2-(4,-hyd- roxybezeneazo) benzoic acid(H B A B )는 IC N pharmaceuticals Inc. 製 品 을 購 入 하 여 使 用 하 였 다 . Probe 溶 媒 로 使 用 한 methanol은 spectroscopic grade이 며 ， 그 이외에 使 用 한 試 藥 은 市 販 하 는 特 級 品 을 精製없이 使 用 하 였 다 .
김총국•임연수•양지선
實驗 方 法 ᅳ Difference spectra는 Pye Unicam RF-510型의 紫 外 分 光 光 度 計 를 使用하여 測定하였 으 며 , 測定에 使 用 한 cell은 10 mm X 4 .5 mm tandem cell이 다 . pH 7 .4인 0. 054 M phosphate buffer 룰 溶 媒 로 하여 2.98X10_5M BSA 溶液을 調製하였 으 며 , 같은 濃度의 BSA 溶液에 各各 nalidixic acid와 probenecid를 2X1(T4M씩 加하 였 다 . BSA 溶液과 各 藥物이 加해진 두 BSA 溶液에 methaiwl로 溶解시킨 probe (HBAB) 1 x 10_2M
Fig. 1-Tandem cell arrangement for difference spectrophotometry.
溶液을 5 서1씩順次的으로 加하여 40 셰까지 加한 後 thermo-mixer로 提样시 켰다. phosphate buffer 와 BSA 溶液을 兩測에 넣은 2個의 tandem cell 을 各各 reference beam과 sample beam에 平 行 하게 놓고 base line을그린 다음 reference beam 의 buffer 溶 液 과 sample beam의 BSA 溶液 代 身에 probe를 加 해 준 溶 液 을 順 次 的 으 로 넣고 484 nm에 서 difference absorbance를 測定하였으 며, 이때 實驗은 20oC에서 行하였다.
Tandem cell의 配置는 Fig. 1과 같다.
Data
處理一HBAB와 같은 작은 ligand 分子와 BSA 같은 macromolecule의 結合樣狀은 Lang- muir type 方程式으로 표시할 수 있다. 9)CPo〕 ⑴
여기서, F는 BSA 1 分子當 結合한 HBAB의分子數로서, 結合되어 있는 HBAB의濃度，〔/VI〕 룰 BSA의 總濃度, CP0〕로 나눈 것 이 며 ,〔시 는 遊離狀態의 HBAB의濃度이며，»은 BSA 1 分子
에 HBAB가 結合할 수 있는 結合部位의 數이고, & 는 結合의 크기를 나타내는 結合常數이다.
HBAB가 BSA과 結合함에 따라생긴 吸收 spectrum의변화를 484 nm에서測定한 값, difference a b s o r b a n c e는 다음과 같은 관계를 갖고 있다.
A E = A ^ [ P A } ^ d (2)
여기서, Js는 結合된 HBAB와 結合하지 않은 HBAB의 molar extinction coefficient의 차이이며 넜는 optical path의 길이이므로 일정한 값이다.
AE
〔재 > = !「
總 H B A B 의 濃 度 , [>〕는
(3) 式과 (5) 式을 (1) 式에 代入하면 A-p
ip^ir=nK[^a]
ᅳ 〔느 〕}/a+ 尺 {w -cp 세 〕(6) 式을 정리하면
1 _ _ ( 1 丄 1 ᅳ — A E \ 1
A E \
l/CPo〕lim—o
A E
difference absorbance (JS ) 의 最ᄎ置는 加한 HBAB가모두 BSA과 結合할 때 즉，〔끈시二예
⑶
⑷ (5)
(6)
(7)
(8)
545?5" 517 5 6 9 0 0
I 몌
Fig. 2-Difference absorbance as a function of HBAB concentration at various BSA con
centrations.
A. 2.90xl0"4M; B. 1.93xlO-4M; C.
1.45x1 으4M; D. 1. 16x10_4M and E.
2.90xl0-5M
Fig. 3-Plots l / J E versus 1/CP。〕.
A. 2.5xlO~5M; B. 5.0x10-5M; C. 7.5x 10~5M; D. l.O x lO ^ M ; E. 1.25xlO-4M;
F. 1.5xlO-4M； G. 1.75xlO-4M and H.
2. O x l으4M HBAB.
일때이다. 그러므로, 여러 BSA 濃度에서의 소E롤 測定하고， (Fig. 2), 1 /〔尸0〕에 對하여 1/넜£ 를 plot하면 그 ;y축 裁片置로 부터 선표의 最大置(크五*)를 求할 수 있다. (Fig. 3)
위에서 求한 此)■置와 實驗置 을 가지고 Brand等10>의 方法에 따라 BSA 溶液과 各 藥物의 結合分率을 計算하였다.
( 9 )
Fig. 4는 HBAB 濃度를 變化시키면서 滴定한 BSA溶液과 各 藥物의 吸收曲線이다.
BSA과 HBAB의 結合分率을 求한 後, Scatchard 方程式11)을 使用하여 結合常數와 結合部位의
數를 求하였다. (Fig- 5)
? / A = n K a- ? - K a (10)
여기서, K 0는 H B A B의 結合常數이다.
Nalidixic acid와 probenecid의 結合部位의 數는 Scatchard 方程式에서 求하나， 結合常數는 위 에서 얻은 H BA B의 結 合 常 數 와 結合部位의 數 (»)을 Klotz 方程式12>에 代入하여 求하였다.
nlP,-]KaiA-} - [_PA-]KaiA}-lPA] ᅩ K aCAj
K b~' - n (P o } K a\：A-) + lP A ] K aiA-} + CPA T IPA-) (11)
여기서, Kb는 BSA에 대하여 HBAB와 相競的으로 作用하는 藥物의 結合常數이며, 〔히〕는 藥
物의 總澳度이다.
liJ<
(3^suoqJosqD
3 a u aJ a i:
'Q
v
Fig. 4-D£ference absorbance titration curve of Fig. 5-Scatchard plots of HBAB binding to BSA with HBAB at high and low con BSA.
centrations. A •• in the absence of drug,
A: theoretical BSA concentration, B ： 2.90 B ： in the presence of 2Jx 10_4M nalidixic X10-6M BSA, C: in the presence of 2x Acid,
10~4M nalidixic acid, D ： in the presence C: in the presence of 2 x 1 으4M probe-
of 2 x 10'4M probenecid. necid.
實 驗 結 果 및 考 察
Difference spectrophotometry를 利用하여 nalidixic acid 및 probenecid와 BSA 間의 結 合 常數 및 結合部位의 數 를 求 하 였 다 . Probe로 使 用 한 H BA B와 nalidixic acid 및 probenecid는 BSA 에 同一 한 結 合 力 을 나 타내는 2個의 部位에 結 合 하 고 있으며 各各의 藥 物 과 BSA 間의 結 合 常 數 는 Table I.에 表示한 것과 같다.
Nalidixic acid는 血液中에서 血號蛋 白 에 93% 程 度 가 結 合 되 며 ， nalidixic acid의 metabolite인 hydroxynalidixic acid는 約 63% 가 結 合 된 다 고 알려져 있 으 므 로 13，14) nalidixic acid보 다 크 다고 생 각 되 는 藥 物 을 併 用 投 與 할 경 우 에 는 두 藥物이 相 競 的 으 로 血獎蛋白에 結合하게 되 므 로 相 對 的 으 로 遊 離 nalidixic acid의 血 中 濃 度 가 증가되어 藥效發現의 增;大를 豫 測 할 수 있 다 . 특히 Nalidixic acid는 신 장 또 는 간장 질환 환 자 에 게 는 投與하기 어려운 藥 物 이 므 로 8} 他 藥 物 을 同時에
Table I-Binding parameters.
HBAB Nalidixic Acid Probenecid
K 2 .66X104 1.58X104 1.70X1204
n 2.07 1.97 1.72
投與할 필요가 있을 경우에는 신장 및 간장의 기능은 물론이며 同時投與하는 藥物의 血康蛋白에 대한 結合力을 測定하여 nalidixic acid와 비교검토 하여야 된다.
Probenecid는 近位細尿管에 作用하는 藥物로서 신장질환 환자에게는 藥效를 별로 나타내지 않
으며8J Table I에 표시된것 처럼 단백결합력이 비교적 크므로 他藥物의 血中濃度를 持續시키기
爲하여 併用投與할 경우에는 신장기능의 검사와 더불어 血發蛋白에 對한 結合力을 比較檢討하여 同時投與하는 藥物의 用量 및 投與時間을 調節하여야한다.
文 獻
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