STEAM R&E 결과 보고서 양식
과 제 명 유산균의 젖산 생산과 이산화탄소 배출을 이용한 모기 유도의 효율성 탐구
소속학교 명덕고등학교
책임지 도교사 한O음 공동 지도교 사 이O연 참여 학생 이O혁, 김O진, 이O환, 김O진
1. 과제 개요
□ 연구목적
○ 연구 동기
- 여름철 우리가 매우 귀찮게 생각하는 모기는 여기저기 날아다니면서 사람에게 감염 성 질병을 매개한다. ( 일본뇌염, 말라리아 등 )
- 살충제의 주 성분인 프탈트린, 퍼메트린은 액화석유가스이며 다량 흡입 시 비염, 천식, 두통 등의 증상을 유발하고, 발암물질이다.
- 살충제를 쓰지 않고 모기를 쉽게 잡는 방법을 탐색하던 도중 유도하는 방법을 생각하게 되었고, 모기가 흡혈할 개체를 찾을 때 탐지하는 L-lactic acid와 이산화탄 소를 생산하는 유산균을 이용해 모기를 유도하는 탐구를 계획하게 되었다.
○ 연구 목적
- 모기 살충제에 함유된 화학물질은 모기를 잡을 뿐만 아니라 인체와 환경에 피해를 끼칠 수 있다.
- 따라서 이 연구에서는 인체와 환경에 피해를 끼치지 않는 유산균을 이용하여 유산 균의 젖산 생산, 이산화탄소 배출량을 파악하고 모기가 젖산, 이산화탄소에 반응하 는 특성을 고려해 유산균을 사용한 모기 유도 가능성에 대해 탐색하고자 한다.
2. 과제 수행 내용
□ 이론적 배경
○ 유산균 - Lactobacillus
- 당류에서 유산을 생성하는 균류의 총칭이며 운동성이 없고 통성 혐기성이다.
- 유산균은 물질대사에 의해 탄수화물을 젖산으로 분해시키는 후벽균류 세균의 총칭이다.
- 일부 젖산균은 창자 등의 소화기관에 있어, 다른 병원미생물로부터 몸을 지키고, 항상성 유지를 돕는다고 여겨진다.
- 산소가 적은 환경에서 잘 발육하며 각종 당으로부터 젖산을 생성한다.
○ 젖산 - lactic acid
- 카복시기·하이드록시기·메틸기·수소의 네 원자단이 결합한 비대칭 탄소원자를 가지는 유기화합물이다.
- 사람의 혈액 속에는 100mℓ당 5∼20mg이 존재하며, 심한 운동 시 증가한다. 운동에 의한 근육의 피로는 글리코젠의 분해에 의한 L-젖산의 축적과 관계가 있다.
○ 모기 - Culicidae
- 체형은 작고 길며 둥근 머리와 긴 다리가 특징적이고, 흉부는 전, 중, 후흉 중에서 중흉만이 크고 날개가 붙어 있다.
- 모기는 자극성 피부염과 같은 직접 피해의 원인이 될 뿐만 아니라 말라리아, 사상충, 황열 등의 중요한 병원체를 매개하는 역할을 한다.
○ 가정용 살충제의 위험성 ( 피레스로이드계 살충제 )
- 퍼메트린 : 신경세포막의 나트륨 투과성 증가로 중추신경의 과부화를 유발하며 발암물질, 내분비계 장애 추정 물질로 분류
□ 선행 연구
○ 모기 유도 원인 관련 논문
L-lactic acid
- L-lactic Acid : A Mosquito Attractant Isolated from Humans - L-lactic acid : a human-signifying host cue for the anthropophilic
mosquito Anopheles gambiae
→ L-젖산은 모기를 유인하는 물질이다.
CO
2- Targeting a Dual Detector of Skin and CO2 to Modify Mosquito Host Seeking
- Carbon dioxide and 1-octen-3-ol as mosquito attractants
→ CO2는 모기를 유인하는 물질이다.
○ L-lactic acid 생산 유산균 관련 논문
L. rhamnosus
- Efficient production of l-lactic acid from cassava powder by Lactobacillus rhamnosus
- Fermentative production of l-lactic acid from hydrolysate of wheat bran by Lactobacillus rhamnosus
L. paracasei
- A novel lactic acid bacterium for the production of high purity l-lactic acid, Lactobacillus paracasei subsp.
paracasei CHB2121
L. helveticus
- Production of Lactic Acid from Water Hyacinth by Lactobacillus spp.L. casei
- L-lactic acid production by Lactobacillus casei fermentation using different fed-batch feeding strategies
- Effect of tem perature and various nitrogen sources on L(+)-lactic acid production by Lactobacillus casei
→ 위에 나온 유산균은 모두 L-lactic acid를 생산한다.
□ 연구주제의 선정
○ 문제의 착안점
- 살충제를 사용 시 많은 화학성분이 대기에 노출이 되며 환경문제를 발생하고 인체 에 해로운 성분이 두통과 병을 유발하고 여러 악영향을 미친다.
- 유산균은 산의 일종인 젖산을 생산함과 동시에 일부는 이형 젖산 발효를 하므로 이를 모기가 젖산, 이산화탄소에 대해 민감히 반응하는 것과 서로 연관되어 유산균 을 활용한 모기의 유도 가능성이 본 연구를 해결하기 위한 실마리가 된다.
○ 연구를 통한 문제해결 가능성
- 모기는 젖산과 이산화탄소에 대해 민감하게 반응하기 때문에 유산균이 생산하는 젖산과 이형 젖산 발효를 통한 이산화탄소를 통해 유도된다고 판단하였다.
- 유산균을 통해 모기를 유인하여 한 번에 처리하면 친환경적, 인체에 무해 등 여러 방면에서 살충제보다 더 효율적이라고 할 수 있다.
□ 연구내용
○ 연구 1. L-lactic acid를 생산하는 유산균 배양 - 유산균
L. helveticus L. Casei
- MRS는 주로 유산균을 선택적으로 배양하기 위해 개발된 배지다. 따라서 유산균을 배양하기 위해 필요한 배지를 MRS로 선정하게 되었다.
- 유산균 대량 배양을 위해 액체 배지인 MRS 부용액을 사용할 것이다.
- 배양한 유산균이 젖산이 생산하는 지를 확인하기 위해서 유산균을 배양하기 전과 배양한 후의 배지의 산도를 각각 pH시험지를 이용하여 측정하고 비교해본다.
- 배양한 유산균이 이산화탄소를 생성하는 지를 확인하기 위해 밀폐된 정육면체 아크릴 통에 이산화탄소 검출기와 유산균이 배양된 배지와 함께 넣어두고 약 3시간정도 후에 아크릴 통 안의 이산화탄소 양을 확인한다.
○ 연구 2. L-lactic acid를 생산하는 유산균을 이용한 모기 유도 가능성 실험
- 아크릴 통은 십자 모양으로 하여 모기가 정확히 어디로 끌리는지 파악할 수 있게끔 설계하였다.
- 모기 50마리를 십자 모양 아크릴 통의 가운데에 놓고 변인들을 각 방에 놓은 뒤 시간이 지난 후 모기의 이동 양상을 관찰하고 이를 총 5번 반복한다.
- 유산균이 젖산과 이산화탄소를 생산하는 것은 알려진 사실이기 때문에, 유산균을 사용하기보다는 통제하기가 더 쉬운 젖산과 이산화탄소를 직접 사용하였다.
- 유산균(Lactobacillus casei)과 시중에 사용되는 모기 유인 방법인 흑설탕, LED를 조작변인으로 설정하여 유산균의 모기유도 효율성을 확인하고자 했다.
CO2 젖산 CO2 + 젖산
[ 표 1. 조작변인 1 ]
LED 유산균 흑설탕
[ 표 2. 조작변인 2 ]
[ 그림 1. 조작변인 1 ] [ 그림 2. 조작변인 2 ]
□ 가설 설정
○ 연구 1. L-lactic acid를 생산하는 유산균 배양
- 배양한 유산균이 젖산과 이산화탄소를 생성할 것이다.
○ 연구 2. L-lactic acid를 생산하는 유산균을 이용한 모기 유도 가능성 실험
- 유산균이 생산하는 젖산과 이산화탄소에 모기가 유도될 것이다.
- 유산균을 이용한 모기트랩이 다른 모기트랩과 비교하면 더 많은 모기를 유도 할 것이다.
□ 연구 방법
- 균의 대량증식을 위한 액체배지 사용
- clean bench, 알코올을 이용한 멸균상태
- 유산균의 효율적인 배양을 하기 위한 인큐베이터 사용
- 마이크로피펫의 정확한 수치 측정
□ 연구 활동 및 과정
○ 연구 1. L-lactic acid를 생산하는 유산균 배양
L. helveticus L. Casei
※ 아래의 실험은 모두 Clean bench에서 무균 상태로 진행된다
준비물
Clean bench 삼각플라스크 위생장갑 정제수
알코올램프 MRS broth 알코올 마이크로피펫
앰플커터기 균주 샘플 파라필름 인큐베이터
[ 표 1. 연구 1. 준비물 ]
① 동 결 건 조 된 샘 플 (L .c a s e i, L .h e lv e tic u s )이 담 겨 있 는 앰 플 을 앰 플 커 터 기 를 이 용 해 중 앙 부 분 에 흠 집 을 낸 다 .
[ 사진 1. 앰플커터기 사용 ]
② 알코올 거즈로 흠집 부분을 닦아 멸균하고 알코올이 다 마를 때까지 기다린다.
[ 사진 2. L. helveticus 앰플 멸균 ] [ 사진 3. L. Casei 앰플 멸균 ]
L. helveticus L. Casei
③ 흠집이 몸의 바깥쪽을 향하게 하고 앰플을 부러뜨린다.
[ 사진 4. L. helveticus 앰플 절단 ] [ 사진 5. L. Casei 앰플 절단 ]
L. helveticus L. Casei
④ 샘플이 담겨있는 부분의 입구를 화염 멸균해준다.
[ 사진 6. L. helveticus 앰플 화염 멸균 ] [ 사진 7. L. Casei 앰플 화염 멸균 ]
⑤ 마이크로 피펫을 이용해 무균증류수 0.4 ml을 샘플에 넣어주고 샘플을 풀어준다.
[ 사진 8. L. helveticus 재생 ] [ 사진 9. L. Casei 재생 ]
L. helveticus L. Casei
⑥ 용해된 샘플 중 0.2 ml을 1번 실험에 서 만든 액체배지에 넣어주고 파라 필름으로 밀봉한 뒤 인큐베이터에서 36.5℃로 일주일 배양한다.
[ 사진 10. 유산균 배양 ]
⑦ 남은 샘플은 각각 멸균된 튜브에 넣고 4°C에서 보관한다.
[ 사진 11. 남은 샘플 보관 ]
○ 연구 2. L-lactic acid를 생산하는 유산균을 이용한 모기 유도 가능성 실험
① 모기를 넣을 가운데 상자에 4개의 구멍을 뚫는다.
② 유리관을 이용해 4개의 상자를 가운데 상자에 잇는다.
③ 각 3개의 상자에 CO2,젖산,젖산과 CO2를 넣고 1개의 상자에는 아무것도 넣지 않는다.
④ 가운데 상자에 모기를 넣고 3분 동안 모기들의 움직임을 기록한다
⑤ 첫번째 실험이 끝나면 모기를 다시 가운데 상자로 옮긴다
⑥ led트랩,유산균 트랩,흑설탕이 각각 들어있는 3개의 상자와 아무것도 없는 1개의 상자를 가운데 상자에 잇는다.
⑦ 모기들의 움직임을 3분 동안 기록한다.
○ 월별 연구 추진 실적
주요 활동 시 기 비 고
사전연구 수행 11월 ~ 2월
L. rhamnosus을 이 용 한 초 파 리 유 도 의 효 율 성 탐 구 선행연구(논문) 및 사전자료 조사 11월 ~ 3월
물품 구입 및 실험 준비 4월 ~ 5월
모기 배양 4월 ~ 5월
유산균 배양 6월
배양한 유산균의 젖산 생성 확인 6월
배양한 유산균의 이산화탄소 생성 확인 6월 ~ 7월 유산균을 이용한 모기 유도 가능성 실험 6월 ~ 7월 연구 결론 도출 및 해석 7월 ~ 8월 연구 결과 보고서 작성 7월 ~ 11월
3. 연구 결과 및 향후 계획
□ 연구 결과
○ 연구 1. L-lactic acid를 생산하는 유산균 배양
- 배양액의 pH가 6에서 5로 변한 것을 보아 유산균에서 생산된 젖산에 의해 pH가 낮아졌다고 판단하였다.
- L. Casei 를 배양한 배지의 입구를 막았던 파라핀 필름이 찢어진 것을 보아 이산화탄소가 생산되었다고 판단하였다.
< pH 시험지 >
○ 연구 2. L-lactic acid를 생산하는 유산균을 이용한 모기 유도 가능성 실험
- 장구벌레에서 모기로 배양된 수가 너무 적었고 모기를 아크릴 통으로 옮기는 과정에서 모기가 탈출을 했기 때문에 4마리로 밖에 실험을 진행할 수밖에 없었다.
CO2 젖산 CO2 + 젖산 -
모기 수 0 0 2 1
- 실험을 진행한 모기의 수가 너무 적기 때문에 유도가 효과적이라고 판단 할 수 없다.
< 모기 배양 >
□ 시행착오
- 유산균(L.Casei)을 배양할 때 생산되는 이산화탄소로 인한 기체 부피 증가로 파라핀 필름이 찢어져 다른 세균들도 함께 배양돼 다시 배양했었다.
- 흑설탕을 이용하여 주변 산에서 모기 채집을 하려 했으나 개미 등의 다른 곤충만 잡혔다.
- 장구벌레 배양까지는 성공했으나 기록적인 고온의 기온과 급격한 기온 변화로 인해 모기 배양 환경을 잘 갖추지 못해 모기가 실험 도중 사망하여 실험을 제대로 진행할 수 없었다.
□ 시사점
- 대부분의 모기 트랩은 LED를 이용했기 때문에 수면을 방해할 수 있다는 것을 알 게 되어 이 문제점들을 보완하는 친환경적인 트랩을 만들자는 생각을 하게 되었 다. 하지만 고려하지 못한 시행착오로 실험에 실패해서 연구를 계속 이어가지 못 한 것이 아쉽다. 후에 같은 주제로 다시 연구를 진행하게 된다면 실패한 경험을 바탕으로 빈틈없는 연구를 진행할 것이다.
□ 향후계획
○ 후속연구
- 본 연구에서 유산균을 이용한 모기 유도 능력이 입증시켜, 이러한 능력에 대해 증진할 방안을 연구하고 본 연구에서 유산균이 미치는 유도범위와 효과를 더욱더 늘리는 방법 을 고안한다.
- 유산균에서 나는 고약한 냄새 대신 향기로운 냄새로 바꾸는 방안에 대해 연구하여 더 실용적으로 유산균을 이용할 수 있도록 한다.
- 모기만 유도할 게 아니라 다른 해충도 유도될 수 있는지 확인하여 유도 가능한 해충 범위를 넓힌다.
- 해충이 더 잘 유도될 수 있는 디자인과 소비자들이 거리낌 없이 볼 수 있는 디자인을 고려하여‘해충 전용 트랩’을 개발한다.
4. 참고문헌
- Fred Acree Jr.,R. B. Turner, H. K. Gouck, Morton Beroza, Nelson Smith.
L-Lactic Acid: A Mosquito Attractant Isolated from Humans.
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- Jullihar, Randy; Noh, Yong Ho; Park, Hye Min; Yun, Hyun Shik.
Production of Lactic Acid from Water Hyacinth by Lactobacillus spp.
Volume 31, Issue 1, 2016, pp.85-89.
- Limin Wang, Bo Zhao, Bo Liu, Chunyu Yang, Bo Yu, Qinggang Li, Cuiqing Ma, Ping Xu, Yanhe Ma.
Efficient production of l-lactic acid from cassava powder by Lactobacillus rhamnosus.
Volume 101, Issue 20, October 2010, Pages 7895-7901.
- M. Hujanen, Y.-Y. Linko.
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- Se-Kwon Moon, Young-Jung Wee , Gi-Wook Choi.
A novel lactic acid bacterium for the production of high purity l-lactic acid, Lactobacillus paracasei subsp. paracasei CHB21210.
Volume 114, Issue 2, August 2012, Pages 155-159.
- Shaofeng Ding, Tianwei Tan.
l-lactic acid production by Lactobacillus casei fermentation using different fed-batch feeding strategies.
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- Takken W, Kline DL.
Carbon dioxide and 1-octen-3-ol as mosquito attractants.
01 Sep 1989, 5(3):311-316
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- Zheng Li a, b, Lu Han a, Yizhi Ji a, c, Xiaonan Wang a, Tianwei Tan a.
Fermentative production of l-lactic acid from hydrolysate of wheat bran by Lactobacillus rhamnosus.
Volume 49, Issue 1, 15 March 2010, Pages 138-142.
