Anti-Oxidative and Anti-Inflammatory Activities of Cotoneaster horizontalis Decne Extract

(1)

Cotoneaster horizontalis Decne 추출물의 항산화 및 항염증 활성

이지영¹, 진경숙¹, 권현주^1,2, 김병우^1,2*

1동의대학교블루바이오소재개발및실용화지원센터

2동의대학교생명응용학과

Received: July 31, 2015 / Revised: September 2, 2015 / Accepted: September 2, 2015

생명체는산화촉진물질과산화억제물질이균형을이뤄생 체내항상성을유지하고있으나

^,

다양한외부요인들로인 해이러한균형상태를잃고산화가촉진되는방향으로기 울게되면체내에산화적스트레스

(oxidative stress)

가유발 되어세포손상및질병을일으키게된다

^.

이러한산화적스

트레스의 직접적 원인이 되는 활성산소

(reactive oxygen

species,

이하

^ROS)

는화학적으로불안정하고반응성이높 아

^DNA,

단백질

^,

지질

^,

탄수화물과같은생체내고분자물 질과쉽게반응할수있으며

,

세포와조직에비가역적인손 상을일으켜돌연변이

^,

세포독성

^,

암등을유발하게된다

^[1, 5, 11, 21, 22].

대표적인

cellular defensive phase 2 detoxifying antioxidant enzyme

으로알려진

heme oxygenase (HO)-1

의유도는산화 적 스트레스를 방어하는 중요한 기전 중 하나로 다양한

carcinogen

으로부터세포를보호하는

chemoprevention

에중 요한역할을담당하는것으로알려져있으며

^,

특히천연에서

유래한다양한

dietary phytochemical

은

nuclear factor E2- related factor 2 (Nrf2)

에의해조절되는

phase 2 detoxifying antioxidant enzyme

의발현증가를통해

chemopreventive function

을나타낸다

^{[4, 31].}

이러한

chemoprevention

은항 산화활성을기초로하여암뿐만아니라염증

^,

뇌및심혈 관계질환

^,

노화등의예방및치료기전과도상호작용하는 것으로알려져있어그중요성이커지고있다

[2, 12, 25, 29].

염증은외부자극에대한생체조직의주요방어기전이나 지속적인염증반응은조직의손상을초래하여암을비롯한

각종질병을유발한다

^{[3, 6].}

생체내염증반응은대식세포

(macrophage)

에서과량생산되는염증매개인자

(inflammatory mediators)

로부터유래되는데

inducible nitric oxide synthase (iNOS)

로부터생산되는

nitric oxide (NO)

와

cyclooxygenase 2 (COX-2)

로부터생산되는

prostaglandin E2 (PGE2)

등이대 표적이다

^.

외부자극에의해과량생산된염증매개인자는

tumor necrosis factor

α

, interleukin 1

β등과같은 사이토

카인을생산하여염증반응을일으킨다

^{[12, 13].}

염증반응의

대표적인 세포 실험계 중 하나인

RAW 264.7 murine

macrophage

에

lipopolysaccharide (LPS)

와같은염증유발 인자를처리하면

^iNOS

및

^COX-2

의발현유도에의해

^NO Anti-Oxidative and Anti-Inflammatory Activities of Cotoneaster horizontalis Decne Extract

Ji Young Lee

¹

, Kyong-Suk Jin

¹

, Hyun Ju Kwon

^1,2

, and Byung Woo Kim

^1,2*

1

Blue-Bio Industry Regional Innovation Center,

²

Department of Life Science and Biotechnology, College of Natural Science &

Human Ecology, Dong-Eui University, Busan 47340, Republic of Korea

Anti-oxidative and anti-inflammatory activities of Cotoneaster horizontalis Decne ethanol extract (CHEE) were evaluated.

CHEE possessed a potent scavenging activity against 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl, which was similar to the activity of ascor- bic acid which was used as a positive control. CHEE also effectively suppressed hydrogen peroxide-induced reactive oxygen species on RAW 264.7 cells. Furthermore, CHEE induced the expression of the anti-oxidative enzyme heme oxygenase 1, and its upstream transcription factor, nuclear factor-E2-related factor 2. CHEE inhibited LPS induced nitric oxide (NO) formation as a consequence of inducible NO synthase (iNOS) down regulation. Taken together, these results provide us with an important new insight; that C. horizontalis possesses anti-oxidative and anti-inflammatory activities. Therefore, C. horizontalis may be uti- lized as a promising material in the field of nutraceuticals.

Keywords: Cotoneaster horizontalis, anti-oxidative, anti-inflammatory

*Corresponding author

Tel: +82-51-890-2900, Fax: +82-505-182-6951 E-mail: [email protected]

© 2015, The Korean Society for Microbiology and Biotechnology

(2)

와

^PGE2

등염증매개인자의생성및이를통한사이토카 인분비량증가를확인할수있다

[17, 19, 26].

그러므로이 러한염증매개인자의생성을효과적으로제어할수있는물 질들이염증의예방및치료를위한소재로서각광받고있 으며이에따라최근많은연구들이항산화및항염증활성 을바탕으로한생리활성보유신소재개발및그활성기전 의규명에주력하고있다

^.

특히천연유래소재로부터유용성 분을추출하고생리활성을규명하여기능성소재로서의가 능성을타진하는연구가활발히이루어지고있다

[14, 15, 23].

Cotoneaster horizontalis Decne

는장미과에속하는반상 록또는낙엽성관목으로홍자단이라고도불린다

^.

아시아

^,

북 아메리카

^,

유럽등의온대지역에약

⁵⁰

여종이분포하며

^,

보

통

^{1 m}

내외로자라는데

^,

가지는낮은포복으로덩굴모양으

로늘어지며

^,

윤기있는잎이달린다

^{. 5}

−

⁶

월에연분홍의꽃 을피우며

^{, 9}

−

¹⁰

월에열매를맺는다

^. C. horizontalis

의현재 까지보고된생리활성으로는

Mohamed

등이이집트에서재 배된

C. horizontalis

지상부의주요성분과점액질의항당 뇨및항이상지질혈증효과를보고하였고

[18], Sokkar

등이 이집트에서수집한

C. horizontalis

가지에탄올추출물의항 산화

^,

항암및간보호효과를보고하였으며

[24], Khan

등은

C. horizontalis

전초의메탄올추출물의분획으로부터분리 한콜린에스터라아제억제제에대해보고한바있다

^[10].

현 재까지

C. horizontalis

의규명된생리활성은상기의연구결 과뿐이며그구체적인작용기작에대한연구

^,

특히항산화 및항염증효과에대한연구는매우미흡하다

^.

이에본연구 에서는천연에서유래한생리활성보유신소재개발의일환 으로

C. horizontalis 95%

에탄올추출물

^(CHEE)

이보유한 항산화및항염증활성과그작용기작을분석함으로써기 능성소재로서의활용가능성을확인해보고자하였다

^.

본연구에사용한시료는한국생명공학연구원

^,

해외생물 소재허브센터에서구입

⁽

분양번호

FBM123-004)

하여사용하

였다

^.

건조 및분쇄한 시료를

^95%

에탄올을용매로 하여

45

^o

C

에서

³

일간초음파추출을수행하였다

^.

추출이끝난시 료를

^filter

로여과하여고형물을없애고감압농축

^(N-1000SW, EYELA, Japan)

및 동결건조

(FDU2100, EYELA, Japan)

하여사용전까지

⁴

^o

^C

에보관하였다

^.

항산화작용의주요기전중하나인전자공여능은인체내 에서 생성되는

free radical

의 전자를 공여함으로써

^free

radical

에의한노화와질병을억제한다

^.

항산화작용의주

요지표로서의전자공여능은특히천연물이보유한항산화 능의측정에많이사용되고있으며

[5], 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl (DPPH) radical

소거능분석을이용하여측정하였 다

^{. DPPH}

는비교적안정한

free radical

로써

, ascorbic acid, tocopherol, polyhydroxy

방향족화합물

^,

방향족아민류에의 해환원되어짙은자색이탈색되는원리를이용하여항산화

활성을간단히측정할수있는동시에식물체의항산화활 성과도연관성이매우높기때문에많이이용되고있는방 법이다

[9]. DPPH radical scavenging activity

측정을위해

CHEE

를농도별

(0.1024-12.8

μ

^g/ml)

로메탄올에녹여준비 하고

96 well plate

에메탄올에용해된

^1.5

×

¹⁰

^-4

^{M DPPH} 40

μ

^l

와각시료

¹⁶⁰

μ

^l

를분주한혼합액을실온에서

³⁰

분 간반응시킨후

, multi-plate reader (Paradigm, Beckman, CA, USA)

를이용하여

^{520 nm}

에서흡광도를측정하였다

^.

시

료를첨가하지않은음성대조군의흡광도와비교하여

^free

radical

소거 정도를 백분율로 나타내고

^{, 50%}

저해 농도

(Inhibitory Concentration, IC

₅₀

)

를계산하였다

^.

대표적인항

산화제로

DPPH radical

소거활성측정시양성대조군으

로주로사용되는

ascorbic acid

를함께비교분석하였다

^.

항산화및항염증활성의세포실험은

murine macrophage cell line

인

^{RAW 264.7}

을

American Type Culture Collection (ATCC

^®

, VA, USA)

로부터구입하여

10% fetal bovine serum (FBS, Invitrogen Corporation, CA, USA)

및

penicillin/

streptomycin (Invitrogen)

이포함된

^DMEM

배지

(Invitrogen)

에 서배양하여수행하였다

^[20].

활성분석수행전먼저시료 가세포생존율에미치는영향을확인함과동시에세포독성

을유발하지않는시료의처리농도를결정하기위해

^CHEE

에의한세포독성유발유무를

^{WST assay}

를통해수행하

였다

^{. 1.0}

×

¹⁰

⁵

^cell

을

24-well tissue culture plate

에분주 하여

²⁴

시간동안부착시키고

^{, EPEE}

처리

²⁴

시간후

^WST

시약

(Daeil Lab Service, South Korea)

이든배지로교체하 여한시간동안반응시킨다음

multi-plate reader

를이용 하여

^{450 nm}

에서흡광도를측정하였다

^.

ROS

는과량생산시

^DNA,

단백질

^,

지질을포함한생체내 분자에산화적인변형을유발하여다양한질병의원인이되

므로

^ROS

소거능은항산화능의중요한지표로활용된다

^[16].

Hydrogen peroxide (H

₂

O

₂

)

는대표적인

^ROS

중하나로항산 화능분석을위한많은연구에서산화적스트레스유발제로 사용되고있다

[27, 28, 30].

본연구에서는

^CHEE

가보유한 항산화능을

^H

2

O

₂로유도한

^ROS

생성에미치는영향을통 해분석하였다

^.

이를위해

RAW 264.7 cell

에

cell permeable fluorescent dye

인

⁵⁰

μ

^M

의

dichlorofluorescin diacetate (DCFH-DA, Sigma-aldrich, MO, USA)

를

²

시간동안전처 리한후제거하고

⁵⁰⁰

μ

^M

의

^H

2

O

₂를농도별시료와함께처 리한후시료에의한

^ROS

생성억제능을

multiplate reader

를이용한

fluorescence

측정을통해분석하였다

^.

CHEE

의항산화활성기전을알아보기위해대표적인항

산화효소인

^HO-1

과그전사인자인

^Nrf2

의시료처리에의 한단백질발현변화를

Western blot hybridization

으로분 석하였다

^{. HO-1}

의일차항체는

Cell Signaling Technology

(MA, USA)

로부터구입하였고

^{, Nrf2}

와

^Actin

의일차항체와

(3)

anti-goat

와

anti-rabbit

등의 이차항체는

Santa Cruz Biotechnology (CA, USA)

에서구입하여사용하였다

^.

시료

처리가 끝난 배양 세포에서 단백질을추출하여

^Bradford

assay

로단백질농도를 결정한후

⁵⁰

μ

^g

의단백질을

^10%

sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)

로전기영동하고

nitrocellulose membrane

에

blotting

한후

^1:1,000

−

^5,000

으로희석한대상단백질의일 차항체와

hybridization

하였다

. Membrane washing

후

^horse radish peroxidase (HRP)

가부착된이차항체

^(1:1,000)

로한 시간 동안반응시키고

chemiluminescence detection system (FluoChem

^®

FC2, AlphaInnotech, USA)

을이용하여단백 질발현을분석하였다

^.

대표적인

free radical

중하나인

^NO

는생체내에서중요 한세포신호전달물질로서작용하나과잉생산시산화적스 트레스의유발을통해염증및세포손상의원인이된다

^[8].

이러한

^NO

생성억제능의분석은

^Park

등

^[20]

의방법을변 형하여 수행하였다

. RAW 264.7 cell

을

24-well tissue culture plate

에

^well

당

^1.0

×

¹⁰

⁵

^cell

을

^seeding

하여부착 시킨후

¹

μ

^g/ml

의

^LPS

를처리하여

^NO

생성을유도하고시 료에의한

^NO

생성저해능을

Griess reaction

을통해분석 하였다

. 96-well plate

에세포배양액상층

¹⁰⁰

μ

^l

를분주하 고

⁵⁰

μ

^l

의

sulphanilamide (1% in 5% phosphoric acid)

와

50

μ

^l

의

naphthynaphthylene dihydrochloride (0.1%)

를섞 은후실온에서

¹⁰

분간반응시켰다

. Multiplate reader

를사 용하여

^{550 nm}

에서 흡광도를 측정하고

sodium nitrite

(NaNO

₂

)

를단계희석한표준액으로표준정량선을그린후

NO

생성량을계산하였다

^.

실험에사용한시약은모두

^Sigma

에서구입하여사용하였다

^.

또한

^CHEE

가보유한

^NO

생성 억제능의기전을 밝히기 위해

^NO

생성의 핵심 단백질인

iNOS

의단백질발현을분석하였다

. Western blot hybridization

을 위한

^iNOS

의 일차항체는

Cell Signaling Technology

(MA, USA)

로부터구입하여사용하였으며분석과정은상

기

^HO-1

및

^Nrf2

의경우와같다

^.

모든실험결과는최소

³

회이상의반복실험을통하여얻 은 데이터를 평균

^(mean)

± 표준편차

(standard deviation, SD)

로나타내었고

^,

필요시대표적인그림이나데이터를제 시하였다

^.

각데이터의통계분석은

SPSS 20.0 software

를 이용한

unpaired Student’s t-test

를통해

p

값이

^0.05

미만

( p < 0.05)

인경우유의성이있는것으로판단하였다

^.

이상의실험을통한

^CHEE

의항산화능및항염증생리활

성의분석결과는다음과같다

^.

먼저

^CHEE

의항산화능보

유유무및그정도를알아보기위해항산화능의주요지표 중하나인

DPPH radical scavenging activity

를분석한결 과

^CHEE

의농도증가에따른강한

^radical

소거능을보여

0.1024, 0.512, 2.56, 12.8

μ

^g/ml

의시료처리에의해

^DPPH

radical

소거능이각각

26.82, 34.25, 66.21, 96.99%

로나타 나

^50%

소거농도를나타내는

^IC

50값이

^1.52

μ

^g/ml

로양성 대조군으로사용한

ascrobic acid,

즉

^{vitamin C}

의

^IC

50값인

1.53

μ

^g/ml

와유사한정도의높은활성을보여매우강한항 산화능을보유함을확인하였다

(Table 1).

이는앞서

^Sokkar

등이보고한결과에서와유사하게농도의존적인활성의증 가를보였으나더낮은농도에서더높은활성을나타내었 다

^[24].

이와 같이

DPPH radical scavenging activity

분석

을통해

^CHEE

가보유한높은항산화능이확인됨에따라그

작용기전을좀더자세히알아보기위해

^CHEE

가보유한

항산화능의정도및기전을세포수준에서확인하고자하 였다

^.

CHEE

의세포수준에서의생리활성을분석하기전먼저

시료가세포생존율에미치는영향을

RAW 264.7 cell

에서

분석한결과

⁰

−

²⁰⁰

μ

^g/ml

의

^CHEE

처리에의해세포독성 이일어나지않음을확인하였다

(Fig. 1A).

또한

^{RAW 264.7} cell

에대표적인산화적스트레스유도인자인

^H

2

O

₂를처리 하여

^CHEE

에의한

ROS scavenging activity

를분석한결 과

^H

2

O

₂ 단독처리에 의해 유도되는과량의

^ROS

생성이

CHEE

의병용처리에의해효과적으로저해되는것으로나 타나

^CHEE

가

DPPH radical

뿐만아니라세포실험계에서

H

₂

O

₂에의해유도된산화적스트레스또한효과적으로감소 시킴을확인하였다

^{(Fig. 1B).}

강한항산화능을보유한천연유래소재들이

^Nrf2

에의한 항산화효소계의발현유도를통해활성을나타낸다는것이

여러연구를통해밝혀짐에따라

^CHEE

가보유한항산화능

의작용기작을알아보고자하였다

^{[7, 25].}

이를위해대표적 인항산화효소로천연물에의한항산화활성에의해주로

발현이유도되는

^HO-1

과그상위전사인자인

^Nrf2

의단백

질발현에

^CHEE

가미치는영향을분석한결과

⁶

시간동안

10

−

⁵⁰

μ

^g/ml

의시료처리에의해

^HO-1

과

^Nrf2

의단백질발

현이증가되는것으로나타났다

^{(Fig. 1C).}

CHEE

가항산화능뿐만아니라항염증활성또한보유하

는지를알아보기위해

^NO

생성에미치는효과를알아보았

Table 1. DPPH radical scavenging activity of CHEE.

Reagent Concentration ( µg/ml)

Inhibition rate (%)

CHEE 0.1024

0.512 26.82 ± 0.07 34.25 ± 0.25

2.56 66.21 ± 0.35

12.8 96.99 ± 0.13

Ascorbic acid (Positive control)

0.512 19.79 ± 0.23

2.56 12.8

80.38 ± 0.21

97.59 ± 0.16

(4)

다

^{. LPS}

로자극을유도한쥐대식세포주

RAW 264.7 cell

에

서농도별

^CHEE

의처리에따른

^NO

생성양의변화를분석

한결과

¹⁰

−

⁵⁰

μ

^g/ml

의시료처리에의해농도의존적인

^NO

생성저해능을보였으며이는

^NO

생성단백질인

^iNOS

의발

현저해에서기인하는것으로나타났다

^{(Fig. 2).}

이러한결과

를통해

^CHEE

가산화적스트레스뿐만아니라염증성자

극에대한방어능또한보유함을확인하였다

^.

한편

^CHEE

의

처리는

^iNOS

의단백질 발현은유의적으로 감소시켰으나

COX-2

의발현에는영향을주지않았다

(data not shown).

이상의결과를통해

C. horizontalis

가항산화능과항염증 활성을보유함을세포수준에서처음으로확인하였으며

^,

이

러한결과는신규소재에대한새로운기능성데이터를구 축함과동시에향후생리활성보유기능성소재로서의활용 을위한근거자료로이용될수있을것이다

^.

후속연구를통 해

C. horizontalis

의활성성분을분리함과동시에각생리 활성의상위신호전달경로의규명이필요할것으로판단된다

^.

요 약

Cotoneaster horizontalis Decne

에탄올추출물

^(CHEE)

의 항산화능과항염증생리활성을분석하였다

^{. CHEE}

의항산 화능을

DPPH radical scavenging activity

로 분석한결과

radical

소거능의정도가양성대조군으로사용한

^ascorbic

acid

와유사한정도의높은활성을보여매우강한항산화능

을보유함을확인하였다

^.

또한

RAW 264.7

세포주를이용하 여

^H

2

O

₂유도에의해생성된

^ROS

에대한소거능을분석한 결과에서도강한소거능을보였다

^.

뿐만아니라항산화효소

HO-1

및그전사인자인

^Nrf2

의단백질발현이

^CHEE

의처 리에의해 증가되었다

^.

한편

^CHEE

가

^LPS

에의해 유도된

NO

생성에미치는영향을분석한결과농도의존적인

^NO

생

성저해능을보였으며이는

^NO

생성단백질인

^iNOS

의발

Fig. 1. Effect of CHEE on cell viability (A), H

₂

O

₂

-induced ROS scavenging activity (B), modulation of an anti-oxidative enzyme, HO-1 and its upstream transcription factor, Nrf2 pro- tein expression (C) in RAW 264.7 cells. (A, B) Values are rep- resented as the mean ± SD (n = 3). (B) *, # Significantly different from the vehicle control [0, H

₂

O

₂

( −)] and H

2

O

₂

- induced control [0, H

₂

O

₂

(+)], respectively (p < 0.05). (C) Actin was used as an internal control.

Fig. 2. Modulation of CHEE on LPS-induced NO formation (A)

and iNOS protein expression (B) in RAW 264.7 cells. (A) Val-

ues are represented as the mean ± SD (n = 3). *, # Significantly

different from the vehicle control [0, LPS ( −)] and LPS-induced

control [0, LPS (+)], respectively (p < 0.05). (B) Actin was used as

an internal control.

(5)

현저해에서기인함을확인하였다

^.

이러한결과를통해

C. horizontalis

의항산화능과항염증활성을세포수준에서처

음으로확인하였으며향후기능성소재로서유용하게활용 될수있을것으로판단된다

^.

Acknowledgments

This work was supported by Blue-Bio Industry Regional Innova- tion Center (RIC08-06-07) at Dong-Eui University as a RIC pro- gram under Ministry of Trade, Industry and Energy (MOTIE) and Busan city.

References

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