암 진단을 위한 마이크로/나노진단기기 개발

대한소화기학회지 2007;49:280-286 □ REVIEW □

서 론

최근 들어 나노기술이 주목을 받기 시작하면서 연구의 관 심을 끌게 된 부분이 생명과학(life science) 또는 의료(me- dical) 기술과 이들 나노기술의 융합이다. 이것은 정밀, 신속, 정확한 진단 및 분석을 요하는 기술적인 필요에 기인한 부 분이 있기는 하지만 가장 크게는 나날이 진보하고 있는 생 물학적인 발견 - 예를 들면 인간 유전자의 해독, 1백만 개 종류 이상이 존재할 것으로 생각되는 혈액 내 단백질 중 극 미량(pico gram 또는 그 이하의 농도)의 질병 관련 단백질 마커의 발굴 연구 등 - 을 기존의 기술로는 더 이상 수용 할 수 있는 효율적인 방법의 부재 때문이기도 하다. 이와 같 은 기술적인 필요성에 의하여 나노기술과 생명과학(바이오)

기술의 융합기술인 나노바이오기술(nano-bio technology, NBT)이 관심의 대상으로 떠오르게 되었다. 이러한 나노바 이오 연구는 나노기술을 생명과학 연구에 응용하는 것과 생 명현상 및 생체고분자물질을 나노기술 개발에 이용하는 것 으로서, 나노재료, 나노가공(nano electro mechanical systems, NEMS/micro electro mechanical systems, MEMS), 나노공정, 나노제어, 나노계측 등 다양한 나노기술을 생명과학 연구 및 나노진단분석기 분야의 개발에 응용하는 것이라고 할 수 있다. 이들 나노기술을 접목함으로써 보다 비침습적이면서 도 병열, 고속, 그리고 원격진단이 가능한 휴대형 개인 진단 (point of care) 시스템의 구현을 가능하게 하는 것이 큰 장점 이라 할 수 있다. Fig. 1은 기존의 멤브레인을 이용한 정성 적인 분석만이 가능한 고속(rapid) 진단 킷(kit)을 발전시켜

암 진단을 위한 마이크로/나노진단기기 개발

나노바이오연구센터, 지능형마이크로시스템사업단(21세기 프론티어연구개발사업, 산업자원부)*, 한국과학기술연구원

윤대성·강지윤·김태송*

Development of Micro/Nano Devices for Cancer Diagnosis

Microsystem Research Center, Intelligent Microsystem Center (21^stC Frontier Research Program, MOCIE)*, Korea Institute of Science and Technology, Seoul, Korea

In order to rapidly detect and analyze the presence of a target ligand of interests in environmental or industrial fluids as well as biological samples, numerous test systems have been designed and developed, which have been based on the combination of a test reagent and absorbing paper or membrane. The main limitations of these conventional devices are the difficulty of quantitative or semi-quantitative detection and poor detection limit (around nanogram/ml range detection capability). In this paper, new approaches and research trends which use nano/MEMS (micro electro mechanical systems) technology is introduced, which has a concept of fast, precise, and massive diagnosis and analysis of target molecules using very small amount of samples. (Korean J Gastro- enterol 2007;49:280-286)

Key Words: Cancer diagnostics; Micro electro mechanical systems; Nano technology; Detection technology

연락처: 김태송, 136-791, 서울시 성북구 하월곡동 39-1 지능형마이크로시스템사업단, 한국과학기술연구원 Tel: (02) 958-5564, Fax: (02) 958-6909

E-mail: tskim@kist.re.kr, tskim@microsystem.re.kr

* 이 연구는 산업자원부 21세기 프론티어연구개발사업 지능 형마이크로시스템사업(MS-01-133-01)과 성장동력사업 단 백질칩개발사업의 지원으로 수행된 것임.

Correspondence to: Tae Song Kim, Ph.D.

Intelligent Microsystem Center, Korea Institute of Science and Technology, 39-1, Haweolgok-dong, Seongbuk-gu, Seoul 136- 791, Korea

Tel: + 82-2-958-5564, Fax: + 82-2-958-6909 E-mail: tskim@kist.re.kr, tskim@microsystem.re.kr

윤대성 외 2인. 암 진단을 위한 마이크로/나노진단기기 개발 281

처음으로 마이크로채널(micro channel) 개념을 도입한 Bio- site Diagnostic Incorporated사의 심근경색 진단 소자의 상, 하 부로 분리된 내부 모습을 보여주고 있다. 오른쪽의 샘플 로 딩 부분으로부터 마이크로 채널로 이루어진 캐필러리를 따 라 샘플이 이동할 수 있도록 되어 있고 중간에 이들 플로우 를 조절하기 위한 여러 모양의 채널 게이트가 구성되어 있 다. 이 진단 킷의 핵심은 분석샘플의 재현성 있는 바인딩을 어렵게 하는 멤브레인이 없으며 정량분석 시 필요한 파이펫 을 이용한 샘플의 로딩이 필요없다는 점이다. 이는 흡수성 이 없는 플라스틱 재료를 이용한 마이크로채널을 재현성 있 게 제작할 수 있는 MEMS 기술 덕분으로 비특이적인 반응 을 최소화하면서 반응면적을 최대화하여 측정감도와 반응 시간을 단축시켰다. 이 칩은 칩 자체에 파이펫 기능, 유체를 조절하는 이송기능, 인큐베이션 기능, 분리기능, 워싱(wash- ing) 기능을 포함한 에세이 공정의 개개의 스텝을 모두 포함 하고 있는 신개념 소자라 할 수 있다.

이처럼 극미량의 혈액 또는 기타 인체의 체액으로부터 병 변을 보다 간편하고 빠르게 진단하기 위한 목적의 나노진단

Fig. 2. Separation of SDS-protein and dsDNA in nano channel. (A) Operation overview, (B) free energy diagram, (C) SEM image: 1 dimensional nanochannel array, (D) separation of 3 different proteins using nano-filter chip, (E) Separation of SDS-Protein (1:cholera toxin subunit B (11.4 kKDa), 2:lectin phytohemagglutinin-L (120 kDa), 3:low density human lipoprotein (179 kDa), and (F) dsDNA separation (1:50 bp, 2:150 bp, 3:300 bp, 4: 500 bp, 5:766 bp).

SEM, standard error of the mean.

Fig. 1. Inside view of myocardial infarction diagnostic device (Bio- site Diagnostic Incorporated), and magnified view of inside microstructure fabricated using micro injection molding method.¹

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분석기는 암과 같이 조기 발견이 중요한 병변의 진단을 위 하여 사용할 수 있다. 이러한 목적의 시스템에 고려해야 할 사항은 앞의 Biosite 진단 칩(chip)처럼 크게 샘플 채취 및 전 처리, 이들 샘플의 이송 및 반응 그리고 감지에 이르는 3가 지 부분이 핵심기술로서 이 기능들이 통합된 보다 정밀한 분석칩의 개발이 필요하다. 특히 감지부분에서 감지 시 그 날의 생성을 위한 형광을 비롯한 발색인자의 표식(labling)이 필요없는 비표식(nonlabeling) 감지기술이 핵심이다. 또 현재 고속 진단 킷으로는 감지가 불가능한 극저 농도 마커의 진 단을 위하여 고감도 나노 감지 프로토콜 구현 이외에도 미 량의 샘플 내에 마커 단백질을 농축함으로써 극미량의 타깃 생체물질을 정량분석이 가능하게 할 수도 있다. 또한 검출 하고자 하는 단백질의 특이적인 결합효율을 증가시키기 위 한 링커물질의 개발 역시 중요한 문제이다.

이번 원고에서는 나노진단/분석기 개발을 위하여 필요한 극미량의 혈액 내 단백질 분리 및 농축기술, 감지 기술 등 마이크로/나노기술을 기반으로 한 체액진단/분석기술을 소 개하고자 한다.

극미세 단백질 분리 및 농축기술

1. 마이크로/나노 채널을 이용한 단백질 분리와 농축

시료의 전처리는 체액 내의 병변과 관련된 단백질을 감지 해내는 바이오센싱에서 가장 큰 장애 중의 하나이다. 혈청 안에는 1백만 개 이상의 서로 다른 단백질이 존재하고 있다 고 알려져 있으며 10⁹배 이상의 서로 다른 농축 범위를 가 지고 있다. 이러한 생체시료의 분리를 위해 현재 2차원 젤- 전기영동법이 실험실에서 가장 널리 사용되고 있다.^2-6 그러 나 이러한 2차원 젤-전기영동법은 10-100 kD의 단백질에 분 석이 한정되어 있으며 로딩(loading)된 단백질 중 20%만을 가시화 할 수 있다. 액체에서의 여과 매질(polymeric gel) 주 변의 영향과 비특이적인 결합에 의하여 서로서로뿐만 아니 라 대부분의 검출 시스템과도 잘 융화되지 않는 등 젤 구조 나 hole (pore) 크기에 대한 정보가 적어 높은 처리량(through-

put)을 얻거나 효율성에 한계가 있다. 긴 분리 소요시간, 재 현 문제, 복잡한 과정 또한 문제점으로 다른 바이오센서와 의 통합 또한 어렵다. 수직나노필터(vertical nanofilter) 어레 이를 이용한 생체시료의 분리 방법은 이러한 문제점 없이 자유에너지 장벽의 높이와 분자 크기에 의존하는 원리를 이 용하여 크기에 따른 생체시료의 분리가 가능하다. 이 방법 은 기존의 전기영동법에서 사용하는 겔을 사용하지 않기 때 문에 주목을 받고 있다. Fig. 2는 300 nm의 챔버와 각 챔버 사이에 나노채널 크기를 조절하여 크기별로 생체물질을 분 리해낼 수 있는 원리를 이용한 실리콘식각 소자를 보여주며 이 일차원 나노필터를 이용하여 3종류의 SDS-protein과 dsDNA가 크기별로 시간에 따라 분리가 잘 이루어짐을 보 여준다. 그러나 이러한 1차원 나노필터 어레이는 전기장이 세어질수록 분리 효율이 떨어지는 문제점이 있고 또 연속적 인 유체에서 분리가 불가능하다. 이를 위하여 비등방적인 2 차원의 나노필터 어레이가 제안되었다. 이는 서로 다른 크 기의 분자를 서로 다른 궤적으로 이동시켜 분리함으로써 더 욱 효율적이며 높은 처리량(throughput) 성능 구현이 가능하 다.⁷ Fig. 3과 Fig. 4에 이와 같은 2차원 어레이 형태의 소자 의 원리와 x, y 두개의 방향에 걸리는 전압에 따라 분자 크 기에 따라 다른 궤적을 가지고 분리되는 모식도를 보여주고 있다. 이러한 향상된 2차원 나노필터 어레이로 높은 전기장 의 하(-400 V/cm)에서도 생체시료 분리가 가능하게 되었다.

그러나 평면(2차원) 나노유체 필터의 경우 차원의 조절은 아주 좋으나 원하는 만큼의 처리량을 내지 못한다. 여기서 대량의 병렬적인 나노유체 멤브레인 구조를 이용한 높은 유 량과 처리량을 얻고자 하는 연구가 필요하다.

2. 마이크로 비드를 이용한 분리와 농축

또 다른 방법의 농축 및 분리 방법은 마이크로비드를 이 용한 방법이다. 이 방법은 표면 개질을 통해 분리 농축해내 려고 하는 생체분자를 선택적으로 바인딩이 가능한 캡처 리 간드를 고정화하여 이용되며 일반 평면에 비하여 표면적이 넓어 생화학적인 반응과 농축이 유리한 장점을 이용한 것이 다. 이 방법은 바이오센서와의 연결을 통한 극미량의 타깃

Fig. 3. Schematic size dependent separation (flow angle variation as a function of molecule size) by changing electric fields of x and y direction.

Yoon DS, et al. Development of Micro/Nano Devices for Cancer Diagnosis 283

마커의 감지뿐 아니라 MALDI (matrix assisted loser desorp- tion/ionization)와 같은 기존의 분석장치와의 연결을 통하여 프로테옴의 분석에 이용될 수 있다. 이를 위하여 극복해야 할 중요 기술로 시료의 cleanup, target protein fishing-out, pre- concentration and enzymatic digestion을 하나의 칩 안으로 집 적하는 것이 매우 중요하다.^8,9 이 기술은 생체 단백질 혼합 물로부터 목표 단백질만을 분리해내고 농축하는 기술인 BAC (bead affinity chromatograpy)를 집적화하여 암 표지 단 백질의 분리, 정제, 농축 및 분석을 연속적으로 신속하게 수 행할 수 있는 질량분석 전처리용 칩으로 응용할 수 있다. 질 량 분석기를 통한 단백질 분석을 위해 1일 이상 걸리던 전처 리 시간을 1시간 이내로 줄여 신속한 분리와 검출이 가능해 졌다. 특정 단백질을 분리하거나 인식하기 위하여 그동안 분 자 인식체(리간드)로서 항체를 주로 이용하기도 하지만 항체 의 경우 제작 시간이 길고, 비용이 높으며 당이나 지질과 같 은 단백질 이외의 분자에 결합하는 항체를 제작하기 어렵기

때문에 보다 다양한 질병 표지 단백질에 대하여 인식 능력이 뛰어난 대체 물질로서 핵산 앱타머(aptamer)가 근래에 많은 조명을 받고 있으며 앱타머를 이용하여 BAC 칩을 이용한 농 축 및 분리에 적용하기 위한 연구도 진행되고 있다(Fig. 5).

이러한 BAC 칩에 사용하는 마이크로 비드는 비특이적인 단 백질 흡착이라는 단점이 있어 질병 진단과 분석에 부정확성을 초래할 수 있다. 따라서 이러한 비특이 흡착이 없고, 선택적인 단백질 농축이 용이한 코어-쉘 형태의 고성능 마이크로 비드 개발이 중요하며 두 종류의 폴리스티렌기반 마이크로 비드 (CutiCore, HiCore Resin)가 우수한 성능을 보임이 알려져 있으 며 마이크로 칩에 적용되어 뛰어난 성능을 보여 주고 있다.¹⁰

감지기술

체액을 이용한 병변 관련 극미량의 마커를 정량분석하기 위한 마이크로/나노진단기의 검출기기부분은 가장 핵심부 Fig. 4 Size dependent separation of 5 different molecules in continuous sample flow using 2 dimensional nano-filter device [dsDNA samples:1) 50 bp (15 nm), 2) 150 bp, 3) 300 bp, 4) 500 bp, and 5) 760 bp].

Fig. 5. Integrated micro BAC chip (left) and magnified view of compacted microbead in BAC chip (right).

BAC, bead affinity chromatogra- py.

284 대한소화기학회지: 제49권 제5호, 2007

분으로서 단백질 상호작용이 화학 반응과 단백질의 3차 구 조와 같은 여러 가지 요인에 의해서 결정되기 때문에 특이 반응을 이용하는 DNA 감지 분석에 비해 많은 어려움이 있 다. 따라서 유리나 금속 표면 위에 앱타머, 올리고핵산, 펩 타이드, 항체 등을 집적화시키고 형광분석방법, 질량분석방 법, AFM (Atonic Force Microscope) 분석방법, 그리고 SPR (surface plasmon resonance) 분석방법 등 다양한 기술을 이용 한 단백질 칩의 분석이 시도되고 있다. 가장 일반적으로 사 용되는 형광법의 경우 ELISA나 마이크로어레이와 같은 형

광 리더를 이용하여 감지 분석하는 방법과 산화환원 표지를 채용한 전기화학법 등이 주류를 이루고 있다. 그러나 이들 방법은 모두 형광이나 산화환원 표지와 같은 고가의 화학물 질을 이용하고 있어서 검사 단가가 상승하며 바이오처리 공 정이 복잡해지는 단점이 있다. 통상적으로 바이오공정의 단 계가 늘어날수록 검사 결과의 산포도가 증가하는 경향이 있 기 때문에 되도록 바이오공정을 간편화하는 것이 필요하다.

이와 같은 형광방법과는 달리 무표지 방식의 공진형 압전 캔틸레버 바이오센서는 기본적으로 표식이 필요 없는 장점

Fig. 6. Microcantilever based biosensor and calculated surface stress change of microcantilever from the measured primary and secondary resonance frequency before and after myoglobin binding (l-100 ng/mL) on the cantilever surface.

Fig. 7. Microfabricated Mach-Zehnder Interferometer Biosensor and assay result of straptavidin-biotin binding real time reaction.

윤대성 외 2인. 암 진단을 위한 마이크로/나노진단기기 개발 285

이 있다. 따라서 생분석(bioassay) 공정이 간편하며, 산포를 줄이는 데 용이하다. 공진방식의 캔틸레버의 경우는 캔틸레 버 구조(폭과 길이)와 크기를 자유로이 조절함으로써 바이 오물질의 감지 민감도를 획기적으로 낮출 수 있다. 이러한 공진형 마이크로캔틸레버를 이용하여 전립선암 특이 표지 자인 prostate specific antigen (PSA)를 10 pg/mL까지 감지하 는 것이 보고되었다.¹¹이와 같이 극 저농도의 바이오마커의 감지가 가능한 것은 반응된 바이오물질의 질량뿐만 아니라 바이오물질이 캔틸레버 표면에 반응하여 발생하는 표면응 력에 의해서도 공진주파수가 크게 변화하기 때문이다. 이와 같은 감지성능 해석을 위하여 기계역학적인 모델링을 통하 여 바이오반응 시 캔틸레버 표면에 발생하는 응력을 계산하 는데 세계 최초로 성공하였다.¹²1차 공진주파수 모드와 2차 공진주파수 모드에서 모두 훌륭하게 일치함으로써 모델링 이 정확함을 증명하였다(Fig. 6). 이 연구 성과는 향후 공진 형 캔틸레버의 응력해석에 많은 도움을 줄 것으로 기대한 다.

현재 무표지 센서로서 각광을 받고 있는 기술 중의 하나 는 SPR (surface plasmon resonance)이다. 이 기술은 투명기판 에 얇은 금속막을 코팅하여 빛을 입사하여 생성되는 eva- nescent field (EF)를 이용하여 생분석을 하는 기술이다. 바이 오 반응 시 이 EF에 의해서 유효 굴절률이 변화함으로써 발 생하는 반사각 혹은 반사광의 강도를 측정함으로서 바이오 에세이를 실시간으로 감지할 수 있는 기술이다. 물론 SPR은 무표지의 실시간 감지 방식이라는 강력한 장점은 있으나 빛 이 조사된 부분의 유효 굴절률에 의해서만 변화하기 때문에 검출 민감도가 비교적 낮은 단점이 있으며 이를 보완하기 위 하여 광도파로 소자기술을 채용하여 광도파로 바이오센서를 개발하려는 노력이 진행되고 있다. 광도파로는 기본적으로 코어를 통하여 광의 무한 도파가 가능하며 EF가 광도파로 표면을 따라서 형성되므로 바이오 물질에 의한 지속적인 위 상변화를 가능하게 한다. 이는 광도파로의 구조설계 및 바이 오 프로토콜의 안정화를 통하여 민감도를 대폭 증진시킬 수 있음을 의미한다. 현재 실리카 기판과 Si 기판을 이용하여 1 세대 박막형 마흐-젠터 간섭계의 연구가 이루어지고 있으며, 기초 생분석으로서 straptavidin-biotin 반응을 실시간으로 감 지하는 데 성공하였다(Fig. 7).¹³

결 론

나노바이오 및 MEMS 기술을 이용한 바이오메디컬 응용 연구는 소형화함으로써 최소 침습, 신속, 정확 및 대량의 정 보를 한꺼번에 처리할 수 있다는 장점으로 인하여 많은 관 심의 대상이 되어 왔다. 특히 혈액과 같은 체액을 이용하여, 조기진단이 필수적인 암과 같은 질환의 진단을 위한 진단

및 분석시스템의 경우 샘플의 공급, 전처리(분리, 농축 등), 이송, 감지에 이르기까지 하나의 칩에 모든 기능을 탑재하 려고 하는 시도가 있으며, 고속 컷 형태는 아니더라도 질병 과 같은 마커를 발굴하기 위한 고속 분석 시스템에 적용하 여 pico gram/mL 농도 이하의 고감도 감지시스템의 연구가 진행되고 있다. 또한 대형시스템의 분해능을 높이거나 연구 자의 손 대신에 자동화가 가능한 파이펫이 필요없는 칩 형 태로 적용을 위한 노력도 이어지고 있다.

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